Bu protokolün genel amacı, E2 enzim özgüllüğü, substrat seçimi ve ubiquitin transferi de dahil olmak üzere E3 ligaz fonksiyonunun önemli temel yönlerini analiz etmektir. Bu tekniğin ana avantajı, tüm ökaryotik kaynaklardan gelen proteinlerin özel ekipmana ihtiyaç duymadan in vitro olarak rekombinant olarak ifade edilebilmesi ve çalışılabilmesi nedeniyle geniş uygulanabilirliğidir. Lizin deşarj tekniğini ilk kez kullanırken, tercih ettiği E3 ligaz için ideal deşarj koşullarını belirlemek için enzim konsantrasyonları gibi test parametrelerini optimize etmek önemlidir.
Bir in vitro otomatik-her yerdekim testi yapmak için, farklı E2 enzimlerinin fonksiyonel yeteneğini test etmek için bir pipetleme şeması kurun ve tüm her yerde bulunan reaksiyonlar ve bir ek reaksiyon için buz üzerinde bir ana karışım hazırlayın. Daha sonra, uygun tüplere bir mikromolar E2 enzimi ekleyin ve numuneleri belirtilen koşullar altında iki saat boyunca bir PCR termal çevriminde kuluçkaya yatırın. İnkübasyondan sonra, her reaksiyona SDS örnek tamponu ekleyin ve birkaç kez pipetleme yaparak karıştırın.
Daha sonra örnekleri hemen 95 santigrat derecede beş dakika kaynatın ve denatüre proteinleri 20 santigrat derecede saklayın. Bir in vitro substrat ubiquitylation tahlil yapmak için, tüm reaksiyonlar için pipetleme şemasını hazırlayın. Bir reaksiyon için gereken ana karışım miktarını hesapladıktan sonra, ana karışımı buz üzerindeki tüm reaksiyonlar için hazırlayın ve ana karışımı her tüpe ekleyin.
İlgili E3 bağlarını tek tek ekleyin. Daha sonra numuneleri pcr termal çevriminde gösterildiği gibi iki saat kuluçkaya yatırın. Kuluçkanın sonunda, her reaksiyona iki kez SDS örnek arabelleği ekleyin, pipetleme ile birkaç kez karıştırın ve numuneleri 95 santigrat derecede beş dakika kaynatın.
Lizin deşarj tahlilini gerçekleştirmek için, şarj reaksiyoni için pipetleme şemasını kurun ve şarj reaksiyonlarını 37 santigrat derecede 15 dakika kuluçkaya bırakın. Şarj reaksiyonu durdurmak için, mililitre başına 1,8 birimlik son konsantrasyona apyrase ekleyin ve reaksiyonu oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya bırakın. Kuluçkanın sonunda, 30 milimolar nihai konsantrasyona EDTA ekleyin ve reaksiyonun hacmini 30 mikrolitreye ayarlamak için çift damıtılmış su kullanın.
E2 ubiquitylation'ı E3 ile boşaltmak için, deney için zaman noktalarına karşılık gelen beş tüp kurun, her tüpe 6,7 mikrolitre azaltmayan numune tamponu ekleyin, durdurulan şarj reaksiyonunun altı mikrolitresini zaman noktası sıfır tüpünden çıkarın ve toplam hacmi 26,7 mikrolitreye ayarlayın. Deşarj reaksiyonlarını ayarlamak için, her reaksiyona çift damıtılmış su, her yerde bulunan tampon, BSA, lizin, E3 ligaz ve yüklü E2 ekleyin. Seçilen zaman periyotlarından sonra, her deşarj reaksiyonundan 20 mikroliter numuneyi ilgili numune tüpüne aktarın.
Sonra örnekleri hemen girdaplayın ve 10 dakika boyunca 70 santigrat dereceye yerleştirin. Bu temsili Batı blot analizinde, etkin olmayan CHIP otomatik olarak her yerde bulunmamıştı. Bununla birlikte, E3'den bağımsız ubiquitin ürünleri aktif olmayan CHIP varlığında ve CHIP'in yokluğunda oluşturulmuştur.
Vahşi tip CHIP, UBE2D ve UBE2E ailelerinin proteinleriyle birleştirildiğinde otomatik olarak her yerde bulunurken, ücretsiz poliubiquitin zincirleri UBE2D ailesinin proteinleriyle işbirliği içinde üretildi, ancak UBE2E ailesinin proteinleriyle üretilmedi. Ubiquitin'in UBE2N/V1 tarafından bağlanması, serbest ubiquitin zincirlerinin oluşumunu yönlendirdi. UNC-45B'nin otomatik her yerde bulunması ve her yerde bulunması, vahşi tip CHIP ile gözlendi, ancak CHIP'in aktif olmayan mutantıyla gözlenmedi, bu da UNC-45B'nin CHIP için korunmuş bir substrat görevi gösterdiğini gösteriyor.
CHIP'in katalitik aktivitesi lizin deşarjı tahlili kullanılarak analiz edildiğinde, şarj edilmemiş UBE2D2 enziminin moleküler ağırlığı 17 kilodalton, tek bir ubiquitin molekülüne sahip yüklü UBE2D2'nin moleküler ağırlığı yaklaşık 26 kilodaltondu. 0 zamanında, tüm yüklü E2 verimi gözlendi. Aktif olmayan CHIP varlığında, UBE2D2'nin soluk E3 ligazdan bağımsız deşarjı tespit edildi, ancak CHIP'in otomatik olarak her yerde bulunmaması tespit edildi.
Vahşi tip CHIP varlığında, UBE2D2'nin deşarjı hızlıydı ve 60 dakika içinde tamamlandı ve CHIP'in otomatik olarak her yerde bulunması, her yerde bulunanların kendi lizin kalıntılarına transferini gösterdi. Sınırlı E2 yeteneği nedeniyle, mümkün olduğunca hızlı çalışın ve hemen SDS-PAGE ve Western şişkinliği ile birlikte deşarj reaksiyonuna devam edin. Bu in vitro her yerde bulunma protokollerini takiben, batı lekelerinin bağlantıya özgü antikorlarla yoklanmasıyla spesifik her yerde bulunan bağlantı tipleri tanımlanabilir.
