Protokol, Amerikan hamamböceklerini incelemek için basit bir yol sağlar. Yaygın bir sıhhi haşere ve geleneksel Çin tıbbı için faydalı bir böcek. Belirli genleri yıkarak Amerikan hamamböceklerinin çoklu yaşam aktivitelerinin moleküler mekanizmalarını keşfetmeye yardımcı olacaktır.
Bu teknolojinin temel avantajı, Amerikan hamamböceğinde veya gen düzenleme için uygun olmayan diğer benzer böceklerde genleri yıkabilmesidir. Bu teknoloji, genetik ve epigenetik düzenleme, dokuların gelişim süreci, uzantıların yenilenmesi, çiftleşme davranışı ve Amerikan hamamböceğinin diğer ilginç tarafları gibi çeşitli alanları keşfetmek için kullanılabilir. Bu teknolojinin kullanımı kolay ve çok yönlüdür.
DSRA enjeksiyon tedavisi sırasında hayvanların sağlıklı tutulmasını öneriyoruz. Acemilerin birkaç uygulama seansından sonra bu teknikte kolayca ustalaşabileceğine inanıyorum. Başlamak için, taranmış nimfleri oothecae'den dört milimetrelik bir açıklık eleği ile ayırın.
Bir cam tüp ile beyaz taze malt P.americana seçin. P.americana'yı yeni kaplara yerleştirin ve tedavi için doğru aşamayı bekleyin. Reaksiyon sisteminde, 10 mikrolitre T7 2X tamponu, 2 mikrolitre T7 Express Enzim Karışımı ve iki mikrogram PCR ürünü ekleyin.
Son olarak, toplam hacmi çift damıtılmış su ile 20 mikrolitreye kadar yapın. Yavaşça baş aşağı manuel olarak karıştırın ve 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede, ardından 10 dakika boyunca 70 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Mikrolitre başına 4 mikrogram seyreltin RNaz DEPC suyu ile 1 ila 200 oranında bir çözelti.
Daha sonra sisteme mikrolitre RQ1 RNase Free Dnase başına 1 mikrolitre bir birim ve 1 mikrolitre seyreltilmiş RNase A çözeltisi ekleyin. 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra toplam sodyum asetat hacminin% 10'unu ve toplam izopropanol hacminin üç hacmini ekleyin.
Yavaşça baş aşağı manuel olarak karıştırın, ardından beş dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin ve 4 santigrat derecede 10 dakika boyunca 13.000 g'da santrifüj yapın. Süpernatantı bir pipetle çıkarın. Daha sonra, kalıntıyı% 75 etanolle,% 25 DEPC ile arıtılmış suyla yıkayın, ardından 4 santigrat derecede 5 dakika boyunca 13.000 g'da santrifüj yapın.
Süpernatantı tekrar çıkarın, peleti oda sıcaklığında 15 dakika boyunca hava ile kurulayın. Daha sonra çift sarmallı RNA'yı yaklaşık 100 mikrolitre DEPC suyu ile çözün ve mikrolitre başına 2 mikrogramlık son konsantrasyona kadar seyreltin. Her enjeksiyonun hacminin tutarlı olmasını sağlamak için programı mikroenjeksiyon pompasında ayarlayın.
Daha sonra şırıngayı 8 ila 10 kez DEPC suyuyla doldurarak temizleyin. 10 mikrolitrelik şırıngayı mikro enjeksiyon pompasına takın. Ardından pompayı çalıştırın ve şırıngayı 10 mikrolitre çift sarmallı RNA çözeltisi ile doldurun.
Hamamböceklerini karbondioksit ile uyuşturun, sonra cımbızla yavaşça alın ve hamamböceğini iğneye doğru elle iletin. Daha sonra, iğneyi epidermise karşı yatay olarak iki karın somiti arasındaki boşluktan yerleştirin. Çift sarmallı RNA çözeltisini hamamböceğine enjekte edin, iç organlara zarar vermemek için iğne ucunun epidermise mümkün olduğunca yakın olmasını sağlayın.
Son olarak, iğne ucunu çekin. Enjekte edilen hamamböceklerini temiz biyotahlil kaplarına koyun. Karbondioksitin etkilerinden kurtulmalarını sağlamak için yaklaşık 10 ila 20 dakika bekleyin.
Kapları enjeksiyon tarihi, çift sarmallı RNA'nın tipi ve dozu ve P.americana'nın yaşı ile etiketleyin. Çift sarmallı RNA enjeksiyonu ve hayvanlarda hedefi olmayan dsMocK negatif kontrol olarak alındıktan sonra maltlanmış hamamböceklerinin fenotipini gözlemlemek için Ddc veya DOPA dekarboksilaz ve Dpp veya dekapentaplejik genler iki örnek olarak seçilmiştir. RNAi etkinliği qRT PCR ile tespit edildi.
Genler, dsDdc için 0.01'den az ve dsDpp için 0.05'ten düşük bir P değeri ile önemli ölçüde parçalandı. Ddc genlerini nakavt eden P.americana, tıkanmış melanizasyon nedeniyle beyaz epidermise sahipti. dsDpp enjeksiyonları ile yapılan deneyde, RNAi uzuv rejenerasyonunu bozdu.
Böcekler sağlıklı olmalı ve zarar vermeden enjekte edilmelidir. Bu teknoloji, Amerikan hamamböceği gibi gen düzenlenemeyen böcekler için gen fonksiyonlarını keşfetmenin basit bir yolunu sunar.
