Bu protokol, belirli bir substratın bir E3 ligaz tarafından ubikitilasyonunu değerlendirmeyi sağlar. Ligaz-substrat etkileşiminin karakterizasyonunun, hücrelerdeki işlevlerini anlamak için çok önemli olduğunu biliyoruz. Bu teknik pahalı reaktifler veya sofistike ekipman gerektirmez.
Plazmidlere ve ilgilenilen genleri kodlamaya, hücre lizatları ile bir immünopresipitasyon testi geliştirmeye ve substrat ubikitilasyonunu tespit etmek için bir Batı lekesine ihtiyaç duyar. Kanser ve nörolojik bozukluklar gibi çeşitli insan hastalıkları, E3 ligazın düzensizliği ile ilişkilidir. Bu nedenle, substrat ubikitilasyonunun spesifik E3 ligaz ile tanımlanması, bu hastalıkların tedavisinde veya teşhisinde yardımcı olabilir.
Prosedürün gösterilmesi Valentine Spagnol tarafından yapılacaktır. Başlamak için, HEK293T hücre hattını% 10 fetal sığır serumu ve 100 birim penisilin, 100 mikrogram streptomisin ve mililitre L-glutamin başına 0.292 miligram ile desteklenmiş Dulbecco'nun modifiye Eagles ortamında 80 ila% 90 oranında birleştirin. Daha sonra, bu kültürü% 5 karbondioksit içinde nemlendirilmiş bir hücre kültürü inkübatöründe 37 santigrat derecede inkübe edin.
Serolojik bir pipet kullanarak ortamı kültür kabından aspire ederek hücreleri geçirin ve bir mililitre sterilize edilmiş 1X PBS ile bir kez yıkayın. Daha sonra, bir mililitre tripsin etilendiamintetraasetik asit çözeltisi ekleyerek hücreleri ayırın ve 37 santigrat derecede beş dakikalık inkübasyondan sonra, bu hücreleri serolojik bir pipet kullanarak iki mililitre büyüme ortamında yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonunu taze ve temiz 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca 500 kez G'de santrifüj yapın.
Daha sonra, süpernatantı yavaşça çıkarın ve homojen bir hücre süspansiyonu elde etmek için yukarı ve aşağı pipetle çekerek hücre peletini üç mililitre büyüme ortamında yeniden askıya alın. Daha sonra, bu hücre süspansiyonunun bir mililitresini, dokuz mililitre büyüme ortamı içeren 100 milimetrelik TC ile işlenmiş bir kültür kabına aktarın. Transfeksiyondan önce, hücrelerin kontaminasyondan arındırılmış olup olmadığını ve geçici transfeksiyonlar için yeterli bir birleşimde olup olmadığını onaylayın.
Her transfeksiyon numunesi için, DNA-polietilenimin komplekslerini, her plazmidin üç mikrogramını 100 mikrolitre Opti-MEM 1 indirgenmiş serum ortamında takviye edilmeden seyrelterek ve çözeltiyi yukarı ve aşağı pipetleyerek nazikçe karıştırarak hazırlayın. Daha sonra, DNA-polietilendimini oda sıcaklığında çözün ve bir mikrogram DNA başına üç mikrolitre DNA-polietilenimin oranını takiben çözeltiye ekleyin. Çözeltiyi yukarı ve aşağı pipetleyerek homojenize edin.
Daha sonra, DNA-polietilenimin komplekslerinin oluşumuna izin vermek için oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. DNA-polietilenimin komplekslerinin toplam hacmini hücre kültürünü içeren her kaba ekleyin ve tabağı ileri geri sallayarak hafifçe karıştırın. Daha sonra, bu hücreleri nemlendirilmiş bir hücre kültürü inkübatöründe 37 santigrat derecede inkübe edin.
Kuluçkadan sonra ve hücre lizisinden altı saat önce, transfekte edilmiş hücreleri 10-mikromolar proteazom inhibitörü MG132 ile tedavi edin ve nemlendirilmiş hücre kültürü inkübatöründe hücreleri inkübe edin. Daha sonra, serolojik bir pipet kullanarak her kültür kabındaki ortamı aspire edin ve hücreleri bir mililitre 1X PBS ile bir kez yıkayın. Daha sonra, bir mililitre tripsin ekleyerek hücreleri ayırın ve kabı beş dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.
Hücreleri bir mililitre büyüme ortamında yeniden askıya alın ve hücre süspansiyonunu taze ve temiz iki mililitrelik bir mikrotüpe aktarın ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca 500 kez G'de santrifüj yapın. Santrifüjleme bittikten sonra, süpernatantı dikkatlice dökerek çıkarın ve proteaz ve fosfataz inhibitörleri kokteyli ile desteklenmiş 200 mikrolitre buz gibi soğuk MP40 lizis tamponunda hücre peletini nazikçe yeniden askıya alın. Daha sonra bu çözeltiyi temiz bir 1.5 mililitrelik mikrotüpe aktarın.
Bu hücre lizatını buz üzerinde 30 dakika boyunca inkübe edin ve inkübasyondan sonra, hücre lizatlarını dört santigrat derecede 20 dakika boyunca 16.900 kez G'de santrifüj edin. Bu arada, agaroz anti-HA boncuklarını buz gibi soğuk MP40 lizis tamponu ile dengeleyin. Her numune için 15 mikrolitre agaroz anti-HA boncuk kullanın.
Boncukları 200 mikrolitre MP40 lizis tamponu ile yıkayarak 3.000 kez G'de bir mikro santrifüj tüpünde dört santigrat derecede bir dakika boyunca darbelendirin. Daha sonra, süpernatantı bir pipetle dikkatlice aspire edin ve atın ve bu işlemi üç kez tekrarlayın. Daha sonra, boncukları kullanana kadar buz üzerinde dengede tutun.
Hücre lizatlarını santrifüjledikten sonra, süpernatantı geri kazanın ve immünopresipitasyona maruz kalan her numunenin eşit miktarda protein sunmasını sağlamak için Bradford yöntemini kullanarak toplam lizattaki protein içeriğini ölçün. Gerekli hücre lizat hacmini dört saat boyunca dengelenmiş agaroz anti-HA boncukları ile inkübe edin, dönen bir inkübatörde dört santigrat derecede hafifçe döndürün, bu da UXT-V2-HA'nın agaroz anti-HA boncuklarına bağlanmasını sağlar. Agaroz anti-HA boncuklarını, dört santigrat derecede bir dakika boyunca 3.000 kez G'de bir mikrosantrifüj tüpünde atımlayarak toplayın.
Süper natantı dikkatlice aspire edin ve atın. Boncukları üç kez buz gibi soğuk MP40 hücre lizis tamponu ve iki kez buz gibi soğuk FLAG HA tamponu ile yıkayın. Son yıkamadan sonra, bir pipet kullanarak tüm süpernatantı dikkatlice çıkarın ve poli-ubikitile proteini, FLAG HA tamponu üzerinde seyreltilmiş mililitre başına 300 mikrogram HA peptidi ile etkisiz hale getirin.
Agaroz anti-HA boncuklarını, sallanan bir çalkalayıcı platformunda dört santigrat derecede bir saat boyunca HA peptidi ile inkübe edin. Daha sonra, boncukları dört santigrat derecede iki dakika boyunca 3.000 kez G'de döndürün ve poli-ubikitinlenmiş proteinleri içeren süpernatantı dikkatlice çıkarın. Gerekirse, eluent'i eksi 20 santigrat derecede taze ve temiz bir mikrotüp içinde saklayın.
Elüentleri ve hücre lizatlarını% 10 sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi ve immünoblotlama ile çözün. Islak transfer Western lekeleme işlemini gerçekleştirmek için, jeli filtre kağıdı, jel membran filtre kağıdından oluşan bir transfer sandviçinin içine yerleştirin, pedlerle yastıklayın ve bir destek ızgarası ile birlikte bastırın. Ardından, bu sistemi paslanmaz çelik veya platin tel elektrotlar arasına transfer tamponu ile dolu bir tanka dikey olarak yerleştirin.
Aktarım, ıslak bir transfer tamponunda 150 voltta 90 dakika boyunca gerçekleşir. Son olarak, anti-myc antikoru kullanarak immünoblot membranını araştırın. Hücrelerde F-box protein 7'nin aracılık ettiği UXT-V2-HA'nın spesifik poli-ubikitilasyonu, substrata konjuge edilen myc-ub'u tespit eden bir anti-myc antikoru ile anti-HA immünopresipitasyonundan elde edilen elüentin araştırılmasından sonra gözlenmiştir.
Poli-ubikitillenmiş substrat için anti-myc'nin özgüllüğü, bir ve iki şeritte görselleştirildi; burada hücreler UXT-V2-HA plazmidinin yokluğunda F-box protein 7 ve myc-ub ile birlikte transfekte edildiğinde poli-ubikitillenmiş proteinlerin bir yayması tespit edilmedi. Ek olarak, myc-ub plazmidi olmadan F-box protein 7 ve UXT-V2-HA kombinasyonunda protein poli-ubikitinasyonuna karşılık gelen hiçbir yayma görselleştirilmedi. Aktif SCF'yi bir araya getiremeyen boş vektörlü vahşi tip bir F-kutusu proteini 7 veya F-kutusu proteini 7 mutantı UXT-V2-HA ve myc-ub ile kombinasyon halinde transekte edildiğinde, sadece vahşi tip F-box protein 7 için poli-ubikitillenmiş UXT-V2'nin güçlü bir yayma sinyali gözlendi, bu da UXT-V2'nin SCF F-box protein 7 kompleksi ve kontrollere kıyasla hücreler tarafından poli-ubikitillendiğini düşündürdü.
Hücre lizatlarının dengeli boncuklarla inkübasyonu ve immünoçökeltilmiş proteinlerin elüsyonu da dahil olmak üzere mono-çökeltme adımları, bu protokolün amacına ulaşmak için esastır. Bu işlemden sonra, E3 ligaz tarafından substrat ubikitilasyonunun özgüllüğünü doğrulamak için in vitro ubikitilasyon testi yapılmalıdır.
