Name: structural information from single-molecule fret experiments using the fast nano-positioning system
Uploaded: 2017-02-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Structural Information from Single-molecule FRET Experiments Using the Fast Nano-positioning System at JoVE.com

The authors thank B. Gruchmann for the mechanical drawings of the flow chamber. Further, we want to express our gratitude to Max Beckers and Florian Drechsler for insightful comments and discussions regarding NPS and the underlying sampling engine.

<ol>
	<li>Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Particle+Cryo-EM+at+Crystallographic+Resolution.">Single-Particle Cryo-EM at Crystallographic Resolution.</a> Cell. 161, 450-457 (2015).</li><li>Garman, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developments+in+X-ray+Crystallographic+Structure+Determination+of+Biological+Macromolecules.">Developments in X-ray Crystallographic Structure Determination of Biological Macromolecules.</a> Science. 343 (6175), 1102-1108 (2014).</li><li>Sali, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outcome+of+the+First+wwPDB+Hybrid/Integrative+Methods+Task+Force+Workshop.">Outcome of the First wwPDB Hybrid/Integrative Methods Task Force Workshop.</a> Structure. 23, 1156-1167 (2015).</li><li>Hopfner, K. P., Michaelis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+nucleic+acid+translocases:+lessons+from+structural+biology+and+single-molecule+biophysics.">Mechanisms of nucleic acid translocases: lessons from structural biology and single-molecule biophysics.</a> Curr Opin Struct Biol. 17, 87-95 (2007).</li><li>Ando, T., Uchihashi, T., Kodera, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+AFM+and+applications+to+biomolecular+systems.">High-speed AFM and applications to biomolecular systems.</a> Annu Rev Biophys. 42, 393-414 (2013).</li><li>Neuman, K. K. C., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+force+spectroscopy:+optical+tweezers,+magnetic+tweezers+and+atomic+force+microscopy.">Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy.</a> Nat Methods. 5, 491-505 (2008).</li><li>Yildiz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+V+walks+hand-over-hand:+single+fluorophore+imaging+with+1.5-nm+localization.">Myosin V walks hand-over-hand: single fluorophore imaging with 1.5-nm localization.</a> Science. 300 (5628), 2061-2065 (2003).</li><li>Joo, C., Balci, H., Ishitsuka, Y., Buranachai, C., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+Single-Molecule+Fluorescence+Methods+for+Molecular+Biology.">Advances in Single-Molecule Fluorescence Methods for Molecular Biology.</a> Annu Rev Biochem. 77 (1), 51-76 (2008).</li><li>Hohlbein, J., Craggs, T. D., Cordes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternating-laser+excitation:+single-molecule+FRET+and+beyond.">Alternating-laser excitation: single-molecule FRET and beyond.</a> Chem Soc Rev. 43 (4), 1156-1171 (2014).</li><li>Stryer, L., Haugland, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+transfer:+a+spectroscopic+ruler.">Energy transfer: a spectroscopic ruler.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 58 (2), 719-726 (1967).</li><li>Rasnik, I., Myong, S., Cheng, W., Lohman, T. M., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-binding+Orientation+and+Domain+Conformation+of+the+E.+coli+Rep+Helicase+Monomer+Bound+to+a+Partial+Duplex+Junction:+Single-molecule+Studies+of+Fluorescently+Labeled+Enzymes.">DNA-binding Orientation and Domain Conformation of the E. coli Rep Helicase Monomer Bound to a Partial Duplex Junction: Single-molecule Studies of Fluorescently Labeled Enzymes.</a> J Mol Biol. 336 (2), 395-408 (2004).</li><li>Andrecka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+tracking+of+mRNA+exiting+from+RNA+polymerase+II.">Single-molecule tracking of mRNA exiting from RNA polymerase II.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (1), 135-140 (2008).</li><li>Schr&#246;der, G. F., Grubm&#252;ller, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRETsg:+Biomolecular+structure+model+building+from+multiple+FRET+experiments.">FRETsg: Biomolecular structure model building from multiple FRET experiments.</a> Comput Phys Commun. 158 (3), 150-157 (2004).</li><li>Margittai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+fluorescence+resonance+energy+transfer+reveals+a+dynamic+equilibrium+between+closed+and+open+conformations+of+syntaxin+1.">Single-molecule fluorescence resonance energy transfer reveals a dynamic equilibrium between closed and open conformations of syntaxin 1.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (26), 15516-15521 (2003).</li><li>Kalinin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+toolkit+and+benchmark+study+for+FRET-restrained+high-precision+structural+modeling.">A toolkit and benchmark study for FRET-restrained high-precision structural modeling.</a> Nat Methods. 9 (12), 1218-1227 (2012).</li><li>Choi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N6-methyladenosine+in+mRNA+disrupts+tRNA+selection+and+translation-elongation+dynamics.">N6-methyladenosine in mRNA disrupts tRNA selection and translation-elongation dynamics.</a> Nat Struct Mol Biol. 23 (August 2015), 110-115 (2015).</li><li>Svensson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRET-based+trilateration+of+probes+bound+within+functional+ryanodine+receptors.">FRET-based trilateration of probes bound within functional ryanodine receptors.</a> Biophys J. 107 (9), 2037-2048 (2014).</li><li>Stephenson, J. D., Kenyon, J. C., Symmons, M. F., Lever, A. M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+3D+RNA+structure+by+single+molecule+FRET.">Characterizing 3D RNA structure by single molecule FRET.</a> Methods. (2016), 1-11 (2016).</li><li>Lee, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+FRET+measurements+within+single+diffusing+biomolecules+using+alternating-laser+excitation.">Accurate FRET measurements within single diffusing biomolecules using alternating-laser excitation.</a> Biophys J. 88 (4), 2939-2953 (2005).</li><li>McCann, J. J., Choi, U. B., Zheng, L., Weninger, K., Bowen, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+methods+to+recover+absolute+FRET+efficiency+from+immobilized+single+molecules.">Optimizing methods to recover absolute FRET efficiency from immobilized single molecules.</a> Biophys J. 99 (3), 961-970 (2010).</li><li>Brunger, A. T., Strop, P., Vrljic, M., Chu, S., Weninger, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+molecular+modeling+with+single+molecule+FRET.">Three-dimensional molecular modeling with single molecule FRET.</a> J Struct Biol. 173, 497-505 (2011).</li><li>Schuler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+FRET+of+protein+structure+and+dynamics+-+a+primer.">Single-molecule FRET of protein structure and dynamics - a primer.</a> J nanoboitechnology. 11, 1-17 (2013).</li><li>Choi, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+FRET-derived+model+of+the+synaptotagmin+1-SNARE+fusion+complex.">Single-molecule FRET-derived model of the synaptotagmin 1-SNARE fusion complex.</a> Nat Struct Mol Biol. 17 (3), 318-324 (2010).</li><li>Dale, R. E., Eisinger, J., Blumberg, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+orientational+freedom+of+molecular+probes.+The+orientation+factor+in+intramolecular+energy+transfer.">The orientational freedom of molecular probes. The orientation factor in intramolecular energy transfer.</a> Biophys J. 26 (2), 161-193 (1979).</li><li>Kapanidis, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternating-laser+excitation+of+single+molecules.">Alternating-laser excitation of single molecules.</a> Acc Chem Res. 38 (7), 523-533 (2005).</li><li>Muschielok, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nano-positioning+system+for+macromolecular+structural+analysis.">A nano-positioning system for macromolecular structural analysis.</a> Nat Methods. 5 (11), 965-971 (2008).</li><li>Muschielok, A., Michaelis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+the+nano-positioning+system+to+the+analysis+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+networks.">Application of the nano-positioning system to the analysis of fluorescence resonance energy transfer networks.</a> J Phys Chem B. 115 (41), 11927-11937 (2011).</li><li>Andrecka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano+positioning+system+reveals+the+course+of+upstream+and+nontemplate+DNA+within+the+RNA+polymerase+ii+elongation+complex.">Nano positioning system reveals the course of upstream and nontemplate DNA within the RNA polymerase ii elongation complex.</a> Nucleic Acids Res. 37 (17), 5803-5809 (2009).</li><li>Treutlein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Architecture+of+a+Minimal+RNA+Polymerase+II+Open+Promoter+Complex.">Dynamic Architecture of a Minimal RNA Polymerase II Open Promoter Complex.</a> Mol Cell. 46 (2), 136-146 (2012).</li><li>Nagy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+architecture+of+the+archaeal+RNA+polymerase+open+complex+from+single-molecule.">Complete architecture of the archaeal RNA polymerase open complex from single-molecule.</a> FRET and NPS. Nat Commun. 6, 6161 (2015).</li><li>Grohmann, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Initiation+Factor+TFE+and+the+Elongation+Factor+Spt4/5+Compete+for+the+RNAP+Clamp+during+Transcription+Initiation+and+Elongation.">The Initiation Factor TFE and the Elongation Factor Spt4/5 Compete for the RNAP Clamp during Transcription Initiation and Elongation.</a> Mol Cell. 43 (2), 263-274 (2011).</li><li>Beckers, M., Drechsler, F., Eilert, T., Nagy, J., Michaelis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+structural+information+from+single-molecule+FRET.">Quantitative structural information from single-molecule FRET.</a> Faraday Discuss. 184, 117-129 (2015).</li><li>Bennink, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unfolding+individual+nucleosomes+by+stretching+single+chromatin+fibers+with+optical+tweezers.">Unfolding individual nucleosomes by stretching single chromatin fibers with optical tweezers.</a> Nat Struct Biol. 8 (7), 606-610 (2001).</li><li>Chandradoss, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+passivation+for+single-molecule+protein+studies.">Surface passivation for single-molecule protein studies.</a> J Vis Exp. (86), e50549 (2014).</li><li>W&#252;rth, C., Grabolle, M., Pauli, J., Spieles, M., Resch-Genger, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+and+absolute+determination+of+fluorescence+quantum+yields+of+transparent+samples.">Relative and absolute determination of fluorescence quantum yields of transparent samples.</a> Nat Protoc. 8 (8), 1535-1550 (2013).</li><li>Lakowicz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of Fluorescence Spectroscopy. , (2006).</li><li>Korkhin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+complex+RNA+polymerases:+The+complete+archaeal+RNA+polymerase+structure.">Evolution of complex RNA polymerases: The complete archaeal RNA polymerase structure.</a> PLoS Biol. 7 (5), (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Doğru olarak örneğin biomacromolecules, nükleik asitler ve / veya proteinler esnek bağlayıcılar yoluyla bağlanmış boyalar arasında FRET verimliliğini belirlemek için setup ve deney prosedürü sunulmuştur. hassas smFRET ölçümleri (bölüm 3) sağlamak için, ölçüm sırasında herhangi bir zamanda akış odasından havayı uzak tutmak için çok önemlidir. Ayrıca, fluorophores akış odasına aşırı yüklenmeyin emin olun. fluorophores açıkça doğru analiz sağlamak için ayrılmalıdır. donörün beyazlatma görünmüyor smFRET çiftleri, analize dahil olmak zorunda olduğu gibi, görüş alanında moleküllerin&gt;% 80 filmin sonunda ağartılmış emin olun. Verici ve alıcı kanal cross-talk ve bağıl algılama verimliliği düzeltme, numune β-faktörü ve γ-faktörü homojen olmayan hesaba katılması için, sırasıyla, her biri için ayrı ayrı hesaplanır çifti FRET. <p class= &quot;Jove_content&quot;&gt; kamera ayarları (entegrasyon süresi, elektron çoğaltıcı kazanç, pre-amplifikatör kazanç ve Bölüm 3.9&#39;da açıklanan okuma oranı) gürültü oranı, dinamik aralık ve zaman çözünürlüğü sinyali arasındaki en iyi dengeyi sağlayan değerlere ayarlanması gerekir. Farklı deneyler için ya da farklı donanım kullanıldığında yeniden ayarlanması gerekir. kare sayısı verici en gözlem süresi içinde ağartma maddesi molekülleri sağlamak için yeterince yüksek olması gerekir. floresan spektrometresi (Bölüm 7 ila 9) üzerine ölçümler için sinyal yoğunluğu ve kaydedilen verilerin spektral çözünürlüğü arasında iyi bir uzlaşma bulunmalıdır. Bu amaçla, flüoresan spektrometresi eksitasyon ve emisyon yolu yarıklar kullanılan aletin ve örnek konsantrasyonuna bağlıdır adapte edilmesi gerekir. Ayrıca, biz geçici veya dinamik MACROM yapısal bilgi almak için Hızlı NPS analiz yöntem mevcutolecular kompleksleri. NPS olmayan model DNA sarmalının yolu ve arkeal RNA polimeraz açık karmaşık transkripsiyon başlatma faktörleri konumunu göstermek için uygulanmıştır. 60&#39;dan fazla farklı mesafe ölçümlerinin ağını kullanarak, bunu bir yeni uygulamaya örnekleme motoru (hazırlık Eilert, T., Beckers, M., Drechsler, F., ve Michaelis, J.) ile donatılmış Hızlı NPS, gösterdi orijinal küresel NPS yöntemine 27 ile karşılaştırıldığında, büyüklük ≈2 emriyle bu karmaşık smFRET ağının analizi için gerekli süreyi azaltır. algoritmanın sağlamlığı paralel tavlama şeması ile birlikte Metropolis-içinde-Gibbs örnekleyici yatmaktadır. Hızlı NPS ağ sonuçlarının tam tekrarlanabilirlik göstermektedir ve önceki 30 yayınlanan sonuçlarla tutarlıdır. Birçok farklı yöntem smFRET ölçümlerinden 11 yapısal bilgi anlaması nişan yayınlandı </sYukarıya&gt;, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18. Bu yaklaşımların her yalnızca belirli bir boya modelini sağlamaktadır. Bu nedenle, söz konusu modele göre yapılan varsayımlara yerine getirmeyen renklendiriciler, kullanılmış veya sahte yapısal bilgi yol edilemez. Hızlı NPS, tam tersine, her boya molekülü farklı bir model için seçmenize izin verir. Bu, her iki farklı yapısal davranışı için hesap olur, boya molekülü kendisi olarak yapışması için kullanılan bağlayıcı. boya molekülü lokal moleküler çevresi, hem de fiziksel özellikleri en uygun olan bir model belirler. arke başlatma kompleksinin analiz smFRET ağı için, tüm boya molekülleri için izotropik varsayım ciddi bir azalma i yol açarn güvenilir hacimlerinin büyüklüğü klasik modele kıyasla. Tüm boya için ortalama dinamik pozisyonu ile kombinasyon halinde (% 95) tüm güvenilir ses boyutları medyan molekülleri en az 0.5 nM ila 3 azaltır. Bununla birlikte, bu boya molekülü posteriors varsayımlar sahte yapısal bilgilere adına yapılan işaret, kendi smFRET ölçümleri artık tutarlıdır. Bunun aksine, klasik modelinde belirlenen posteriors tespit smFRET verim ile tutarlıdır. Tüm boyalar için ortalama izotropik ve / veya dinamik pozisyon varsayımı Fast-NPS her boya beş modellerden biri atanabilir hangi boya molekülü sabıkası sağlayan, tutarsızlıklara yol açar. Her model aynı erişilebilir hacmi kullanır. boya AVS hesaplanması için algoritma çeşitli varsayımlar yapar. İlk başta, fluorofor mekansal şekil bir küre ile yaklaşılır. Bu durumda, bir çapa hesabı flüorofor en wid alarakinci, boy ve kalınlıkta (Bölüm 12) kullanılmalıdır. Ayrıca, linker&#39;ın şekli esnek bir çubuk ile yaklaşılır. Bölüm 12&#39;de sunulan değerler, 12-Cı bağlayıcı ile bağlanmış boya Alexa 647 için hesaplanmıştır. Bugüne kadar, deneysel geometrisi verilen doğru model en uygundur önsel tespit etmek mümkün değildir, ve bu nedenle tüm modeller test edilmelidir. Hala veriler ile tutarlı olurken, genel olarak, bir, mümkün olan en küçük arka boyutunu verir modelini seçecektir. modellerin bir seçim smFRET verileri ile tutarlı olup olmadığını sınamak için, biz posterior ve olasılığını hem de hesaplar. Tutarlılık posterior alınan örneklerin% 90&#39;dan fazla olasılığının% 95 güven aralığında olduğu anlamına gelir. Bu doğru ise, boya moleküllerinin smFRET ağında, mesafe belirsizliği küçük, anizotropi düşük geometrik düzenlemeler de dikkate alınması gerektiğini. Bu nedenle, ise rTipik bir ilk tercihi bir iso modeli ile düşük floresan anizotropi ile boya molekülleri olan epresenting, tutarlılık testi doğru boya modelini seçmek için daha doğrudan bir araç sağlar. boya modelleri optimal seçim yerelleştirme hassas ciddi bir artışa yol ve aynı zamanda onun FRET verilerle ağın tutarlılık koruyabilirsiniz. Özetlemek gerekirse, Fast-NPS büyük makromoleküler kompleksleri yapısal ve dinamik bilgiler kazanç sağlar. X-ışını kristalografisi veya bu nedenle büyük ölçüde karmaşık biyolojik süreçlerin mekanistik anlama genişleyen son derece esnek veya geçici kompleksleri izleme sağlar kriyo elektron mikroskopisi gibi ortak yapısal yöntemlerin aksine.

Bir biyomolekül yapısını belirleme işlevini anlamak için bir anahtar önkoşuldur. Yapı tayini için iki köklü yöntemler cryo-elektron mikroskobu ve X-ışını kristalografisi 1, 2. Bugün, her iki yöntem angstrom düzeyine kadar bir çözünürlüğe sahip yüksek çözünürlüklü yapısal bilgi sağlar. Bu iki yöntem, bu protein kompleksleri gibi büyük biyomoleküllerin yapısının aydınlatmak için yaygın olarak kullanılmaktadır. Mevcut yöntemler sürekli son yıllarda boyunca geliştirilmiş olmasına rağmen, geniş bir dinamik ve geçici kompleksleri 3 incelenmiştir zaman, biyolojik yapıların karmaşıklığı hala, özellikle yapısal biyoloji için büyük bir sorun teşkil etmektedir. makromoleküler kompleksleri dinamiklerini ve özellikle yapı-fonksiyon ilişkisini incelemek amacıyla, tek-molekül metodolojileri prov vararyans yararlı bilgiler 4. Birkaç yeni stratejiler yapısal ve dinamik bilgi edinme ile ilgili bir ortogonal bir yaklaşım sağlayarak geliştirilmiştir. Örnekler, yüksek hızlı AFM 5, mekanik manipülasyon 6, floresans mikroskopisi yeri 7, hem de tek-molekül Förster Rezonans Enerji Transferi (smFRET) 8, 9 vardır. Oldukça erken FRET üzerinde beri nedeniyle biomacromolecules 10 uzunluğu ölçekte mesafe bağımlılığı, moleküler cetvel olarak adlandırılmıştır. SmFRET özellikle ilginç bir uygulama sonucuna smFRET ölçümlerden elde edilen mesafe bilgileri kullanmak bilgileri 11, 12, 13, 14, 15, yapısal </sup&gt;, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23. Nedeniyle smFRET yüksek zaman çözünürlüğü, bir protein yapısının hareketli parçaları konumu lokalize edilebilir. Ancak, boya molekülleri hakkında smFRET veri önemli düzeltme parametreleri kantitatif bilgileri ayıklamak için ölçüm 24 sırasında tespit edilmesi gerekmektedir. Bu düzeltme faktörleri ile, verimliliği FRET E FRET formülü kullanılarak hesaplanabilir <img alt="denklem 1" src="/files/ftp_upload/54782/54782eq1.jpg" /> , Nerede Bir ve ben D </sUB&gt; sırasıyla donör ve akseptör molekülünün floresan yoğunlukları (bakınız Şekil 2) vardır. β-faktör alıcı kanalı içine, çapraz konuşma için donör emisyon sızmasını hesapları ve hesaplanır <img alt="denklem 2" src="/files/ftp_upload/54782/54782eq2.jpg" /> Ben A ve ben D nerede donör floresan yoğunlukları ve alıcı molekülün fotoğraf beyazlatma sonra alıcı molekül vardır. γ-faktörü iki kanal nispi algılama verimliliği farkı olarak vericinin flüoresan verim ve alıcı boya farkları düzeltir. Bu her bireyin zaman iz hesaplanır Bu açıklama, bazen önemli hale gelir ve yanı düzeltilmiş olması gerekir alıcı molekül, doğrudan uyarma ihmal olduğunu unutmayın. Bu düzeltme faktörleri belirlemek için foto-fiziksel değişiklikler ve yapısal dinamikleri ayırt etmek için bir alternatif şema 25 donör yanı sıra alıcısını hem heyecanlandırmak için yararlıdır. Nicel smFRET verimlilik değil, aynı zamanda niceliksel yapısal bilgi elde etmek değil, sadece sırayla, Nano-Konumlandırma Sistemi (NPS) 2008 26 tanıtıldı. adı uydu tabanlı Küresel Konumlandırma Sistemi (GPS) olan benzerliklerine göre seçildi. NPS biomacromolecular kompleksleri bilinmeyen boya pozisyonları lokalizasyonu için smFRET ve X-ışını kristalografisi verilerin birleştirilmesi melez bir tekniktir. crystal yapı referans çerçevesi olarak hizmet vermekte ve smFRET sonuçları bilinmeyen bir fluorofor konumunda (anten) ve kristal yapısının (uydu) bilinen bir pozisyon arasındaki mesafe bilgilerini elde etmek için kullanılır. üst üste deneylerde anten ve çeşitli uydu arasındaki mesafeler ölçülür ve anten konumu Bayesian parametre kestirimi göre istatistiksel olarak sıkı bir analiz düzeni vasıtası ile tespit edilir. Bunun bir sonucu olarak, antenin en muhtemel konumunu sadece hesaplanır, ancak tam bir 3D belirsizliği dağılımı denilen arka inanılır hacim ile görüntülenmiştir. Ayrıca, NPS tam smFRET ağları 27 analiz için genişletilmiştir. NPS ökaryotik transkripsiyon önemli sorular, yukarı DNA, şablon olmayan DNA ve RNA Polimeraz II uzama co içinde doğmakta olan mRNA yani tabii bir dizi çözmek için kullanılır olmuşturAyrıca transkripsiyon başlama etkisini gösteren mplex 12, 28, 26 faktörleri ve 29 açık promotundan dinamik mimari kompleks. Ayrıca, NPS transkripsiyon uzama faktörü Spt4 / 5 31 ile aynı merkezine yarışmalı olarak bağlandığı transkripsiyon başlatma faktörü TFE pozisyonuna arke RNA polimeraz açık kompleks 30 ve özellikle de bir yapı ortaya çıkarmak için kullanıldı. O zamandan beri, smFRET göre yapısal yaklaşımlar bir takım 15, 18, 21, 23 yayınlanmıştır. Farklı smFRET merkezli yapısal yöntemleri karşılaştırıldığında, yöntemin belirgin hassas boya modelleri özellikle tercih son derece bağımlı olduğu ortaya çıkıyor. Bir dikkat etmelisinizboya molekülleri kendi yerel ortama bağlı olarak farklı mekansal ve yönelim davranışlar gösterebilir. Bu amaçla, Fast-NPS 32 tanıtıldı. Hızlı NPS ölçüde hesaplama sürelerini azaltarak gelişmiş bir örnekleme algoritması kullanır. Ayrıca, Hızlı NPS bir yapısal analiz yapmak ve her boya molekülü için kullanıcının bir sonraki tarif edilecektir beş farklı boya modelleri bir dizi seçebilirsiniz sağlar. Klasik olarak adlandırılan en muhafazakar model, boya tek, ancak bilinmeyen, konuma sahiptir varsayar. Bu pozisyonda, flüorofor, büyüklüğü, ilgili (zamana bağlı) Fosforlu anisotropi, belirlenen bir koni içinde serbest dönebilir. koni oryantasyon mesafeler içine ölçülen smFRET verimlilik dönüştürürken büyük belirsizlikler yol açar, bilinmemektedir. diğer boya moduna göre en küçük hassas yol açacaktır çünkü bu bağlamda, modeli, muhafazakarls. Sadece çok kısa mesafeler için gereken farkedilir yanlış pozisyon tayin klasik modeli kurşun tarafından yapılan varsayımlar. Tipik smFRET değerleri için doğru pozisyonu her zaman nispeten büyük inandırıcı hacim içine alınır. Daha yüksek hassasiyet arzu edilir çünkü Ancak, geliştirmek ve hassasiyeti geliştirmek için yardımcı olabilir alternatif boya modelleri, test etmek önemlidir. Boya içsel floresans ömrü çok daha hızlı dönerse, sözde ISO modeli uygulanabilir. Burada, 2 k yönlenme faktörü (karakteristik izotropik Förster çapındaki hesaplanması için gerekli olan <img alt="denklem 1" src="/files/ftp_upload/54782/54782eq4.jpg" /> ) 2/3 olarak ayarlanır. Klasik modeli 32 ile karşılaştırıldığında bir sonucu olarak, hesaplanan güvenilir bir hacim küçük büyüklük yaklaşık iki emirleri. Hızlı reori sadece sağlayan fluorofor bir ortamda bulunması halindetüm erişilebilir hacmi üzerinde entation, ancak ek olarak, hızlı hareket, meanpos-izo modeli kullanılır. Bu modelde, boya etkin bir mekansal ortalama bir polinom mesafe dönüşüm 15 ile açıklanabilir sadece bir ortalama konumunu kaplar. (Örneğin, genel olarak hidrofobik) boyası bir hidrofilik bölge, örneğin, DNA eklenmiş, bu model, geçerlidir. Meanpos-izo modeli uygulaması yaklaşık iki faktörü ile güvenilir bir hacim büyüklüğünde daha da azalmasına neden olmaktadır. Bununla birlikte, bir proteine ​​bağlı bir boya olarak, sterik olarak erişilebilir birim (AV) çeşitli hidrofobik yamalara tersinir olarak bağlanan olabilir. Anında bu bölgeler arasındaki geçiş, ancak bir bölgede serbest rotasyon uğrar ve içinde hızlı lokalize hareket en iyi var-meanpos-iso modeli ile tarif edilen bir fluorofor. Benzer bir durum için hangi boya modeli geçerlidir var-meanpos döndürmek için özgür değildir. Daha d<html> Bu modelleri hakkında etails bizim son yayında 32 bulunabilir. Bu modeller, özellikle boya karşılaşabileceğiniz çeşitli ortamlarda hesabını ve bunları uygulamak akıllıca yerelleştirme hassasiyetini optimize etmek kapsamlı bir repertuar sunar. Hızlı NPS içinde belirli bir konuma bağlı her boya molekülü FRET ortakları farklı modelleri var izin verilen şekilde, tek bir modele atanabilir. Bu sınırsız ve yakın-doğa modelleme sağlar. Ancak, son bir modelin kombinasyonu ile elde edilen sonuçlar deneysel verilerle uyum içinde hala olduğundan emin olmak için sıkı istatistiksel testler gerçekleştirir önemlidir. Bu testler Hızlı NPS yazılım yer almaktadır. deneysel verilere Hızlı NPS uygulamak için (sadece) üç giriş parametreleri ölçümü gereklidir. İlk olarak, boya çift, spesifik bir izotropik Förster yarıçapları (/54782/54782eq5.jpg &quot;/&gt;) Tespit edilecek olan donör boya. Bu nedenle, kuantum verimi (QY), donör floresans emisyon spektrumu ve alıcı absorpsiyon spektrumları ölçülmüş olması gerekir. Bu ölçümler de gerçekleştirilebilir standart bir spektrometre ve standart bir floresan spektrometresi kullanılarak toplu. her bir çiftin, R, 0, sonra ücretsiz PhotochemCAD kullanılarak hesaplanır ve NPS analizinde kullanılabilir. Ayrıca, boya moleküllerinin (zaman çözüldü) floresans, anizotropik mi bir polarizasyon (ve zaman) duyarlı flüoresan spektrometresi kullanılarak elde edilmesi. Bununla birlikte, hızlı-NPS için en önemli giriş parametreleri, toplam iç yansıma flüoresans mikroskobu (TIRFM) gibi tek moleküllü floresan mikroskopi kurulum ölçülen smFRET verimliliği vardır . Burada, smFRET verileri elde etmek ve Hızlı NPS (Şekil 1) uygulamak için bir adım adım protokol mevcut.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Flowchamber preparation&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Customized metall sample holder</td><td>self-built</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>quartz-glass slides, 76&amp;nbsp;mm x 26&amp;nbsp;mm</td><td>Technical Glass Products</td><td>26007</td><td></td></tr><tr><td>coverslips, 60 mm x 24&amp;nbsp;mm</td><td>Marienfeld</td><td>101242</td><td></td></tr><tr><td>detergent, Hellmanex II</td><td>Hellma</td><td>320.001</td><td></td></tr><tr><td>ultra-pure water from Synergy UV</td><td>Millipore</td><td>2512600</td><td></td></tr><tr><td>Zepto plasma cleaner</td><td>Diener</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>(3-aminopropyl)-triethoxysilane, p.a.</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3648</td><td></td></tr><tr><td>methoxy PEG-succinimidyl valerate, 5 kDa</td><td>Laysan Bio Inc.</td><td>MPEG-SVA-5000-1g</td><td></td></tr><tr><td>biotinylated PEG-succinimidyl valerate, 5 kDa</td><td>Laysan Bio Inc.</td><td>BIOTIN-PEG-SVA-5000</td><td></td></tr><tr><td>Sodium biocarbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761 Sigma&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sodium carbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2127 Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>sealing film (Nescofilm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12981805</td><td></td></tr><tr><td>Tygon Flexible Silicone Tubing, 0.8&amp;nbsp;mm ID, 2.4&amp;nbsp;mm OD</td><td>Saint-Gobain Performance Plastics</td><td>720958</td><td></td></tr><tr><td>Fine-Bore Polyethylene Tubing, 0.58 mm ID, 0.96 mm OD (Smiths Medical)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12665497</td><td></td></tr><tr><td>Neutravidin</td><td>Life Technologies</td><td>A2666</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Total internal reflection fluorescence microscope&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Nd:YAG Laser, 532 nm</td><td>Newport Spectra-Physics</td><td>EXLSR-532-100-CDRH</td><td></td></tr><tr><td>diode-pumped solid-state laser, 491 nm, Calypso</td><td>Cobolt</td><td>904010050</td><td></td></tr><tr><td>diode laser 643 nm, iBeam smart</td><td>Toptica</td><td>iBEAM-SMART-640-S</td><td></td></tr><tr><td>dichroic mirror, 532 RDC</td><td>Chroma</td><td>F33-540</td><td></td></tr><tr><td>dichroic mirror, 476 RDC</td><td>Chroma</td><td>F33-476z</td><td></td></tr><tr><td>acousto-optic tunable filter</td><td>AA Opto-Electronic</td><td>AOTFnC-VIS</td><td></td></tr><tr><td>plano-convex cylindrical lens, f = 75 mm</td><td>Thorlabs</td><td>LJ1703L1-A</td><td></td></tr><tr><td>plano-concave cylindrical, f = -300&amp;nbsp;mm</td><td>Thorlabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>prism, PS 991</td><td>Thorlabs</td><td>PS991</td><td></td></tr><tr><td>focusing lens, f = 75&amp;nbsp;mm</td><td>Thorlabs</td><td>LA1608-B</td><td></td></tr><tr><td>syringe pump, PHD 2000</td><td>Harvard Apparatus</td><td>70-2002</td><td></td></tr><tr><td>2 stepper motors, Z812B</td><td>Thorlabs</td><td>Z812B</td><td></td></tr><tr><td>piezoelectric actuator, PE4</td><td>Thorlabs</td><td>PE4</td><td></td></tr><tr><td>IR diode laser</td><td>Edmund Optics</td><td>CPS808</td><td>part of the autofocus system</td></tr><tr><td>dichroic mirror, 775 DCXR</td><td>Chroma</td><td>775 DCXR</td><td></td></tr><tr><td>position-sensing detector (PSD), PDP90A</td><td>Thorlabs</td><td>PDP90A</td><td>part of the autofocus system</td></tr><tr><td>water-immersion objective, Plan Apo 60X WI, NA 1.2</td><td>Nikon</td><td></td><td>MRD07601</td></tr><tr><td>dichroic mirror, 645 DCXR</td><td>Chroma</td><td>645 DCXR</td><td>part of the emission pathway</td></tr><tr><td>emission filter, 3RD550-510</td><td>Omega Optical</td><td>3RD550-510</td><td>green channel in the emission pathway</td></tr><tr><td>emission filter, 3RD660-760</td><td>Omega Optical</td><td>3RD660-760</td><td>red channel in the emission pathway</td></tr><tr><td>EMCCD camera, iXon+ DU897EBV</td><td>Andor</td><td>AND-20-00032</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD camera, iXon3 DU897D-BV</td><td>Andor</td><td>AND-20-000141</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Miscellaneous&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Varian 50</td><td>Cary</td><td></td><td>UV-VIS spectrometer</td></tr><tr><td>Fluorolog2</td><td>SPEX</td><td></td><td>fluorescence spectrometer</td></tr><tr><td>Solis (V4.15)</td><td>Andor</td><td></td><td>control software for the EM-CCD camera</td></tr><tr><td>Apt user utility&amp;nbsp; (V1.022)</td><td>Thorlabs</td><td></td><td>control software for the piezo-motors</td></tr><tr><td>Norland Optical Adhesive 68</td><td>Thorlabs</td><td></td><td>adhesive</td></tr><tr><td>PC-AFN-0.8 Nile red</td><td>Kisker Biotech</td><td></td><td>avidin-coated fluorescent multispec beads&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td></td><td>technical computing language for custon written software</td></tr><tr><td>Origin (V9.0)</td><td>Originlab</td><td></td><td>scientific graphing and data analysis software</td></tr><tr><td>Hellma 105-202-15-40</td><td>Hellma</td><td>105-202-15-40</td><td>absorption cuvette of 1&amp;nbsp;cm path length</td></tr><tr><td>Hellma 105-251-15-40</td><td>Hellma</td><td>105-251-15-40</td><td>fluorescence cuvette with 3 mm path length</td></tr></tbody></table>

structural information from single-molecule fret experiments using the fast nano-positioning system

Single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET) can be used to obtain structural information on biomolecular complexes in real-time. Thereby, multiple smFRET measurements are used to localize an unknown dye position inside a protein complex by means of trilateration. In order to obtain quantitative information, the Nano-Positioning System (NPS) uses probabilistic data analysis to combine structural information from X-ray crystallography with single-molecule fluorescence data to calculate not only the most probable position but the complete three-dimensional probability distribution, termed posterior, which indicates the experimental uncertainty. The concept was generalized for the analysis of smFRET networks containing numerous dye molecules. The latest version of NPS, Fast-NPS, features a new algorithm using Bayesian parameter estimation based on Markov Chain Monte Carlo sampling and parallel tempering that allows for the analysis of large smFRET networks in a comparably short time. Moreover, Fast-NPS allows the calculation of the posterior by choosing one of five different models for each dye, that account for the different spatial and orientational behavior exhibited by the dye molecules due to their local environment.
Here we present a detailed protocol for obtaining smFRET data and applying the Fast-NPS. We provide detailed instructions for the acquisition of the three input parameters of Fast-NPS: the smFRET values, as well as the quantum yield and anisotropy of the dye molecules. Recently, the NPS has been used to elucidate the architecture of an archaeal open promotor complex. This data is used to demonstrate the influence of the five different dye models on the posterior distribution.

Transkripsiyon bütün organizmalarda gen ifadesi ilk adımdır. Archaea olarak, transkripsiyon, tek bir RNA polimeraz (rnap) tarafından yürütülmektedir. ökaryotlar ile karşılaştırıldığında, arke rnap basit bir transkripsiyonel makine yaparken kendi ökaryotik meslektaşları çarpıcı bir yapısal benzerlik taşımaktadır. Bu nedenle, Archaea, RNA polimeraz II (pol II), ökaryotik transkripsiyon inisiyasyon çalışmak için bir model sistem olarak kullanılır. Son zamanlarda, arke RNA polimeraz açık kompleksinin tam mimarisi, tek moleküllü FRET ve NPS tespit edilmiştir. NPS analiz veri transkripsiyon başlama mekanizması yararlı bilgiler sağlar tam arke açık yükseltici kompleksi, bir model oluşturmak için kullanıldı. Bu yapıyı aydınlatmak için smFRET verimlilikleri açık yükseltici com içinde yer alan bilinmeyen anten boya molekülleri arasında ölçüldüplex ve pozisyonları kristalografik yapıların (pdb-ID: 2WAQ) bilinmektedir rnap, beş referans sitelerinde dahil edildi bilinen çeşitli uydu boya molekülleri 37. Anten boyalar olmayan şablon DNA, Araç kullanmayın, TBP ve TFE farklı pozisyonların biri birine bağlanmıştır. Bu çalışmada kullanılan network 60&#39;dan ölçülen uzaklığın oluşturmaktadır. Şekil 7 NPS analizi yapılmış tam arke açık yükseltici kompleksinin modelini göstermektedir. Bu çift sarmallı promoter DNA (açık ve koyu mavi), (gri) RNA Polimeraz ve transkripsiyon başlatma (mor) TBP faktörleri içermektedir, TFB (yeşil) ve TFE (sarı). Model, klasik bir model (A), ISO modeli (B) kullanılarak hesaplandı NPS analizi, güvenilir bir hacim, meanpos-izo modeli (C), var-meanpos-izo modelinden elde edilen sonuçlar ile üstüste bindirilmiştir (D) ve var-meanpos<html> modeli (E). <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54782/54782fig1.jpg" /> Şekil 1: Hızlı NPS hesaplanması için gerekli parametrelerin elde edilmesi ve işlenmesi iş akışı. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54782/54782fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54782/54782fig2.jpg" /> Şekil 2: smFRET olayı örnek floresan yoğunluğu zaman iz. smFRET II: verici (yeşil) ve üç karakteristik faz, yani bir gösteren alıcı molekül (kırmızı) floresans yoğunlukları verici floresans alıcı ışıkla ağartma sonra III donör Photobleaching sonra eşiğe.g2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54782/54782fig3.jpg" /> Şekil 3: smFRET deneyler için akış odasının şematik gösterimi. Akış odası akrilik cam tutucular ile özelleştirilmiş metal tutucu üzerine monte edilir. akış odasının sandviç tasarımı kuvars cam (erimiş silika) giriş ve çıkış boruları, bir sızdırmazlık filmi ve akış odası kapatan bir lamel bağlanması için iki delikli slayt oluşmaktadır. TIRF aydınlatma için prizma akış odasının alt yarısına üzerine monte edilir. Içi boş sekme vidalar akış odasına için giriş ve çıkışları sağlamak. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54782/54782fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img<html> alt = &quot;Şekil 4&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 54782 / 54782fig4.jpg&quot; /&gt; Şekil 4: kuvars cam slayt ve conta filmin hazırlanması. (Milimetre verilen) deliklerin konumlarını gösteren kuvars cam slayt mekanik çizim. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54782/54782fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/54782/54782fig5.jpg" /> Şekil 5: akış odasının mekanik çizim. cam tutucular ve alüminyum montaj çerçevesi akrilik alüminyum prizma tutucu önlemler, milimetre olarak verilmiştir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54782/54782fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> ŞEKIL 6 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 54782 / 54782fig6.jpg &quot;/&gt; Şekil 6: smFRET deneyleri için kullanılan prizma tipi TIRF kurulum şematik gösterimi. Optik bileşenlerin kısaltmaları: A, diyafram; DM, dikroik ayna; F emisyon filtresi; L, lens; M, ayna; Objektif O; P, prizma; PSD, pozisyon duyarlı foto-diyot; S, örnek; PS, konumlandırma aşaması; T, teleskop. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54782/54782fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 7," src="/files/ftp_upload/54782/54782fig7.jpg" /> Şekil 7: Farklı model varsayımlarının Simülasyon sonuçları. Tüm resimler arke RNA polimeraz gösterir: birlikte geliştirici DNA (sırasıyla T-DNA ve mavi ntDNA ve mavi) için model ile (pdb-ID 2WAQ, üstten görünüm), TBP (mor), TFB (yeşil) ve TFE (sarı)arke karmaşık 30 açın. Güvenilir hacimleri (A) klasik modeli, (B) iso modeli, (C) meanpos-iso modeli, (D) var-meanpos-iso modeli ve (E) değişkenin NPS simülasyon sonuçları için üst üste -meanpos modeli. Tüm birimler% 68 güvenilirlik gösterilmektedir. Klasik ve var-meanpos ağları smFRET verileri ile uyumludur. Buna karşılık, bütün boyalar için iso, meanpos-iso veya var-meanpos-iso modeli seçilir ağlar ölçülen verilerle tutarsız. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54782/54782fig7large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Structural Information from Single-molecule FRET Experiments Using the Fast Nano-positioning System at JoVE.com

Structural Information from Single-molecule FRET Experiments Using the Fast Nano-positioning System

We present the setup and experimental procedure to obtain smFRET data from large donor-acceptor networks with a TIRF microscope. The step-by-step analysis of these measurements with the Bayesian inference software Fast-NPS yields high-resolved structural information via the application of adapted dye models.

Tek molekülün yapısal bilgiler Hızlı Nano konumlandırma Sisteminin Kullanılması Deneyler FRET

Single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET) can be used to obtain structural information on biomolecular complexes in real-time. ...

structural-information-from-single-molecule-fret-experiments-using

Research

JoVE Journal

Biochemistry

12.1K Görüntüleme.  Ulm University. We present the setup and experimental procedure to obtain smFRET data from large donor-acceptor networks with a TIRF microscope. The step-by-step analysis of these measurements with the Bayesian inference software Fast-NPS yields high-resolved structural information via the application of adapted dye models.

Video: Structural Information from Single-molecule FRET Experiments Using the Fast Nano-positioning System

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule level in multiparameter fluorescence detection (MFD) mode is presented here. MFD maximizes the usage of all &#34;dimensions&#34; of fluorescence to reduce photophysical and experimental artifacts and allows for the measurement of interdye distance with an accuracy up to ~1 &#197; in rigid biomolecules. This method was used to identify three conformational states of the ligand-binding domain of the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor to explain the activation of the receptor upon ligand binding. When comparing the known crystallographic structures with experimental measurements, they agreed within less than 3 &#197; for more dynamic biomolecules. Gathering a set of distance restraints that covers the entire dimensionality of the biomolecules would make it possible to provide a structural model of dynamic biomolecules.

A protocol for high-precision FRET experiments at the single molecule level is presented here. Additionally, this methodology can be used to identify three conformational states in the ligand-binding domain of the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor. Determining precise distances is the first step towards building structural models based on FRET experiments.

Biyomolekül Yapısının Belirlenmesi İçin Tek Molekül Seviyesinde Yüksek Hassasiyetteki FRET

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Biyokimya

Atomic Force Microscopy of Red-Light Photoreceptors Using PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping

Atomic force microscopy (AFM) uses a pyramidal tip attached to a cantilever to probe the force response of a surface. The deflections of the tip can be measured to ~10 pN by a laser and sectored detector, which can be converted to image topography. Amplitude modulation or &#8220;tapping mode&#8221; AFM involves the probe making intermittent contact with the surface while oscillating at its resonant frequency to produce an image. Used in conjunction with a fluid cell, tapping-mode AFM enables the imaging of biological macromolecules such as proteins in physiologically relevant conditions. Tapping-mode AFM requires manual tuning of the probe and frequent adjustments of a multitude of scanning parameters which can be challenging for inexperienced users. To obtain high-quality images, these adjustments are the most time consuming.
PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) produces an image by measuring a force response curve for every point of contact with the sample. With ScanAsyst software, PF-QNM can be automated. This software adjusts the set-point, drive frequency, scan rate, gains, and other important scanning parameters automatically for a given sample. Not only does this process protect both fragile probes and samples, it significantly reduces the time required to obtain high resolution images. PF-QNM is compatible for AFM imaging in fluid; therefore, it has extensive application for imaging biologically relevant materials.
The method presented in this paper describes the application of PF-QNM to obtain images of a bacterial red-light photoreceptor, RpBphP3 (P3), from photosynthetic R. palustris in its light-adapted state. Using this method, individual protein dimers of P3 and aggregates of dimers have been observed on a mica surface in the presence of an imaging buffer. With appropriate adjustments to surface and/or solution concentration, this method may be generally applied to other biologically relevant macromolecules and soft materials.

A method for investigating the structure of a protein photoreceptor using atomic force microscopy (AFM) is described in this paper. PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) reveals intact protein dimers on a mica surface.

PeakForce Kantitatif Nanomekanik Gayrimenkul Eşleme Kullanma Kırmızı Işık fotoreseptör Atomik Kuvvet Mikroskobu

Atomic force microscopy (AFM) uses a pyramidal tip attached to a cantilever to probe the force response of a surface. The deflections of the tip can be ...

Mühendislik

Investigating Single Molecule Adhesion by Atomic Force Spectroscopy

Atomic force spectroscopy is an ideal tool to study molecules at surfaces and interfaces. An experimental protocol to couple a large variety of single molecules covalently onto an AFM tip is presented. At the same time the AFM tip is passivated to prevent unspecific interactions between the tip and the substrate, which is a prerequisite to study single molecules attached to the AFM tip. Analyses to determine the adhesion force, the adhesion length, and the free energy of these molecules on solid surfaces and bio-interfaces are shortly presented and external references for further reading are provided. Example molecules are the poly(amino acid) polytyrosine, the graft polymer PI-g-PS and the phospholipid POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine). These molecules are desorbed from different surfaces like CH3-SAMs, hydrogen terminated diamond and supported lipid bilayers under various solvent conditions. Finally, the advantages of force spectroscopic single molecule experiments are discussed including means to decide if truly a single molecule has been studied in the experiment.

A protocol to couple a large variety of single molecules covalently onto an AFM tip is presented. Procedures and examples to determine the adhesion force and free energy of these molecules on solid supports and bio-interfaces are provided.

Atomik Kuvvet Spektroskopi Tek Molekül Yapışma incelenmesi

Atomic force spectroscopy is an ideal tool to study molecules at surfaces and interfaces. An experimental protocol to couple a large variety of single ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and functions. It gave us the opportunity to explore a multiplicity of biophysical mechanisms, e.g., how bacterial adhesins bind to host surface receptors in more detail. Among other factors, the success of SMFS experiments depends on the functional and native immobilization of the biomolecules of interest on solid surfaces and AFM tips. Here, we describe a straightforward protocol for the covalent coupling of proteins to silicon surfaces using silane-PEG-carboxyls and the well-established N-hydroxysuccinimid/1-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimid (EDC/NHS) chemistry in order to explore the interaction of pilus-1 adhesin RrgA from the Gram-positive bacterium Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) with the extracellular matrix protein fibronectin (Fn). Our results show that the surface functionalization leads to a homogenous distribution of Fn on the glass surface and to an appropriate concentration of RrgA on the AFM cantilever tip, apparent by the target value of up to 20% of interaction events during SMFS measurements and revealed that RrgA binds to Fn with a mean force of 52 pN. The protocol can be adjusted to couple via site specific free thiol groups. This results in a predefined protein or molecule orientation and is suitable for other biophysical applications besides the SMFS.

This protocol describes the covalent immobilization of proteins with a heterobifunctional silane coupling agent to silicon-oxide surfaces designed for the atomic force microscopy based single molecule force spectroscopy which is exemplified by the interaction of RrgA (pilus-1 tip adhesin of S. pneumoniae) with fibronectin.

Proteinler kovalent immobilizasyon için tek molekül kuvvet spektroskopisi

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Automated System for Single Molecule Fluorescence Measurements of Surface-immobilized Biomolecules

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopy has been widely used to study the structure and dynamics of molecules of biological interest, such as nucleic acids and proteins. Single molecule FRET (sm-FRET) measurements on immobilized molecules permit long observations of the system -effectively until both dyes photobleach- resulting in time-traces that report on biomolecular dynamics with a broad range of timescales from milliseconds to minutes. To facilitate the acquisition of large number of traces for statistical analyses, the process must be automated and the sample environment should be tightly controlled over the entire measurement time (~12 hours). This is accomplished using an automated scanning confocal microscope that allows the interrogation of thousands of single molecules overnight, and a microfluidic cell that permits the controlled exchange of buffer, with restricted oxygen content and maintains a constant temperature throughout the entire measuring period. Here we show how to assemble the microfluidic device and how to activate its surface for DNA immobilization. Then we explain how to prepare a buffer to maximize the photostability and lifetime of the fluorophores. Finally, we show the steps involved in preparing the setup for the automated acquisition of time-resolved single molecule FRET traces of DNA molecules.

In this article we describe how we obtain FRET traces from individual DNA molecules immobilized to a surface using an automated scanning confocal microscope.

Yüzey immobilize Biyomoleküller Tek Molekül Floresans Ölçümler için Otomatik Sistem

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopy has been widely used to study the structure and dynamics of molecules of biological interest, ...

Biyoloji

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One &#945;-Synuclein Monomer at a Time

Using spectroscopic rulers to track multiple conformations of single biomolecules and their dynamics have revolutionized the understanding of structural dynamics and its contributions to biology. While the FRET-based ruler reports on inter-dye distances in the 3-10 nm range, other spectroscopic techniques, such as protein-induced fluorescence enhancement (PIFE), report on the proximity between a dye and a protein surface in the shorter 0-3 nm range. Regardless of the method of choice, its use in measuring freely-diffusing biomolecules one at a time retrieves histograms of the experimental parameter yielding separate centrally-distributed sub-populations of biomolecules, where each sub-population represents either a single conformation that stayed unchanged within milliseconds, or multiple conformations that interconvert much faster than milliseconds, and hence an averaged-out sub-population. In single-molecule FRET, where the reported parameter in histograms is the inter-dye FRET efficiency, an intrinsically disordered protein, such as the &#945;-Synuclein monomer in buffer, was previously reported as exhibiting a single averaged-out sub-population of multiple conformations interconverting rapidly. While these past findings depend on the 3-10 nm range of the FRET-based ruler, we sought to put this protein to the test using single-molecule PIFE, where we track the fluorescence lifetime of site-specific sCy3-labeled &#945;-Synuclein proteins one at a time. Interestingly, using this shorter range spectroscopic proximity sensor, sCy3-labeled &#945;-Synuclein exhibits several lifetime sub-populations with distinctly different mean lifetimes that interconvert in 10-100 ms. These results show that while &#945;-Synuclein might be disordered globally, it nonetheless attains stable local structures. In summary, in this work we highlight the advantage of using different spectroscopic proximity sensors that track local or global structural changes one biomolecule at a time.

Time-resolved single-molecule protein-induced fluorescence enhancement is a useful fluorescence spectroscopic proximity sensor sensitive to local structural changes in proteins. Here we show it can be used to uncover stable local conformations in &#945;-Synuclein, which is otherwise known as globularly unstructured and unstable when measured using the longer range FRET ruler.

Kararlı Yerel Konformasyonları Belirlemek için Zaman Çözümlenmiş Protein Kaynaklı Floresan Geliştirmeyi Kullanmak Bir Seferde Bir α-Synuclein Monomer

Using spectroscopic rulers to track multiple conformations of single biomolecules and their dynamics have revolutionized the understanding of structural ...

A Protocol for Using F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. Nesprin-2G is a key component of the LINC complex that connects the actin cytoskeleton to membrane proteins (SUN domain proteins) in the perinuclear space. These membrane proteins connect to lamins inside the nucleus. Recently, a F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force probe was cloned into mini-Nesprin-2G (Nesprin-TS (tension sensor)) and used to measure tension across Nesprin-2G in live NIH3T3 fibroblasts. This paper describes the process of using Nesprin-TS to measure LINC complex forces in NIH3T3 fibroblasts. To extract FRET information from Nesprin-TS, an outline of how to spectrally unmix raw spectral images into acceptor and donor fluorescent channels is also presented. Using open-source software (ImageJ), images are pre-processed and transformed into ratiometric images. Finally, FRET data of Nesprin-TS is presented, along with strategies for how to compare data across different experimental groups.

A number of FRET-based force biosensors have recently been developed, enabling the protein-specific resolution of intracellular force. In this protocol, we demonstrate how one of these sensors, designed for the linker of the nucleoskeleton-cytoskeleton (LINC) complex protein Nesprin-2G can be used to measure actomyosin forces on the nuclear LINC complex.

Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET) -force biyosensörlerin kullanılması için Protokol Nükleer LINC Kompleksi karşısında Mekanik Kuvvetleri Ölçmek için

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. ...

Biyomühendislik

High-Speed Magnetic Tweezers for Nanomechanical Measurements on Force-Sensitive Elements

Single-molecule magnetic tweezers (MTs) have served as powerful tools to forcefully interrogate biomolecules, such as nucleic acids and proteins, and are therefore poised to be useful in the field of mechanobiology. Since the method commonly relies on image-based tracking of magnetic beads, the speed limit in recording and analyzing images, as well as the thermal fluctuations of the beads, has long hampered its application in observing small and fast structural changes in target molecules. This article describes detailed methods for the construction and operation of a high-resolution MT setup that can resolve nanoscale, millisecond dynamics of biomolecules and their complexes. As application examples, experiments with DNA hairpins and SNARE complexes (membrane-fusion machinery) are demonstrated, focusing on how their transient states and transitions can be detected in the presence of piconewton-scale forces. We expect that high-speed MTs will continue to enable high-precision nanomechanical measurements on molecules that sense, transmit, and generate forces in cells, and thereby deepen our molecular-level understanding of mechanobiology.

Here, we describe a high-speed magnetic tweezer setup that performs nanomechanical measurements on force-sensitive biomolecules at the maximum rate of 1.2 kHz. We introduce its application to DNA hairpins and SNARE complexes as model systems, but it will be also applicable to other molecules involved in mechanobiological events.

Kuvvete duyarlı elemanlarda nanomekanik ölçümler için yüksek hızlı manyetik cımbız

Single-molecule magnetic tweezers (MTs) have served as powerful tools to forcefully interrogate biomolecules, such as nucleic acids and proteins, and are ...

Automated Two-dimensional Spatiotemporal Analysis of Mobile Single-molecule FRET Probes

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) is a versatile technique reporting on distances in the sub-nanometer to nanometer range. It has been used in a wide range of biophysical and molecular biological experiments, including the measurement of molecular forces, characterization of conformational dynamics of biomolecules, observation of intracellular colocalization of proteins, and determination of receptor-ligand interaction times. In a widefield microscopy configuration, experiments are typically performed using surface-immobilized probes. Here, a method combining single-molecule tracking with alternating excitation (ALEX) smFRET experiments is presented, permitting the acquisition of smFRET time traces of surface-bound, yet mobile probes in plasma membranes or glass-supported lipid bilayers. For the analysis of recorded data, an automated, open-source software collection was developed supporting (i) the localization of fluorescent signals, (ii) single-particle tracking, (iii) determination of FRET-related quantities including correction factors, (iv) stringent verification of smFRET traces, and (v) intuitive presentation of the results. The generated data can conveniently be used as input for further exploration via specialized software, e.g., for the assessment of the diffusional behavior of probes or the investigation of FRET transitions.

This article presents a method for spatiotemporal analysis of mobile, single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET)-based probes using widefield fluorescence microscopy. The newly developed software toolkit allows the determination of smFRET time traces of moving probes, including the correct FRET efficiency and the molecular positions, as functions of time.

Mobil Tek Moleküllü FRET Problarının Otomatik İki Boyutlu Mekansal Analizi

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) is a versatile technique reporting on distances in the sub-nanometer to nanometer range. ...

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in the x-y plane. Here a summary of the FIONA technique is reported and examples of research that have been performed using FIONA are briefly described. First, how to set up the required equipment for FIONA experiments, i.e., a total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), with details on aligning the optics, is described. Then how to carry out a simple FIONA experiment on localizing immobilized Cy3-DNA single molecules using appropriate protocols, followed by the use of FIONA to measure the 36 nm step size of a single truncated myosin Va motor labeled with a quantum dot, is illustrated. Lastly, recent effort to extend the application of FIONA to thick samples is reported. It is shown that, using a water immersion objective and quantum dots soaked deep in sol-gels and rabbit eye corneas (&#62;200 &#181;m), localization precision of 2-3 nm can be achieved.

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy FIONA

Single fluorophores can be localized with nanometer precision using FIONA. Here a summary of the FIONA technique is reported, and how to carry out FIONA experiments is described.

Bir nanometre Hassasiyet Floresans Görüntüleme (Fiona)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in ...