Aşağıdaki videonun genel amacı, negatif bir seçim taraması yapmak için havuzlanmış shRNA epigenetik kütüphanesinin kullanımını göstermektir. Bu tarama, dizileme yoluyla spesifik epigenetik hedeflerin belirlenmesini sağlar. Bu prosedür, AML'de edinilmiş sitarabin direncine aracılık etmekten sorumlu epigenetik faktörlerin tanımlanmasına yardımcı olabilir Adımlar aşağıdaki gibidir.
ShRNA'ların kalıcı ve uzun süreli ekspresyonunu elde etmek için en güçlü promotörün seçimi. Mevcut protokol, sitarabin dirençli MV4-11 hücre hattında epigenetik faktör shRNA kütüphanesi kullanılarak RNAi taramasına odaklanmaktadır. Bu amaçla kullanılan promotörler, yeşil floresan proteinini eksprese eden insan EF-1 alfa, insan CMV ve SFFV'dir.
Tripan mavi dışlama yöntemini kullanarak hücre sayısını alın. Hücreleri, mL polibren başına 8 mikrogram içeren% 10 RPMI ortamında askıya alın. Üçlü olarak altı kuyucuklu bir plakanın kuyusu başına 1.5 ml ortamda 1 milyon hücre tohumlayın.
Farklı hacimlerde konsantre lentivirüsler ekleyin. Örneğin, lentivirüsler, örneğin, lentivirüslerin her bir kuyucuğa titresine bağlı olarak 10, 20 ve 40 mikrolitre. İçeriği karıştırmak için plakayı yavaşça döndürün.
90 dakika boyunca 37 santigrat derecede 920 g'da santrifüjleme ile spinfenfeksiyon gerçekleştirin. Plakaları hemen bir karbondioksit inkübatöründe inkübe edin. GFP'yi 48 saatin sonunda gözlemleyin ve 72 saatin sonunda da aynısını ölçün.
Ardından, kültür genelinde tutarlı GFP ifadesi gösteren destekçiyi seçmek için akış şemasında gösterilen adımları izleyin. Havuzlanmış lentiviral insan epigenetik faktör shRNA kütüphanesinin hazırlanması. Her plakada 8 ml% 10 DMFM ortamı bulunan üç adet 10 santimetrelik hücre kültürü kabında iyi bir proliferasyon oranına sahip düşük bir geçiş numarasında kültür 293T hücreleri.
Hücreler% 60 akıcılığa ulaştığında, tamamen taze ortamla değiştirin. Serumsuz ortam, lentiviral ambalaj plazmidi PAX2, zarf plazmidi pMD2 içeren transfeksiyon karışımını ana hatlarıyla hazırlayın. G, havuzlanmış kütüphane plazmidleri ve son olarak transfeksiyon reaktifi.
İyice karıştırmak için karışıma dokunun ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Transfeksiyon karışımını 293T hücrelerine ekleyin ve plakaları döndürerek yavaşça karıştırın. Plakaları bir karbondioksit inkübatöründe inkübe edin.
24 saat sonra ortamı değiştirin. 48 saat sonra, 293T hücrelerine yüksek transfeksiyon verimliliği sağlamak için bir floresan mikroskobu altında GFP ekspresyonunu kontrol edin. Virüs süpernatantlarını 48, 60 ve 72 saat sonra toplayın ve 4 derecede saklayın ve virüsü topladıktan sonra her zaman noktasında taze ortam, 8ml ekleyin.
Havuza alınan virüsleri 0,4 mikron filtre ile filtreleyin. Yüksek bir virüs titresi elde etmek için, havuzlanmış virüsleri ultrasantrifüjleme ile konsantre edin. Filtrelenmiş virüs süpernatantlarını 70 Ti tüpüne aktarın ve 2 saat boyunca 18.000 g'da santrifüj yapın.
Ön soğutmalı rotor ve santrifüj 4 derecede kullanın. Tüpleri santrifüjden dikkatlice çıkarın ve süpernatantı tamamen çıkarın. Peleti FBS ve antibiyotik olmadan 400 mikrolitre DMEM'de bir mikropipet kullanarak nazikçe askıya alın, 1 saat boyunca buz üzerinde inkübe edin.
Virüsleri alikote edin ve eksi 80 derecede dondurun. Gösterildiği gibi virüsün konsantrasyonunu hesaplayın. Lentivirüslerin transdüksiyon etkinliğinin tahmini.
Lentivirüsün başarılı bir şekilde hazırlandığını doğrulamak için 293T hücrelerini farklı hacimlerde, 2, 4 ve 8'de konsantre bir virüsle dönüştürün. Hedef hücre hattında bir titrasyon deneyi gerçekleştirmek için konsantre virüsün değeri 100X'tir. Tohum 1.5 ml% 10 RPMI ortamında, altı kuyucuklu bir plakanın bir kuyucuğunda ml başına 8 mikrogram polibren içeren.
Dört farklı hacim, 1, 1.5, 2, 2.5 mikrolitre 100X virüs ekleyin. 37 santigrat derecede 90 dakika boyunca plakanın 920 g'da santrifüjlenmesiyle serpinti yapın. 72 saat sonra, GFP pozitif hücrelerin yüzdesini akış sitometrisi ile ölçün.
%30 iletim verimliliği elde etmek için virüslerin hacmini belirleyin. Bu düşük iletim verimliliği, hücre başına tek shRNA entegrasyonu sağlamaktır. Havuzlanmış epigenetik shRNA kütüphanesinin ilaca dirençli hücre hattında transdüksiyonu.
Deney için alınacak hücre sayısını, viral integrantların sayısına göre aşağıdaki gibi hesaplayın. %10 RPMI ortamının 16 ML'sinde 11 milyon hücreyi yeniden askıya alın. Polibren ekleyin, ml başına sekiz mikrogram ve iyice karıştırın ve daha önce hesaplandığı gibi% 30 iletim verimliliği elde etmek için gerekli virüs hacmini ekleyin.
Tüm hücreleri, kuyucuk başına 1.5 ml başına 1 milyon hücre yoğunluğunda altı kuyucuklu bir plakada tohumlayın. Plakayı 37 santigrat derecede 920 g'da 90 dakika boyunca santrifüj edin. Plakayı bir karbondioksit inkübatöründe gece boyunca inkübe edin.
24 saat sonra, ortamı değiştirin ve dönüştürülmüş hücreleri bir T-75 şişesine aktarın. 48 saat sonra, başarılı bir transdüksiyon sağlamak için GFP'yi bir floresan mikroskobu altında kontrol edin. 72 saat sonra, GFP'yi akış sitometrisi ile sayın.
GFP pozitif hücrelerin zenginleştirilmesi. Dönüştürülen hücreleri 5 ila 7 gün boyunca ml başına 0,5 milyon yoğunlukta kültürleyerek genişletin ve akış sıralama ayarı yüksek saflık ve düşük verim olarak ayarlanarak akış ayıklama gerçekleştirin. Sıralanmış hücreleri% 10 RPMI ortamında kültürleyin.
72 saat sonra, %95'ten fazla ayıklama verimliliği sağlamak için GFP pozitif hücrelerinin yüzdesinin sıralama sonrası tahminini gerçekleştirin. İlaç direncine aracılık eden epigenetik faktörleri tanımlamak için bırakma taraması. ShRNA kütüphanesine dönüştürülmüş hücreleri 5 güne kadar %10 RPMI'da kültürleyin.
10 milyon hücreyi kopyalar halinde santrifüj yapın. Süpernatantı atın ve peletleri eksi 80 derecede saklayın. Bu örnekler epigenetik shRNA kütüphanesi için temel referans görevi görecektir.
Kalan dönüştürülmüş hücreleri, her biri kitaplığın 500X temsilini sağlayan bir hücre sayısında tutulan kopyalar olarak R1 ve R2 olarak kültürleyin. Kopyalardan birini ilaçla, 10 mikromolar sitarabinle, diğerini ise ilaç tedavisi olmadan tedavi edin. Şişelerin ortamını her 72 saatte bir ilaçla ve ilaçsız olarak değiştirin.
9 günlük kümülatif ilaç maruziyeti için orta değişimi üç kez tekrarlayın. İlaç tedavisinin 9. gününden sonra, tripan mavisi dışlama yöntemi ile hücrelerin canlılığını kontrol edin. Kalan canlı hücreleri döndürün, steril PBS ile yıkayın ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 280 g'da santrifüj yapın.
Süpernatantı atın ve DNA ekstraksiyonu için peletleri eksi 80'de saklayın. Entegre shRNA'ların PCR ile amplifikasyonu. DNA'yı dönüştürülmüş bazal hücrelerden, işlenmiş ve tedavi edilmemiş hücrelerden çıkarın, ardından florometre kullanarak konsantrasyonu kontrol edin, gösterildiği gibi gerekli DNA miktarını hesaplayın ve örnekleri PCR'nin ilk turuna tabi tutun.
PCR reaksiyon karışımı tablo 2'de termal döngü koşulları ile gösterilmiştir. Toplam 43 reaksiyon için tüp başına 850 nanogram DNA içeren çoklu reaksiyonlar ayarlayın. PCR ürünlerini bir araya getirin ve saflaştırın.
Ürünleri 50 mikrolitrelik tamponda süzün ve miktarını ölçün ve son olarak eksi 20'de saklayın. İkinci tur PCR için, ters indeks primerleri kullanın ve reaktifler tablo 4'te tablolaştırılmıştır. Negatif kontrol ile birlikte her numune için toplam 50 mikrolitre reaksiyon hacminde birincil PCR ürününün 500 nanogramı ile dört reaksiyon ayarlayın.
Tüm ürünü elektroforez için% 2 TBE agaroz jeli kullanarak yükleyin ve bant boyutunu bir KB molekül merdiveni ile onaylayın. PCR ürünlerini jel dokümantasyon sisteminde görselleştirin. Belirli bandı tüketin ve bir jel saflaştırma kiti kullanarak saflaştırın.
Kit ile saflaştırma için hesaplamalar tablo 3'te verilmiştir. 30 mikrolitre elüsyon tamponunun son hacminde, her bir elüentin yaklaşık konsantrasyonu mikrolitre başına 80 ila 90 nanogram civarında sülte edilir. Yeni nesil sıralama ve veri analizi.
Jel saflaştırılmış ürünler, tükenmiş shRNA ihtiyaçları için okuma sayıları elde etmek üzere yeni nesil dizilemeye tabi tutulur. Bağdaştırıcı dizilerini kırpın, filtrelenmiş okumaları referans dizilerine hizalayın, hizalama özeti elde etmek için SAMtools'u kullanarak dosyaları yükleyin. Kırpılmış fastQ dosyalarını CRISPRCloud2'ye yükleyin ve analizi talimatlara göre gerçekleştirin.
CRISPRCloud2 için sağlanan bağlantıya tıklayın. Ekran türünü Hayatta Kalma ve Bırakma ekranları olarak seçin. Grup sayısını ayarlayın ve her grubun adını yazın.
Referans kitaplığını FASTA dosya formatı olarak yükleyin. Yüklenen veriler işlenir ve sonuçlar verilen URL'de mevcuttur. Temsili veriler.
Bu şekil, artan sitarabin konsantrasyonu, 0.1 mikromolar ila 1.000 mikromolar ve MTT testi ile canlılık değerlendirmesi ile tedavi edilen MV4-11 ebeveyn ve dirençli hücreleri göstermektedir. Bu şekil, insan EF-1 alfa, insan CMV ve SFFV promotörleri için 72 saatin sonunda akış sitometrisi ile ölçülen GFP'nin temsili akış grafiklerini göstermektedir. İnsan CMV'si heterojen zirvemizi gösterirken, insan EF-1 alfa ve SFFV tek bir homojen tepe noktası gösterir.
Bu şekilde, MV4-11'deki üç farklı promotör verimliliği için çubuk grafik gösterilmektedir. SFFV güdümlü GFP, uzun süreli kültürde GFP'nin susturulduğunu gösterdi. hEF-1 alfa güdümlü GFP hücreleri, bu hücrelerin sıralanmasından sonra sürekli ekspresyon gösterdi.
Sol panel, floresan mikroskobu altında 48 saat sonunda 293T'de transfekte edilen havuzlanmış shRNA kütüphanesinin transfeksiyon verimliliğini göstermektedir. Sağ panel, değişen virüs hacimlerine, 2, 4 ve 8 mikrolitreye sahip 293T hücrelerinde havuz virüsünün transdüksiyon verimliliğini gösterir. Bu şekil,% 30 iletim verimliliği elde etmek için 1, 1.5, 2, 2.5 mikrolitre gibi değişen virüs hacimlerine sahip MV4-11 dirençli hücre hattındaki transdüksiyon verimliliğini temsil eder.
Bu şekil, GFP pozitif hücrelerinin %30 iletim verimliliği ile yüksek saflıkta ve düşük verimli ayıklama ayarında sıralanmasını göstermektedir. Şekil, 9 günlük uzun süreli sitarabin maruziyeti için GFP pozitif sıralanmış hücreler için ilaç tedavisinin şematik gösterimini göstermektedir, ardından canlılığı kontrol etmek ve DNA için hücreleri toplamak suretiyle gösterilmiştir. Bu şekil, PCR'nin birinci ve ikinci turunda kullanılan astarın bağlanma bölgelerini göstermektedir.
Bu şekil, birinci tur PCR, 397 baz çifti ve jel salınımlı, saflaştırılmış ve NGS için verilen ikinci tur PCR ürünü 399 baz çiftinin sonundaki PCR ürününün bant boyutunu göstermektedir. Bu şekil, AML'de sitarabin direncine aracılık edebilecek epigenetik faktörleri hedef alan zenginleştirilmiş veya tükenmiş shRNA'ların temsilini göstermektedir. Son. Bu protokol, hem temel hem de gerekli olmayan genleri sistematik olarak sorgulamak için hedefli nakavt taramasının önemini vurgulamakta ve bu yaklaşımın ilaç direncinden sorumlu hedeflerin belirlenmesine izin veren işlevsel bir platform olarak kullanıldığını göstermektedir.
