Bu adım adım protokol, ring tipi E3 ubiquitin ligaseslerinin enzimatik aktivitesinin hem in vitro hem de planta olarak, site yönelimli mutagenez yaklaşımı ile nasıl saptanacağını ve işlevsel olarak karakterize edildiğini göstermektedir. Site yönelimli mutagenez yoluyla bir RING etki alanında mutasyon tanıtArak, ortaya çıkan E3-eksikliği mutant işlevsellik ile enzimatik aktivite bağlamak için yabani tip protein ile paralel olarak test edilebilir. RING tipi E3 ubikitin ligaseslerinin biyokimyasal ve mekanik temelinin aydınlatılması, homeostazın geliştirilmesi, stres sinyali ve bakımındaki biyolojik önemini anlamamıza büyük katkıda bulunabilir.
In vivo ekspresyon sisteminin hafif modifikasyonu ile bu protokol, kökenine bakılmaksızın herhangi bir HALKA tipi E3 ligase analizine uygulanabilir. RING etki alanında korunmuş Cys ve Onun amino asitleri tespit ve mutasyon alanının her iki tarafında 15 baz çiftleri tarafından çevrili ilgi ikame kodonu taşıyan astar tasarımı ile başlayın. Ring etki alanını, özellikle korunmuş sistein ve histidin kalıntılarını doğru bir şekilde tanımlamak çok önemlidir.
Bunu yapmak için PROSITE gibi çevrimiçi araçlar kullanılabilir. PCR amplifikasyonundaki mutajenik astarları kullanarak, pfu gibi yüksek kaliteli DNA polimeraz kullandığınızdan emin olmak için, ilgi genini barındıran plazmide istenilen mutasyonu getirin. PCR'den sonra, E.coli kaynaklı ebeveyn metillenmiş ve yarı metillenmiş DNA'yı doğrudan PCR reaksiyonuna üç mikrolitre Dpnl restriksiyon enzimi ekleyerek ve iki saat boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırarak sindirin.
Ticari bir DNA çıkarma kiti ile mutajenize plazmidleri arındırın ve 50 mikrolitre sudaki DNA'yı temizleyin. Daha sonra, üreticinin protokolüne göre kurtarılan mutajenize plazmid DNA'sının 0,5 mikrolitresi ile DH5-alfa E.coli kimyasal olarak yetkin hücreleri dönüştürün. Bu genleri MBP epitop etiketiyle kaynaştırmak için yabani tip RING ve mutasyona uğramış RING genlerini pMAL-c2 vektörüne kopyala.
Daha sonra, el yazmasında açıklandığı gibi toplam 30 mikrolitre lik bir hacimde in vitro ubiquitination reaksiyonunu ayarlayın ve karışımı iki saat boyunca 30 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. 5x SDS-PAGE yükleme tampon7,5 mikrolitre ile karıştırarak ve beş dakika kaynatın, sonra% 7.5 SDS-poliakrilamid jel elektroforez ile proteinleri ayırarak reaksiyonu sonlandırın. PVDF membran üzerine transfer ve batı lekeleme ve anti-FLAG ile her yerde tespit.
Test edilmiş MBP-RING tipi proteinin eşit yüklendiğini doğrulamak için membranı Coomassie mavisi ile lekelayın. Streak Agrobacterium tumefaciens suşları uygun seçim antibiyotikler içeren LB orta ilgi epitop etiketli gen taşıyan. 28 santigrat derece büyüme iki gün sonra, tek koloniler almak ve başka bir 24 saat boyunca 28 santigrat derece ve 250 rpm antibiyotikler ile LB sıvı ortamda onları büyümek.
Antibiyotikler ile taze LB üç mililitre agrobakteriyel kültürün 100 mikrolitre aktarın ve ek bir dört ila altı saat için kültür kuluçka. Hücreleri 1,800 kez g'de altı dakika boyunca aşağı çevirin, süpernatant'ı atın ve üç mililitre yıkama tamponuyla hücreleri yeniden askıya alın. Yıkamayı iki kez tekrarlayın, sonra indüksiyon arabelleğindeki hücreleri yeniden askıya alın ve 28 santigrat derecede 10 ila 12 saat daha kuluçkaya yatırın.
Kuluçkadan sonra hücreleri 1,800 kez g'de altı dakika santrifüj edin ve süpernatantı atın. Infiltrasyon tampon iki mililitre ile hücreleri resuspend ve OD600 değerini kullanarak bakterilerin konsantrasyonu belirlemek. Agroinfiltrate dört haftalık Nicotiana benthamiana yavaşça bir iğne ile onları dikmek tarafından yaprakları, ve bir şırınga ile el enjekte Agrobacterium, sonra bir işaretile sızmış alan daire.
36 saat sonra, sızmış yaprak doku toplamak ve sıvı azot ile ince bir toz için eziyet. 300 mikrolitre protein ekstraksiyon tamponu ile doku tozunu yeniden askıya alın ve 15,000 kez g'de 15 dakika 4 santigrat derecede santrifüj edin. Supernatant'ı yeni bir tüpe aktarın, 1x'lik son konsantrasyona 5x SDS-PAGE yükleme tamponu ekleyin ve numuneyi beş dakika kaynatın.
Sonra, planta ubiquitination tespit etmek için batı leke analizi gerçekleştirin. Uygun Agrobacterium tumefaciens suşları ilgi veya boş vektör etiketli genleri taşıyan çizgi ve Nicotiana benthamiana yaprakları üzerinde Agrobacterium enjekte, daha önce açıklandığı gibi. E3 bağımlı substrat protein yıkımı için, daha önce açıklanan protokolü uygulayın ve bitki hücrelerinde protein birikimini tespit etmek için uygun antikorlarla batı lekeleme gerçekleştirin.
E3 bağımlı aşırı duyarlı yanıt aracılı hücre ölümü inhibisyonu için, hücre ölümü belirtileri için tarıma sızmış yaprakları izlemek 2-4 gün sonrası infiltrasyon. Tipik bir in vitro ubiquitination test sonucu test edilen proteinin moleküler ağırlığında başlayan ve yukarı doğru ilerleyen bir multiband yayma içerir. Beklendiği gibi, tek tek bileşenler eksik negatif kontroller veya MBP kullanarak bulaşmış sinyal göstermedi.
Ayrıca, PVDF membran Coomassie mavi boyama tüm kontrollerde MBP-RHA1B veya MBP eşit yükleme gösterdi. 11 farklı E2 sin vitro ubiquitination belirli E2 e3 kombinasyonuna bağlı olarak nasıl değiştiğini araştırmak için test edildi. Tespit edilen ubikitinasyon aktivitesi, farklı molekül ağırlıklarında başlayan ve farklı ubikitinasyon desenlerini gösteren sinyal sizden çok bantlı yaymaya kadar değişmektedir.
RHA1B'nin RING ve K-mutant versiyonları in vitro ve planta'da her yerde test edildi. RING-mutant versiyonunun enzimatik aktivitesinin olmaması, in vitro bir çok bantlı yayma üretememesi ya da planta'da poli-ubiquitinasyon sinyalini teşvik edememesi ile desteklenir. K mutantı için in vitro olarak marjinal bir öz-ubiquitination sinyali saptamasına rağmen, planta'da sadece arka plan da ubiquitination tespit edildi, Bu K146 kalıntısı da E3 aktivitesi için gerekli olduğunu düşündürmektedir.
Yabani tip RHA1B aksine, E3 ligaz aktivitesi eksik RING mutant aşırı duyarlı yanıt hücre ölümü ile müdahale etmedi. Batı lekeleme Gpa2 vahşi tip RHA1B varlığında birikmez doğruladı, ama RING mutant protein stabilitesi üzerinde hiçbir etkisi yoktu. Her yerde bulunan reaksiyon için uygun bir E2-E3 kombinasyonunun gerekli olduğu göz önüne alındığında, yanlış negatif sonuçları önlemek için farklı E2 sınıflarını temsil eden birden fazla E2 enzimi ile paralel olarak in vitro ubikitinasyon tahlilleri yapılmalıdır.
Bir E3 ligaz-eksik mutant in vivo enzim-substrat etkileşimlerinin test kolaylaştırır. Ayrıca, bu mutant genellikle RNAi alternatif bir yaklaşım olarak fonksiyonel nakavt çalışmalarda kullanılabilir baskın bir negatif fenotip confers. Bu protokolü kullanarak, son zamanlarda RHA1B nematod efektörü her yerde ve bozulma için bitki Gpa2 immünreseptörhedefleyerek bir E3 bağımlı şekilde bitki bağışıklık sinyali müdahale bulunmuştur.
