Bu protokolü kullanarak, belirli bir proteinin ubikitinlenmiş formları, memeli hücrelerinden verimli bir şekilde saflaştırılabilir ve bu da protein fonksiyonunun düzenlenmesinde ubikitinasyonun rolleri üzerine çalışmaları kolaylaştırır. Memeli hücrelerinde ubikitinlenmiş proteinlerin in vitro saflaştırılmasına kıyasla saflaştırılması, hedef proteinlerin ubikitin bağlantı modunu daha radyolojik koşullar altında tutar. Üç adet 15 mililitrelik santrifüj tüpüne 1,5 mililitre azaltılmış serum ortamı ekleyerek başlayın.
Her tüpe transfeksiyona hazır plazmid DNA'sı ekleyin ve transfeksiyon verimliliğini izlemek için 0.2 mikrogram yeşil floresan protein plazmidi ekleyin. Lipozomları seyreltmek için başka bir santrifüj tüpünde 4.5 mililitre azaltılmış serum ortamına 78 mikrolitre lipozom transfeksiyon reaktifi ekleyin. Tüpü hafifçe vurarak iyice karıştırın ve ardından oda sıcaklığında beş dakika bekletin.
Seyreltilmiş DNA çözeltisinin 1.5 mililitresini içeren her tüpe 1.5 mililitre seyreltilmiş lipozom çözeltisi ekleyin. İyice karıştırın ve plazmidleri oda sıcaklığında en az 20 dakika boyunca lipozomlarla çapraz bağlayın. Orijinal ortamı Petri kaplarından atın ve her bir kaba dokuz mililitre azaltılmış serum ortamı ekleyin.
Üç mililitre lipozom DNA karışımı ekleyin ve karışımın plaka üzerinde eşit dağılımı için plakayı üç kez ileri geri hafifçe sallayarak ve daha sonra üç kez sola ve sağa sallayarak çözeltiyi karıştırın. Nemlendirilmiş inkübatördeki hücreleri% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede kültürleyin. Dört ila altı saat sonra ortamı değiştirin ve hücreleri 24 ila 36 saat boyunca kültürlemeye devam edin.
24 ila 36 saat sonra, hücreleri MG132 ile dört ila altı saat boyunca 10 mikromolar nihai konsantrasyonda tedavi edin. Ortamı atın ve hücreleri buz gibi soğuk PBS ile iki kez yıkayın. Yemeğe bir mililitre PBS ekleyin.
Hücreleri temiz bir kazıyıcı ile kazıyarak çıkarın ve hücre süspansiyonunu mikrosantrifüj tüplerine aktarın. Hücre peletlerini toplamak için beş dakika boyunca 700 G'de santrifüj yapın. Her tüpteki hücrelere proteaz inhibitörü kokteyli ile desteklenmiş 800 mikrolitre buz gibi soğuk FLAG lizis tamponu ekleyin.
Hücreleri bir vorteks osilatör veya pipet tabancası kullanarak karıştırın ve ardından karışımı 30 dakika boyunca dört santigrat derecede bir rotatörde inkübe edin. Karışımı buz üzerinde her nabız bir saniye sürerek ultrasonikleştirin ve karışımı beş ila 10 kısa darbeye maruz bırakın. Karışımı 40 RPM'de bir rotatörde dört santigrat derecede 30 dakika boyunca inkübe edin.
Daha sonra ultrasonize edilmiş örnekleri dört santigrat derecede 20 ila 30 dakika boyunca 8, 000 G'de santrifüj edin. Süpernatantı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Aliquot 80 mikrolitre hücre ekstresi ve 20 mikrolitre 5X SDS yükleme tamponu ile karıştırın.
Örnekleri beş dakika boyunca 98 santigrat derecede kaynatın. İki dakika buz üzerinde soğutun ve kullanana kadar eksi 20 santigrat derecede saklayın. Bu örnekleri, protein ekspresyonunu izlemek için giriş grubu olarak kullanın.
Daha sonra, kalan hücre ekstraktlarına 30 mikrolitre anti-FLAG M2 antikoru konjuge boncuk ekleyin ve en az dört saat veya bir gecede dört santigrat derecede bir rotatörde inkübe edin. Boncukları toplamak için dört santigrat derecede iki dakika boyunca 1.500 G'de santrifüj yapın. Boncuklara bir mililitre buz gibi soğuk FLAG lizis tamponu ekleyin ve tüpü birkaç kez ters çevirerek karıştırın.
Bu adımı dört ila altı kez tekrarlayın, ardından boncuklara mikrolitre başına 200 nanogramlık son konsantrasyonda 40 mikrolitre FLAG peptit ekleyin. Daha önce gösterildiği gibi iki saat boyunca bir rotatör üzerinde inkübe edin ve ardından aynı sıcaklıkta santrifüj yapın. Süpernatantı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 10 mikrolitre 5X SDS yükleme tamponu ekleyin.
Karışımı beş dakika boyunca 98 santigrat derecede kaynatın ve ardından iki dakika boyunca buz üzerinde soğutun. Hücre peletlerine bir mililitre buz gibi soğuk PBS ekleyin ve eşit şekilde karıştırın. Aliquot 100 mikrolitre hücre süspansiyonu bir mikrosantrifüj tüpüne giriş numunesi olarak girer ve hücre peletlerini toplamak için dört santigrat derecede beş dakika boyunca 700 G'de santrifüj yapar.
Giriş numunesine 80 mikrolitre FLAG lizis tamponu ekleyin ve daha önce gösterildiği gibi bir vorteks osilatör kullanarak hücreleri karıştırın. Hücreleri bir saat boyunca buz üzerinde lize edin ve ardından 20 ila 30 dakika boyunca tekrar santrifüj yapın. Santrifüzyondan sonra, süpernatantın 80 mikrolitresini yeni bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin ve süpernatana 20 mikrolitre 5X SDS yükleme tamponu ekleyin.
Karışımı beş ila 10 dakika boyunca 98 santigrat derecede kaynatın ve ardından iki dakika boyunca buz üzerinde soğutun. Hücre peletini toplamak için hücre süspansiyonunun kalan 900 mikrolitresini 700 G'de dört santigrat derecede beş dakika boyunca santrifüj edin. Hücre peletlerine bir mililitre ubikitin tamponu 1 ekleyin ve hücreleri eşit olarak dağıtmak için birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın.
Hücre, çözelti artık viskoz olmayana kadar buz üzerinde ultrasonikasyonun 10 ila 20 turuna lizatlar yapın ve daha sonra çözeltiyi santrifüj edin. Süpernatantı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve süpernatana 30 mikrolitre nikel yüklü reçine ekleyin. 15 RPM'de bir rotatörde dört saat veya gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edin ve ardından iki dakika boyunca santrifüj yapın.
Santrifüzyondan sonra, boncukları toplayın ve bir mililitre ubikitin tamponu 1 ekleyin. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca bir çalkalayıcıda rotasyonla inkübe edin ve daha sonra daha önce gösterildiği gibi iki dakika boyunca 1.500 G'de tekrar santrifüj yapın. Boncuklara bir mililitre ubikitin tamponu 2 ekleyin ve boncukları toplamak için daha önce gösterildiği gibi inkübasyon ve ardından santrifüjleme yapın.
Bu adımı bir kez tekrarlayın. Ardından, boncuklara bir mililitre PBS ekleyin ve boncukları toplamak için inkübasyon ve santrifüjleme için aynı prosedürü izleyin. Bu adımı bir kez daha tekrarlayın.
Boncukları oda sıcaklığında bir saat boyunca 0.5 molar nihai konsantrasyonda 40 mikrolitre imidazol ile inkübe ederek bağlı proteinleri inkübe edin. Kuluçkadan sonra, iki dakika boyunca tekrar 1.500 G'de santrifüj yapın. Süpernatantı temiz bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 10 mikrolitre 5X SDS yükleme tamponu ekleyin.
Çözeltiyi beş dakika boyunca 98 santigrat derecede kaynatın ve ardından iki dakika boyunca buz üzerinde soğutun. Numuneleri SDS-PAGE ile çözün ve daha sonra karşılık gelen antikorları kullanarak hedef proteinleri tespit etmek için batı lekeleme yoluyla bir nitroselüloz membranına aktarın. Batı lekelenmesinden gelen sinyalleri tespit etmek için kemilüminesans görüntüleme sistemini başlatın.
Nitroselüloz membranı kamera obscura'ya yüzü yukarı bakacak şekilde yerleştirin. Bir pipet tabancası kullanarak substrat çözeltisini membran üzerinde eşit şekilde kodlayın. Son olarak, kemilüminesan sinyalleri yakalamak için otomatik pozlama prosedürünü seçin ve ideal bir sinyal elde edilene kadar pozlama süresini manuel olarak ayarlayın.
Ubikitinlenmiş p53 de dahil olmak üzere toplam p53 proteini, denatüre olmayan koşullar altında H1299 hücrelerinden FLAG M2 boncukları ile immünoçökeltildi. Elüat, anti p53 ve anti hemaglutinin veya anti p53 ve monoklonal antikorlarla batı lekelenmesine maruz kaldı. Burada, ham hücre ekstraktları veya girdileri, anti p53 ve anti MDM2 monoklonal antikorları ile batı lekelenmesine tabi tutuldu.
Düşük molekül ağırlığından yüksek molekül ağırlığına kadar bulaşmış bir bant olarak görünen ubikitinlenmiş p53 proteininden gelen sinyal, MDM2 bu hücrelerde ektopik olarak eksprese edildiğinde belirgin şekilde artmıştır. Bu sonuç, ubikitinlenmiş p53 proteininin hücrelerden etkili bir şekilde saflaştırıldığını göstermektedir. Daha sonra, hücreler denatüre edici koşullar altında lize edildi.
Toplam hücresel ubikitinlenmiş proteinler nikel yüklü reçine ile aşağı çekildi ve daha sonra anti p53 ve anti hemaglutinin monoklonal antikorları ile batı lekelenmesine tabi tutuldu. Ubikitine p53 proteini, bir anti p53 antikoru ve bir anti hemaglutinin antikoru kullanılarak tespit edildi. Burada ham hücre ekstraktları veya girdileri, anti p53 ve anti MDM2 monoklonal antikorları ile batı lekelenmesine tabi tutuldu.
Sonuçlar, toplam ubikitinlenmiş protein seviyesinin değişmediğini, ancak MDM2 bu hücrelerde aşırı eksprese edildikten sonra ubikitinlenmiş p53 protein seviyesinin çarpıcı bir şekilde arttığını göstermiştir. Bu, ubikitinlenmiş p53 içeren toplam ubikitin proteinlerinin, denatüre edici koşullar altında hücre lizatlarından etkili bir şekilde aşağı çekildiğini göstermektedir. Bu prosedürü denerken, hücre toplamadan önce hücreleri MG132 ile tedavi etmeyi ve ubikitinlenmiş proteinlerin saflaştırılması için hücreleri buz üzerinde düzgün bir şekilde ultrasonize etmeyi unutmayın.
