Januschke laboratuvarındaki çalışmalar Wellcome trust grants 100031/Z/12/A ve 1000032/Z/12/A tarafından desteklenmektedir. Doku görüntüleme tesisi Wellcome'dan WT101468 hibesi ile desteklenmektedir.

<ol>
	<li>Restrepo, S., Zartman, J. J., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+and+live+imaging+of+Drosophila+imaginal+discs.">Cultivation and live imaging of Drosophila imaginal discs.</a> Methods in Molecular Biology. 11478, 203-213 (2016).</li><li>Tsao, C. K., Ku, H. Y., Lee, Y. M., Huang, Y. F., Sun, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+term+ex+vivo+culture+and+live+imaging+of+Drosophila+larval+imaginal+discs.">Long term ex vivo culture and live imaging of Drosophila larval imaginal discs.</a> PloS One. 11 (9), 0163744 (2016).</li><li>Cabernard, C., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical/basal+spindle+orientation+is+required+for+neuroblast+homeostasis+and+neuronal+differentiation+in+Drosophila.">Apical/basal spindle orientation is required for neuroblast homeostasis and neuronal differentiation in Drosophila.</a> Developmental Cell. 17 (1), 134-141 (2009).</li><li>Basto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flies+without+centrioles.">Flies without centrioles.</a> Cell. 125 (7), 1375-1386 (2006).</li><li>Januschke, J., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interphase+microtubule+aster+is+a+determinant+of+asymmetric+division+orientation+in+Drosophila+neuroblasts.">The interphase microtubule aster is a determinant of asymmetric division orientation in Drosophila neuroblasts.</a> The Journal of Cell Biology. 188 (5), 693-706 (2010).</li><li>Rusan, N. M., Peifer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+a+novel+centrosome+cycle+in+asymmetric+cell+division.">A role for a novel centrosome cycle in asymmetric cell division.</a> Journal of Cell Biology. 177 (1), 13-20 (2007).</li><li>Dai, W., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+border+cell+migration+in+Drosophila.">Live imaging of border cell migration in Drosophila.</a> Methods in Molecular Biology. 1407, 153-168 (2016).</li><li>Haigo, S. L., Bilder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+tissue+revolutions+in+a+morphogenetic+movement+controlling+elongation.">Global tissue revolutions in a morphogenetic movement controlling elongation.</a> Science. 331 (6020), 1071-1074 (2011).</li><li>Tissot, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+molecular+cues+ensure+a+robust+microtubule-dependent+nuclear+positioning+in+the+Drosophila+oocyte.">Distinct molecular cues ensure a robust microtubule-dependent nuclear positioning in the Drosophila oocyte.</a> Nature Communications. 8, 15168 (2017).</li><li>Martin, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+live+imaging+of+the+Drosophila+adult+midgut+reveals+real-time+dynamics+of+division,+differentiation+and+loss.">Long-term live imaging of the Drosophila adult midgut reveals real-time dynamics of division, differentiation and loss.</a> eLife. , (2018).</li><li>Cabernard, C., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+neuroblast+lineages+within+intact+larval+brains+in+Drosophila.">Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), 970-977 (2013).</li><li>Sabado, V., Nagoshi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+resolution+fluorescence+live+imaging+of+Drosophila+circadian+clocks+in+larval+brain+culture.">Single-cell resolution fluorescence live imaging of Drosophila circadian clocks in larval brain culture.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), (2018).</li><li>Lerit, D. A., Plevock, K. M., Rusan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+Drosophila+larval+neuroblasts.">Live imaging of Drosophila larval neuroblasts.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), (2014).</li><li>Egger, B., van Giesen, L., Moraru, M., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+imaging+of+primary+neural+cell+culture+from+Drosophila.">In vitro imaging of primary neural cell culture from Drosophila.</a> Nature Protocols. 8 (5), 958-965 (2013).</li><li>Homem, C. C., Reichardt, I., Berger, C., Lendl, T., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+live+cell+imaging+and+automated+4D+analysis+of+drosophila+neuroblast+lineages.">Long-term live cell imaging and automated 4D analysis of drosophila neuroblast lineages.</a> PloS One. 8 (11), 79588 (2013).</li><li>Forer, A., Pickett-Heaps, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochalasin+D+and+latrunculin+affect+chromosome+behaviour+during+meiosis+in+crane-fly+spermatocytes.">Cytochalasin D and latrunculin affect chromosome behaviour during meiosis in crane-fly spermatocytes.</a> Chromosome Research: An iIternational Journal On the Molecular, Supramolecular and Evolutionary Aspects of Chromosome Biology. 6 (7), 533-549 (1998).</li><li>Pampalona, J., Januschke, J., Sampaio, P., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+recording+of+centrosomes+and+other+organelles+in+Drosophila+neuroblasts.">Time-lapse recording of centrosomes and other organelles in Drosophila neuroblasts.</a> Methods in Cell Biology. 129, 301-315 (2015).</li><li>Ramat, A., Hannaford, M., Januschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+miranda+localization+in+Drosophila+neuroblasts+involves+interaction+with+the+cognate+mRNA.">Maintenance of miranda localization in Drosophila neuroblasts involves interaction with the cognate mRNA.</a> Current Biology: CB. 27 (14), 2101-2111 (2017).</li><li>Rebollo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionally+unequal+centrosomes+drive+spindle+orientation+in+asymmetrically+dividing+drosophila+neural+stem+cells.">Functionally unequal centrosomes drive spindle orientation in asymmetrically dividing drosophila neural stem cells.</a> Developmental Cell. 12 (3), 467-474 (2007).</li><li>Hannaford, M. R., Ramat, A., Loyer, N., Januschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=aPKC-mediated+displacement+and+actomyosin-mediated+retention+polarize+Miranda+in+Drosophila+neuroblasts.">aPKC-mediated displacement and actomyosin-mediated retention polarize Miranda in Drosophila neuroblasts.</a> eLife. 7, 166 (2018).</li><li>Hannaford, M., Loyer, N., Tonelli, F., Zoltner, M., Januschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical-genetics+approach+to+study+the+role+of+atypical+Protein+Kinase+C+in+Drosophila.">A chemical-genetics approach to study the role of atypical Protein Kinase C in Drosophila.</a> Development. 146 (2), (2019).</li><li>Loyer, N., Januschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+last-born+daughter+cell+contributes+to+division+orientation+of+Drosophila+larval+neuroblasts.">The last-born daughter cell contributes to division orientation of Drosophila larval neuroblasts.</a> Nature Communications. 9 (1), 3745 (2018).</li><li>Wilcockson, S. G., Ashe, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+ovarian+germline+stem+cell+cytocensor+projections+dynamically+receive+and+attenuate+BMP+signaling.">Drosophila ovarian germline stem cell cytocensor projections dynamically receive and attenuate BMP signaling.</a> Developmental Cell. 50 (3), 296-312 (2019).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity.">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).</li><li>Prasad, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+of+border+cell+migration+analyzed+using+time-lapse+live-cell+imaging.">Cellular and molecular mechanisms of border cell migration analyzed using time-lapse live-cell imaging.</a> Developmental Cell. 12 (6), 997-1005 (2007).</li><li>Chernysh, I. N., Nagaswami, C., Purohit, P. K., Weisel, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin+clots+are+equilibrium+polymers+that+can+be+remodeled+without+proteolytic+digestion.">Fibrin clots are equilibrium polymers that can be remodeled without proteolytic digestion.</a> Scientific Reports. 2, 879 (2012).</li><li>Liss, V., Barlag, B., Nietschke, M., Hensel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-labelling+enzymes+as+universal+tags+for+fluorescence+microscopy,+super-resolution+microscopy+and+electron+microscopy.">Self-labelling enzymes as universal tags for fluorescence microscopy, super-resolution microscopy and electron microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 17740 (2015).</li><li>. ImageJ macros [software] Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/nicolasloyer?tab=repositories">https://github.com/nicolasloyer?tab=repositories</a> (2020)</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Tüm D. melanogaster larva beyinlerinin canlı görüntülenmesi, fizyolojik bir bağlama yakın koşullarda asimetrik nöral kök hücre bölünmelerini gözlemleme fırsatı sağlar. Protokolümüzün ilk bölümü larva beyinlerinin diseksiyonu konusundaki yaklaşımımızı tanıtıyor. Daha önce belirtildiği gibi13Hazırlığın kritik bir yönü beyne zarar vermekten kaçınmaktır. Bunun en zorlu yanı, beyni aşırı çekmeden komşu hayal disklerinden ayırmaktır. "Çekmeden kesmeye" yaklaşımımız, bir çift tokanın uçlarıyla bir taşlama hareketi yapmak veya dokular arasındaki bağlantıyı tutan diğer ikips ucu boyunca bir tokmak ucu kaydırmaktır (Şekil 1A) oysa Lerit ve ark. bir diseksiyon pimi ile testere benzeri hareketleri tanımlar. Deneyciye tüm yaklaşımları denemesini ve kendileri için en uygun olanı benimsemesini tavsiye ediyoruz. Ayrıca izole edilmiş beyinleri aktarmak için diseksiyon araçları yerine BSA veya FCS kaplı pipet uçları kullanmanızı öneririz. Kaplama, dokuların plastiğe yapışmasını önler ve dokuların güvenli bir şekilde aktarılmasını sağlarken, aktarım sırasında diseksiyon aracına yapıştıkları için olası bir geçici deformasyona maruz bırakmadan her zaman tamamen daldırmalarını sağlar. Kaplanmış uçlar, aynı anda birkaç beynin transferine izin vermek için başka avantajlara sahiptir, bu da örneklerin belirli bir ortamdaki ikamet süresini kontrol etmek için kritik olduğunda özellikle yararlıdır; diğer dokuların, hatta kırılgan olanların, örneğin yağ kütlelerinin transferi için uygundurlar; daha büyük uçlar kullanarak veya ucun ekstremitesini keserek çok çeşitli farklı numune boyutlarına uyum sağlayabilirler.
Daha sonra, bu protokol, bir kültür yemeğinin kapaklarında larva beyinlerini hareketsiz hale getirmek için Fibrinojen pıhtılaşmasının kullanımını açıklar. Bir beyin bir damla kültür ortamı + Fibrinojen içinde yönlendirilir, daha sonra Trombin ilavesi ile pıhtılaşma indüklendi. Fibrin oluşumu kademelidir ve gerekirse numunenin yönünün ince ayarlanabileceği bir zaman aralığı sağlar (Şekil 2C). Örneğin hafif bir sıkıştırması gerekiyorsa - larva beyinleri durumunda karşı tavsiye ettiğimiz - ayrıca 3.4.4 ve 3.5.2 adımları sırasında pıhtıya az çok numuneye yakın bastırılarak ince bir şekilde ayarlanabilir. Bu Fibrinojen pıhtılaşmasının, beyinlerin gaz geçirgen bir zar ve bir kapak kılıfı arasına monte edildiği Lerit ve ark.'da açıklanan protokole göre pıhtılaşmasının ana avantajı, canlı görüntüleme sırasında kültür ortamını değiştirme yeteneğidir. Protokolümüz üzerinde gaz geçirgen bir membran kullanmanın olası bir avantajı, beyinler pıhtı ve bazı ortamlar tarafından havadan ayrıldığı için yaklaşımımızla daha sınırlı olabilecek numunelerin optimal bir oksijenlenmesini sağlaması olabilir. Bu nedenle, kültür çanağı içindeki kültür ortamı miktarının etkisini değerlendirmemiş olsak da, pıhtıları tamamen daldırırken pıhtıların üstündeki kültür ortamı miktarını sınırlamayı öneriyoruz.
Pıhtıların manipülasyonu deneysel olarak zor ve zaman alıcı olabileceğinden, deneycinin ilk olarak pıhtıları örneksiz manipüle etmeyi uygulamasını öneririz. Kapakta kültür ortamı + Fibrinojen damlasının hacminin modüle edilmesi, Fibrinojen konsantrasyonu veya Trombin hacmi ve konsantrasyonu, hazırlığı kolaylaştırmaya yardımcı olabilir ve protokolü diğer doku türlerine uyarlarken önemli olabilir. Pıhtıları manipüle etme konusunda yeterli deneyime sahip olan birkaç beyin, gerekirse bir pıhtıda hareketsiz hale getirilebilir, ancak oryantasyonun ince ayarını zorlaştırır. Kapakta birkaç pıhtı oluşabilir, örneğin farklı genotiplerin görüntü örneklerine izin verir. Aynı kapak üzerindeki farklı pıhtıları farklı kültür ortamlarına maruz bırakmak da mümkündür, ancak farklı pıhtıları kaplayan kültür ortamı damlalarını asla karıştırmamaya özen gösterilmelidir. Larva beyinleri hareketsiz hale geldikten ve canlı görüntülemeye hazır hale geldikten sonra, aşırı fotodamajdan kaçınmak içinLerit ve ark. Bu önerilere sadece bir sahne inkübatörü ile canlı görüntüleme sırasında beyinleri 25 °C'de tutmak için değil, aynı zamanda görüntüleme başlamadan önce bu aşamayı en az 30 dakika önceden ısıtmak için de ekliyoruz. Elimizde, bunu sistematik olarak yapmamak güçlü bir odak kaymasına neden olur.
İlişkili mikroskopi yapabilmek ve canlı görüntülemeden sonra bir örneği düzeltebilmek ve immün yetisini düzeltmek bazı bağlamlarda avantajlı olabilir. Bununla birlikte, Fibrin pıhtılarını kullanmanın bir sınırlaması, bir beyni zarar vermeden bir pıhtıdan mekanik olarak izole etmenin neredeyse imkansız olmasıdır. Bu sınırlamayı aşmanın olası bir yolu, Plasmin ile Fibrin pıhtılarını bozmak veya Fibrin polimerizasyonuna izin vermek için düğmeleri taklit eden bir peptit eklenerek pıhtı sökülmesine neden olacak yöntemler geliştirmek olabilir28. Fibrin pıhtılarını tipik olarak tek hücreden 200 μM uzun dokuya kadar değişen örneklerde kullanırız, ancak 3 mm genişliğindeki yetişkin bombus arılarından pıhtılarda ve görüntü beyinlerinde de başarılı bir şekilde hareketsiz hale gelebiliriz. Pıhtılarda hareketsiz hale getirilebilen numune boyutunun üst sınırı belirlenmeye devam etmektedir. Benzer şekilde, genellikle hareketsiz örnekleri 4 ila 5 saat boyunca görüntülesek de, nöroblastları birincil kültürde 3 güne kadar başarıyla görüntüledik, bu da pıhtının en azından daha uzun süreli canlılığa engel olmadığını gösteriyor. Aksine, pıhtılar, bu amaç için peristaltik pompalar gibi cihazlara ihtiyaç duymadan, daha uzun süreli görüntüleme için bir gereklilik olan ortamın düzenli olarak değiştirilmesini kolaylaştırabilir. Fibrin pıhtılarının geçirgenlik parametrelerini ölçmemiş olsak da, pıhtıların lifli jel benzeri doğası hücre geçirgen molekülleri tarafından penetrable gibi görünmektedir. Latrunculin A, Colcemid veya 1-NAPP1, HALO etiketli ligandların ve hücre biyolojisinde kullanılan diğer standart boyaların fibrin pıhtısındaki hücrelere sorunsuz bir şekilde ulaştığını ve şimdiye kadar pıhtı tarafından tutulacak moleküllerle karşılaşmadığını, bunun da ampirik olarak test edilmesi gereken bir olasılık olduğunu bulduk.
Sonuç olarak, Fibrin pıhtılarının kullanılması, canlı görüntüleme için canlı dokuları hareketsiz hale getirmek için güvenilir ve nispeten kolay bir uygulama yolu sağlar. Yanal sürüklenmeyi sınırlamadaki kullanışlılığının ötesinde, canlı görüntüleme sırasında kültür ortamını değiştirme yeteneği, D. melanogaster nöroblastlarının asimetrik hücre bölümünü incelemeye yönelik kimyasal genetik yaklaşımımız için paha biçilmez olduğunu kanıtlamıştır21. Bu tekniğin, özellikle kimyasal genetik veya örneğin protein kendi kendini etiketleme29içeriyorsa, çok çeşitli farklı dokulardaki çalışmalara faydalı olacağını öngörüyoruz.
MultiHyperStackReg makromuz, ardışık çerçeveleri veya yığın dilimlerini hizalayan TurboReg ImageJ eklentisine ve dönüşümleri diğer yığınlara uygulamaya izin veren MultiStackReg ImageJ eklentisine dayanır. MultiHyperStackReg, bu dönüşümleri hipertacklara (en az dört boyutlu yığınlar) uygulamak için izin verir. MultiHyperStackReg kullanımı, açıkladığımız gibi, çok fazla eylem gerektirir ve oldukça zaman alabilir, ayrıca 6.2 ve 6.3 adımlarında açıklanan tüm adımları otomatik olarak gerçekleştiren AutoHyperStackReg makrosunu yazdık. Ancak, MultiHyperStackReg aksine, AutoHyperStackReg şu anda bu yığının bir alt bölgeye dayalı bir yığının hizalamasını hesaplama imkanından yoksundur, bulduğumuz bir seçenek bazen tatmin edici bir hizalama için çok önemlidir. AutoHyperStackReg'in başka bir sınırlaması, kullanımının TurboReg ve MultiStackReg tarafından önerilen diğer dönüşümlerle değil, çevirilerle sınırlı olmasıdır, oysa MultiHyperStackReg, kullanıcının ihtiyaç duyması durumunda herhangi bir dönüştürme türüne bir hiperstack için geçerli olabilir. Gelecekteki sürümler bu işlevleri uygulayacak ve GitHub30. Son olarak, dönen linescan makromuz, korteks zaman içinde konumunu veya yönünü değiştirse bile, kortikal sinyalleri zaman atlamalarında hızlı bir şekilde ölçmenin kolay bir yolunu sağlar. İzleme modunun veya takip etmeme modunun analiz için en uygun olup olmadığı kortikal sinyalin kalitesine ve tutarlılığına bağlıdır. Kullanıcının her zaman noktası için korteksin nerede olacağını düşünmesi gerekmediğinden ve zaman içinde büyük konum ve yönelim değişikliklerine uyum sağlayabildiğinden, izleme modunun kullanımı daha kolaydır. Bununla birlikte, kortikal sinyal tüm film boyunca algılama için yeterince güçlü kalırsa uygundur: korteksten başka bir şeyin algılanmaması (örneğin, kortekse yakın parlak bir sitoplazmik bölme) aşağıdaki her zaman noktası için algılamayı tehlikeye atabilir (örneğin, sitoplazmik bölme korteksten uzaklaşır ve kortikal çizgiler onu geri kalan süre boyunca takip edebilir). Algılama, kullanıcı tarafından başlangıçta çizilen çizgiyle sınırlı olduğundan (örneğin, parlak bir sitoplazmik bölme algılamanın birkaç zaman noktası için başarısız olmasına neden olabilir, ancak sitoplazmik bölme algılama bölgesinden uzaklaştıkça, korteksin doğru tespiti devam ederse) bu tuzak yoktur, ancak korteks konumu veya oryantasyonu zaman içinde çok değişirse iyi davranmaz. İzleme modu için geliştirilecek bir sonraki özellik (GitHub30'damevcut olacak), yalnızca belirtilen zaman noktalarını analiz etme ve algılamanın gerçekleştirileceği ve daha sonra kullanıcının en azından sorunlu zaman noktalarından kaçınmasını sağlayacak bir referans zaman noktası (ilk zaman noktası yerine) tanımlama seçeneği olacaktır.

Drosophila, çok çeşitli biyolojik soruları incelemek için önemli bir model sistemi olmaya devam ediyor ve onlarca yıldır birçok disiplinde bilginin ilerletilmesinde başarılı oldu. Özellikle öne çıkmasını sağlayan bir özellik, özellikle canlı görüntüleme için çok uygun olmasıdır. Hücre altı süreçleri veya hücre ve dokuların davranışlarını gerçek zamanlı olarak izleme yeteneği, hücre ve gelişim biyolojisi ile ilgili temel kavramların üretilmesine katkıda bulunmaya devam eder. Bu tür Drosophila örneklerini canlı ve sağlıklı tutmak için farklı gruplar tarafından birçok başarılı protokol geliştirilmiştir. Hayal diskleri 1 ,2, larva beyni3,4,5,6veya yetişkin dişilerin yumurta odaları 7 ,8,9veya yetişkin bağırsak10 gibi sinekten organlar ve dokular çıkarılabilir ve zaman atlamalı mikroskopi ile görüntüleme için kültürde tutulabilir. Canlı görüntüleme için önemli bir zorluk, numunenin mekanik darbelere duyarlı olabilecek numune bütünlüğünden ödün vermeden optimum çözünürlük ve hareketsizlik için görüntüleme yüzeyine yakın tutulmasını sağlamaktır. Drosophila larva beynindeki nöroblastlar veya nöronlar olarak adlandırılan nöral kök hücreleri incelemek için, örneğin, örneklerin görüntüleme yüzeyine yakın tutulması, mühürlü görüntüleme odalarında kültür ortamı ile kaplanarak elde edilebilir11,12,13. Bununla birlikte, bu yaklaşım medya değişimine kolayca izin vermez, böylece manevra için deneysel alanı sınırlar. Alternatif olarak, numuneler hazırlanabilir ve hücrelerin yapışıklıklarını artırmak ve açık kültür yemeklerinde çok noktalı ziyaret mikroskopisine ve genişletilmiş canlı hücre görüntülemesine izin vermek için tedavi edilen kapaklara yerlenebilir, potansiyel olarak medya değişimine izin verir, ancak medya değişimi sırasında örnek sürüklenmesini veya kaybını önlemek için kolay araçlar sağlamaz14,15.
Fibrin pıhtı yöntemi başlangıçta canlı vinç-sinek spermatositleri16 meiosis incelemek için geliştirilmiştir bu sorunların üstesinden gelmek için özel olarak uygundur. Fibrinojen ilgili kültür ortamında çözülür, Thrombin eklenmeden önce bu çözeltinin bir damlasına yerleştirilen ve yönlendirilen numuneler, çözünmeyen bir Fibrin pıhtısının, cam yüzeye yapışan yapışkan lifli bir ağın ve numunelerin kültür ortamına erişimini sağlarken hızlı bir şekilde oluşmasına neden olur. Ortam daha sonra pıhtı veya numune pozisyonuna zarar vermeden değiştirilebilir. Görüntüleme sırasında kültür ortamı değişimi, örneğin, inhibitörlerin orijinal yöntemde olduğu gibi eklenmesi veya yıkama veya nabız kovalama deneyleri için veya hücreleri ve dokuları yerinde tutarken canlı hücre görüntüleme sırasında floresan boyaların eklenmesi gerektiğinde arzu edilir. Fibrin pıhtıları Drosophila dokularının yanı sıra bireysel hücrelerin görüntülenmesi için uygundur13,17. Fibrin pıhtıları, şekilleri veya diğer özellikleri nedeniyle normalde Fibrin pıhtısı içindeki örnek konumunu ve pıhtının şeklini modüle ederek istenen şekilde yönlendirilmeyecek olan örnekleri yönlendirmeye yardımcı olmak için daha fazla kullanılabilir.
Burada mevcut Fibrin pıhtı bazlı görüntüleme yöntemlerimiz hakkında bir güncelleme sunuyoruz ve segmentasyon tabanlı görüntü analizi için araçlar sağlıyoruz ve gelişmekte olan sinek beynindeki nöroblast bölünmelerini incelemek için bu yöntemin kullanımına odaklanıyoruz. Aynı kültür çanağındaki farklı pıhtılarda birden fazla örneği takip etmek için rutin olarak Fibrin pıhtı yöntemini kullanıyoruz. Bu, i) merkezkant davranış veya mRNA lokalizasyonu canlı18,19gibi hücre altı olayların görüntülenmesini sağlar, ii) çok noktalı ziyaret kullanarak aynı görüntüleme ayarları altında farklı genotiplerin farmakolojik tedavisi üzerine örneklerin davranışını izlemek mikroskopi20, iii) enzimlerin akut inhibisyonunun etkilerinin incelenmesi21 ve iv) hedeflenen lazer-ablasyon üzerine hücrelerin fizyolojik ortamlarındaki hücre bölünmesinin yöneliminde meydana gelen değişiklikleri incelemek için sürüklenmeyi en aza indirmek22. Trombin ve Fibrinojen ve Fibrin pıhtısının istenmeyen etkilerinin her örnek için ampirik olarak test edilmesi gerekirken, Bu yöntem prensip olarak canlı hücre görüntüleme ile analiz edilecek her türlü örneği hareketsiz hale getirmek için uygundur ve Drosophila'da nöroblast biyolojisinin5,19,2'ninbirden fazla yönünü incelemek için başarıyla kullanılmıştır. 0 , aynı zamanda kadın mikrop hattı kök hücrelerinin sitosensör projeksiyonlarının dinamikleri23 ve Drosophila dişi yumurta odalarının folikül hücrelerinin akut aPKC inhibisyonu üzerine polaritedeki değişiklikler21.
Zaman atlamalı floresan görüntüleme, bu nicel bilgileri ayıklamak için yöntemler gerektiren karmaşık zaman çözümlenmiş 3D veri kümelerinin üretilmesiyle sonuçlanır. Burada, Drosophila larva beyinlerinin nöroblastlarında veya birincil hücre kültüründeki bireysel nöroblastlarda kortikal proteinleri ölçmek için geliştirilen hücre korteksinde çok kanallı floresanların yarı otomatik olarak ölçülmesine izin veren hiperstacks ve özel yapım ImageJ makrolarında sürüklenmeyi düzeltmek için kullanılabilecek ImageJ tabanlı24 makronun daha da geliştirilmesini açıklıyoruz.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Albumin bovine serum, BSA</td>
			<td>Merck</td>
			<td>5470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #55 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovie Serum, suitable for cell culture</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen from human plasma</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F3879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroDish Cell Culture Dish - 35mm, 23 mm well</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>FD35-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PP1 Analog (1NA-PP1)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>529579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex spot plate with nine depressions</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS722085-18EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#39;s Insect Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin from bovine plasma</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T4648</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

applications of immobilization of drosophila tissues with fibrin clots for live imaging

Drosophila, çok çeşitli biyolojik soruları incelemek için önemli bir model sistemidir. Sineğin farklı gelişim evrelerinden gelen imaginal diskler, yetişkin dişilerin larva beyni veya yumurta odaları veya yetişkin bağırsağı gibi çeşitli organ ve dokular çıkarılabilir ve zaman atlamalı mikroskopi ile görüntüleme için kültürde tutulabilir, bu da hücre ve gelişim biyolojisi hakkında değerli içgörüler sağlar. Burada, Drosophila larva beyinlerinin diseksiyonu için mevcut protokolümüzü ayrıntılı olarak açıklıyoruz ve daha sonra Fibrin pıhtılarını kullanarak larva beyinlerini ve diğer dokuları bir cam örtü üzerinde hareketsizleştirmek ve yönlendirmek için mevcut yaklaşımımızı sunuyoruz. Bu hareketsizleştirme yöntemi sadece Fibrinojen ve Trombin'in kültür ortamına eklenmesini gerektirir. Aynı kültür çanağındaki birden fazla numunenin ters mikroskoplarında yüksek çözünürlüklü zaman atlamalı görüntüleme için uygundur, çok noktalı ziyaret mikroskopisinde mikroskop aşamasının hareketlerinden kaynaklanan yanal sürüklenmeyi en aza indirir ve görüntüleme sırasında reaktiflerin eklenmesini ve çıkarılmasını sağlar. Ayrıca, sürüklenmeyi düzeltmek ve zaman atlamalı analizden belirli nicel bilgileri ayıklamak ve işlemek için rutin olarak kullandığımız özel yapım makrolar sunuyoruz.

Drosophila dokularının Fibrin pıhtıları ile hareketsiz hale getirilmesi ve canlı görüntüleme sırasında kültür ortamı değişimi. Adım 2 ' de sunulan prosedürü takiben parçalandıktan sonra (Şekil 1) ve adım 3 ' te sunulan prosedürü takiben aynı kapaktaki Fibrin pıhtılarında hareketsiz hale geldikten sonra (Şekil 2), GFP etiketli Bazukayı (Baz::GFP) ifade eden larva beyinleri, polarite proteini Par-3'ün sinek ortezi, zaman atlamalı çok konumlu konfokal görüntülemede 30 dakika boyunca görüntülenmiştir. Baz::GFP, küçük ATP analogu 1-NAPP120'nineklenmesiyle atipik protein kinaz C'nin (aPKC) akut inhibisyonunu sağlayan bir alele olan apkcas4ile birleştirilir. 1-NAPP1 bu nedenle 4. Kinaz aPKC'nin vahşi tip bir versiyonunu taşıyan kontrol beyinleri ATP analoguna tepki vermemişken, ek olarak aPKC'nin(apkcas4) analoga duyarlı bir mutasyonu taşıyan beyinler, nöroblastlarda ve soylarında Baz'ın nöroepithelium ve parlak kümelerinde bir kasılma gösterdi (Şekil 6, Video 1). Nöroblastlar zaman atlamalı boyunca bölünmeye devam eder, bu da dokunun sağlıklı kaldığını gösterir ve beyinler kültür orta değişimine rağmen çok az sürüklenme gösterir, bu da iyi hareketsiz olduklarını gösterir. Benzer şekilde,27'de sunulan prosedürü takiben parçalandıktan sonra, Baz::GFP ifade eden ovarioles aynı kapak üzerindeki Fibrin pıhtılarında hareketsiz hale getirildi ve 8 dakika boyunca görüntülendi, daha sonra 1-NAPP1 uygulaması apkcas4 mutant foliküler hücrelerin kasılmasına neden oldu, ancak kontrollerin değil (Şekil 7, Video 2).
MultiHyperstackReg kullanılarak yanal ve odak sürüklenmesinin düzeltilmesi. Hem yanal hem de netleme sürüklenmesini gösteren bir hiperstack(Video 3, sol panel) önce yanal sürüklenme için düzeltildi (adım 6.2, Şekil 3, Video 3, orta panel), daha sonra MultiStackReg eklentisi ve MultiHyperstackReg makrosu kullanılarak odak kayması (adım 6.3, Şekil 4, Video 3 , sağ panel) orijinal hiperstack'te gözlenen hareketlerin önemli ölçüde azalmasına neden oldu.
Dönen hatlar kullanılarak kortikal sinyal ölçümü Baz::GFP (yeşil) ve kızılötesi floresan protein (CD4::mIFP, kırmızı) ile etiketlenmiş transmembran protein CD4'ü ifade eden bir nöroblast bir mitoz sırasında görüntülendi. CD4::mIFP sinyali, nöroblastın çeşitli bölgelerindeki korteksi lineskanlarla (adım 7, Şekil 5, Şekil 8A–C)tespit etmek için referans olarak kullanıldı ve Baz::GFP sinyali tespit edilen konumlarda ölçüldü Şekil 8D). Bölünmeleri sırasında, nöroblastlar farklı ve zıt kortikal alanlar oluşturarak geçici olarak polarize oldular: apikal kutup ve bazal kutup. Baz, apikal kutbu tanımlar ve sürekli olarak, Baz::GFP sinyali nöroblastın apikal kutbunda arttı ve bölme sırasında bazal kutupta azaldı (Şekil 8C,D). Korteksin konumu zaman atlamalı boyunca tatmin edici bir şekilde izlendi (Şekil 8C, Video 4). Drosophila çizgileri ve genotipleri Ek Tablo 1–2'debaşvurulmaktadır.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61954/61954fig06.jpg"> Şekil 6: Canlı görüntüleme sırasında hareketsiz larva beyinlerine ATP analogunun uygulanması. (A) Baz::GFP'yi ifade eden iki larva beyninin canlı görüntülenmesi aynı kapakta hareketsiz hale getirilir. Kültür ortamı, 0 dakikada 10 μM ATP analogu 1-NAPP1 konsantrasyonuna değiştirilir. Kontrol beyinleri ATP analoguna gözle görülür şekilde tepki vermezken, aPKC'nin(aPKCAS4)analog hassas mutasyonu taşıyan beyinler nöroblastlarda ve soylarında nöroepithelium (ok uçları) ve parlak Baz kümelerinin daralmasını gösterir. 23 μM derinlik için 33 dilimin maksimum yoğunluk projeksiyonu Ölçek çubuğu: 20 μM. (B) Nöroepithelium büyütme. Ölçek çubuğu: 10 μM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61954/61954fig06large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61954/61954fig07.jpg"> Şekil 7: Canlı görüntüleme sırasında hareketsiz yumurta odalarına ATP analogunun uygulanması. Baz::GFP'yi aynı kapak kapağında hareketsiz olarak ifade eden iki yumurta boyunun canlı görüntülenmesi. Kültür ortamı, 0 dakikada 10 μM ATP analogu 1-NAPP1 konsantrasyonuna değiştirilir. Kontrol yumurtası odaları ATP analoguna gözle görülür şekilde tepki vermezken, aPKC'nin(aPKCAS4)analog hassas mutasyonu taşıyan yumurta odaları, sonunda yapışan kavşakların belirgin bir şekilde bozulmasına yol açan epitelin (ok uçları) bir daralmasını gösterir. 27 μM derinlik için 33 dilimin maksimum yoğunluk projeksiyonu Ölçek çubuğu: 20 μM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61954/61954fig07large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61954/61954fig08.jpg"> Şekil 8: Dönen çizgikanlar kullanılarak kortikal sinyalin ölçümü. (A) Baz::GFP (yeşil) ve CD4::mIFP (kırmızı) ifade eden canlı D. melanogaster nöroblast. Siyan çizgileri: ilk tarama hatları, ölçmek için dik olarak çeşitli kortikal bölgelere kadar izlendi. Ölçek çubuğu: 5 μM. (B) Kortikal çizgiler kullanılarak korteksin (koyu mavi çizgi) tanımlanması ve referans kanal olarak CD4::mIFP (kırmızı). Siyan çizgisi: korteks algılamadan sonra sinyalin ölçüldüğü "Etrafında ölç" parametresi (burada, 2 piksel) ile tanımlanan alan. Ölçek çubuğu: 2 μm. (C) Siyan: referans kanal olarak CD4::mIFP (kırmızı) kullanılarak (A) görüntülenen ilk tarama çizgilerinden dönen linescans yöntemi ile nöroblast bölünmesi sırasında tanımlanan kortikal alanlar. Ölçek çubuğu: 5 μM. Ok: apikal kutup. Ok ucu: bazal direk. (D) Baz ölçümü::GFP sinyal yoğunluğu zaman içinde görüntülenen dönen linescans tarafından tanımlanan karşılık gelen iki bölgede (C). Mitoz sırasında Baz::GFP, nöroblastın apikal kutbunda geçici olarak zenginleşir ve karşı bazal kutuptan tükenir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61954/61954fig08large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Video 1: Canlı görüntüleme sırasında bir inhibitör eklemek için hareketsiz larva beyinlerine medya değişimi uygulaması, Şekil 6'dasunulan ölçek çubuğu: 20 μm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_1_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Video 2: Canlı görüntüleme sırasında bir inhibitör eklemek için hareketsiz yumurta odalarına medya değişimi uygulaması, Şekil 7'desunulan ölçek çubuğu: 20 μm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_2_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Video 3: MultiHyperStackReg kullanılarak yanal ve odak sürüklenmesinin düzeltilmesi. Membran probu PH::GFP'yi ifade eden bir nöroblastın canlı görüntülenmesi. Xy: tek odak düzlemi. Xz: ortogonal reslice. Sol: sürüklenmenin düzeltilmesinden önce. Orta: yanal sürüklenmenin düzeltilmesinden sonra. Sağ: Yanal ve odak sürüklenmesini düzeltdikten sonra, ölçek çubuğu: 10 μm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_3_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Video 4: Şekil 8,ölçek çubuğu: 5 μm'de sunulan dönen çizgikanlar kullanılarak korteksin algılanmasını, <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_4_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">lütfen bu videoyu indirmek için buraya tıklayın.</a>
Ek Tablo 1: Görüntülenmiş Drosophila dokularının genotipleri. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Supplemental_Table_1_genotypes.xlsx" target="_blank">Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Ek Tablo 2: Kullanılan transgenes kökeni. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Supplemental_Table_2_origine_of_transgenes.xlsx" target="_blank">Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Ek Kodlama Dosyası 1: Kullanılan transgenes kökeni. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Code1_MultiHyperstackReg.ijm" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Tamamlayıcı Kodlama Dosyası 2: Kullanılan transgenes kökeni. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Code2_AutoHyperstackReg.ijm" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Ek Kodlama Dosyası 3: Kullanılan transgenes kökeni. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Code3_RotatingLineScan.ijm" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging at JoVE.com

Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging

Bu protokol, Fibrin pıhtıları kullanılarak numune hareketsizleştirme uygulamalarını açıklar, sürüklenmeyi sınırlar ve canlı görüntüleme sırasında reaktiflerin eklenmesine ve yıkanmasına izin verir. Örnekler, bir kapak parçasının yüzeyinde kültür ortamı içeren bir fibrinojen damlasına aktarılır, daha sonra trombin eklenerek polimerizasyon indüklenir.

Canlı Görüntüleme İçin Fibrin Pıhtıları ile Drosophila Dokularının Hareketsiz Hale Getirilmesi Uygulamaları

Drosophila is an important model system to study a vast range of biological questions. Various organs and tissues from different developmental stages of ...

applications-immobilization-drosophila-tissues-with-fibrin-clots-for

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging

3.0K Görüntüleme.  University of Dundee. Bu protokol, Fibrin pıhtıları kullanılarak numune hareketsizleştirme uygulamalarını açıklar, sürüklenmeyi sınırlar ve canlı görüntüleme sırasında reaktiflerin eklenmesine ve yıkanmasına izin verir. Örnekler, bir kapak parçasının yüzeyinde kültür ortamı içeren bir fibrinojen damlasına aktarılır, daha sonra trombin eklenerek polimerizasyon indüklenir.

Video: Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track during live cell imaging. These processes include: retinal rotation, cell growth and organismal movement. Additionally, irregularities in the topology of the epithelium, including subtle bumps and folds often introduced as the pupa is prepared for imaging, make it challenging to acquire in-focus images of more than a few ommatidia in a single focal plane. The workflow outlined here remedies these issues, allowing easy analysis of cellular processes during Drosophila pupal eye development. Appropriately-staged pupae are arranged in an imaging rig that can be easily assembled in most laboratories. Ubiquitin-DE-Cadherin:GFP and GMR-GAL4&#8211;driven UAS-&#945;-catenin:GFP are used to visualize cell boundaries in the eye epithelium 1-3. After deconvolution is applied to fluorescent images captured at multiple focal planes, maximum projection images are generated for each time point and enhanced using image editing software. Alignment algorithms are used to quickly stabilize superfluous motion, making individual cell behavior easier to track.

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Canlı-görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupa Göz

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Gelişim Biyolojisi

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

Uzun süreli Canlı Görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Göz Disk

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; for example, how the zygote polarizes to establish the body axis and how the embryo specifies various cell fates during organ formation. This manuscript describes an in vitro ovule culture method to perform live-cell imaging of developing zygotes and embryos of Arabidopsis thaliana. The optimized cultivation medium allows zygotes or early embryos to grow into fertile plants. By combining it with a poly(dimethylsiloxane) (PDMS) micropillar array device, the ovule is held in the liquid medium in the same position. This fixation is crucial to observe the same ovule under a microscope for several days from the zygotic division to the late embryo stage. The resulting live-cell imaging can be used to monitor the real-time dynamics of zygote polarization, such as nuclear migration and cytoskeleton rearrangement, and also the cell division timing and cell fate specification during embryo patterning. Furthermore, this ovule cultivation system can be combined with inhibitor treatments to analyze the effects of various factors on embryo development, and with optical manipulations such as laser disruption to examine the role of cell-cell communication.

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

This manuscript describes an in vitro ovule cultivation method that enables live-cell imaging of Arabidopsis zygotes and embryos. This method is utilized to visualize the intracellular dynamics during zygote polarization and the cell fate specification in developing embryos.

Vitro Zigot polarizasyon, Live-hücre görüntüleme ve Arabidopsis thaliana embriyo desenlendirme için ovule ekimi

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

Fare İkincil Palin Füzyonunun Canlı Görüntüsü

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and differentiation. Typically, pHi dynamics are determined in cultured cells, which are amenable to measuring and experimentally manipulating pHi. However, the recent development of new tools and methodologies has made it possible to study pHi dynamics within intact, live tissue. For Drosophila research, one important development was the generation of a transgenic line carrying a pHi biosensor, mCherry::pHluorin. Here, we describe a protocol that we routinely use for imaging live Drosophila ovarioles to measure pHi in the epithelial follicle stem cell (FSC) lineage in mCherry::pHluorin transgenic wild type lines; however, the methods described here can be easily adapted for other tissues, including the wing discs and eye epithelium. We describe techniques for expressing mCherry::pHluorin in the FSC lineage, maintaining ovarian tissue during live imaging, and acquiring and analyzing images to obtain pHi values.

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

We provide a protocol for imaging intracellular pH of an epithelial stem cell lineage in live Drosophila ovarian tissue. We describe methods to generate transgenic flies expressing a pH biosensor, mCherry::pHluorin, image the biosensor using quantitative fluorescence imaging, generate standard curves, and convert fluorescence intensity values to pH values.

Canlı Drosophila yumurtalık dokusu içinde folikül kök hücre soyundan Imaging hücre içi pH için yöntemleri

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled by multiple mechanisms that include the Spindle Assembly Checkpoint (SAC). The SAC is part of a complex feedback system that is responsible for prevention of a cell progress through mitosis unless all chromosomal kinetochores have attached to spindle microtubules. Chromosomal lagging and abnormal chromosome segregation is an indicator of dysfunctional cell cycle control checkpoints and can be used to measure the genomic stability of dividing cells. Deregulation of the SAC can result in the transformation of a normal cell into a malignant cell through the accumulation of errors during chromosomal segregation. Implementation of the SAC and the formation of the kinetochore complex are tightly regulated by interactions between kinases and phosphatase such as Protein Phosphatase 2A (PP2A). This protocol describes live cell imaging of lagging chromosomes in mouse embryonic fibroblasts isolated from mice that had a knockout of the PP2A-B56&#947; regulatory subunit. This method overcomes the shortcomings of other cell cycle control imaging techniques such as flow cytometry or immunocytochemistry that only provide a snapshot of a cell cytokinesis status, instead of a dynamic spatiotemporal visualization of chromosomes during mitosis.

This protocol describes an easy and convenient method to label and visualize live chromosomes in mitotic cells using Histone2B-GFP BacMam 2.0 label and a spinning disc confocal microscopy system.

Kromozom segregasyon mitoz sırasında canlı hücre görüntüleme

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits are required to control this behavior. Failure to produce the rhythmic pattern of contractions can be indicative of neurological abnormalities. We previously found that defects in protein O-mannosylation, a posttranslational protein modification, affect the axon morphology of sensory neurons and result in abnormal coordinated muscle contractions in embryos. Here, we present a relatively simple method for recording and analyzing the pattern of peristaltic muscle contractions by live imaging of late stage embryos up to the point of hatching, which we used to characterize the muscle contraction phenotype of protein O-mannosyltransferase mutants. Data obtained from these recordings can be used to analyze muscle contraction waves, including frequency, direction of propagation and relative amplitude of muscle contractions at different body segments. We have also examined body posture and taken advantage of a fluorescent marker expressed specifically in muscles to accurately determine the position of the embryo midline. A similar approach can also be utilized to study various other behaviors during development, such as embryo rolling and hatching.

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Here, we present a method to record embryonic muscle contractions in Drosophila embryos in a non-invasive and detail-oriented manner.

Canlı görüntüleme ve Drosophila embryo kas kasılmaları Analizi

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

The purpose of this protocol is to visualize intranuclear actin rods that assemble in live Drosophila melanogaster embryos following heat stress. Actin rods are a hallmark of a conserved, inducible Actin Stress Response (ASR) that accompanies human pathologies, including neurodegenerative disease. Previously, we showed that the ASR contributes to morphogenesis failures and reduced viability of developing embryos. This protocol allows the continued study of mechanisms underlying actin rod assembly and the ASR in a model system that is highly amenable to imaging, genetics and biochemistry. Embryos are collected and mounted on a coverslip to prepare them for injection. Rhodamine-conjugated globular actin (G-actinRed) is diluted and loaded into a microneedle. A single injection is made into the center of each embryo. After injection, embryos are incubated at elevated temperature and intranuclear actin rods are then visualized by confocal microscopy. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) experiments may be performed on the actin rods; and other actin-rich structures in the cytoplasm can also be imaged. We find that G-actinRed polymerizes like endogenous G-actin and does not, on its own, interfere with normal embryo development. One limitation of this protocol is that care must be taken during injection to avoid serious injury to the embryo. However, with practice, injecting G-actinRed into Drosophila embryos is a fast and reliable way to visualize actin rods and can easily be used with flies of any genotype or with the introduction of other cellular stresses, including hypoxia and oxidative stress.

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

The goal of this protocol is to inject Rhodamine-conjugated globular actin into Drosophila embryos and image intranuclear actin rod assembly following heat stress.

Canlı Isı Stresli Drosophila Embriyolarında İntranükleer Akin Çubuklarının Görüntülenmesi

The purpose of this protocol is to visualize intranuclear actin rods that assemble in live Drosophila melanogaster embryos following heat stress. Actin ...

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, germ cell development, piRNA biology, and niche formation. Here, we present a dissection technique to live-image the gonad ex vivo during a period when in vivo live-imaging is highly ineffective. This protocol outlines how to transfer embryos to an imaging dish, choose appropriately-staged male embryos, and dissect the gonad from its surrounding tissue while still maintaining its structural integrity. Following dissection, gonads can be imaged using a confocal microscope to visualize dynamic cellular processes. The dissection procedure requires precise timing and dexterity, but we provide insight on how to prevent common mistakes and how to overcome these challenges. To our knowledge this is the first dissection protocol for the Drosophila embryonic gonad, and will permit live-imaging during an otherwise inaccessible window of time. This technique can be combined with pharmacological or cell-type specific transgenic manipulations to study any dynamic processes occurring within or between the&#160;cells in their natural gonadal environment.

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Here, we provide a dissection protocol required to live-image the late embryonic Drosophila male gonad. This protocol will permit observation of dynamic cellular processes under normal conditions or after transgenic or pharmacological manipulation.

Geç Embriyonik Drosophila Gonad'ın Diseksiyonu ve Canlı Görüntülemesi

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, ...

Visualizing the Effects of Oxidative Damage on Drosophila Egg Chambers using Live Imaging

Live imaging of Drosophila melanogaster ovaries has been instrumental in understanding a variety of basic cellular processes during development, including ribonucleoprotein particle movement, mRNA localization, organelle movement, and cytoskeletal dynamics. There are several methods for live imaging that have been developed. Due to the fact that each method involves dissecting individual ovarioles placed in media or halocarbon oil, cellular damage due to hypoxia and/or physical manipulation will inevitably occur over time. One downstream effect of hypoxia is to increase oxidative damage in the cells. The purpose of this protocol is to use live imaging to visualize the effects of oxidative damage on the localization and dynamics of subcellular structures in Drosophila ovaries after induction of controlled cellular damage. Here, we use hydrogen peroxide to induce cellular oxidative damage and give examples of the effects of such damage on two subcellular structures, mitochondria and Clu bliss particles. However, this method is applicable to any subcellular structure. The limitations are that hydrogen peroxide can only be added to aqueous media and would not work for imaging that uses halocarbon oil. The advantages are that hydrogen peroxide is readily available and inexpensive, acts quickly, its concentrations can be modulated, and oxidative damage is a good approximation of damage caused by hypoxia as well as general tissue damage due to manipulation.

The objective of this protocol is to use live imaging to visualize the effects of oxidative damage on the localization and dynamics of subcellular structures in Drosophila ovaries.

Canlı Görüntüleme Kullanarak Oksidatif Hasarın Drosophila Yumurta Odaları Üzerindeki Etkilerini Görselleştirme

Live imaging of Drosophila melanogaster ovaries has been instrumental in understanding a variety of basic cellular processes during development, including ...