Bu protokol, transkripsiyon faktörü kodlayan genlerin epitop etiketlemesinden hesaplamalı veri analizine kadar, CUT & RUN aracılığıyla Candida albicans'ta transkripsiyon faktörü-DNA bağlanma etkileşimlerinin genom çapında profillemesini gerçekleştirmeye kadar tüm deneysel prosedürleri detaylandırır. Bu daha erişilebilir, daha hızlı, daha hassas, daha ucuz bir tekniktir ve geleneksel ChIP-çip ve ChIP-seq yaklaşımlarından daha yüksek kaliteli veri sağlar. Protokolümüz biyofilmlerden veya planktonik kültürlerden izole edilen Candida albicans hücreleri için geliştirilmiş olsa da, onu hemen hemen her iyi Candida albicans hücresi formuna uyarlamak pratik olmalıdır.
Hücre süspansiyonunu inkübe ettikten sonra, beş mikrolitrelik bir alikotu yeni bir PCR tüpüne aktarın. Daha önce dört santigrat derecede depolanmış beş mikrolitre izole çekirdeğe ve beş mikrolitrelik sağlam hücrelerin alikotuna, her biri kalkoflor-beyaz ve SYTO 13'ün her birine bir mikrolitre ekleyin. 30 dakika boyunca karanlıkta 30 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.
Bir floresan mikroskobu kullanarak izole edilmiş çekirdeklerin bütünlüğünü ve saflığını görsel olarak inceleyin. Belirgin SYTO 13 boyaması gösteren izole çekirdekleri arayın ve kalkoflor-beyaz boya ile hücre duvarının boyanmadığından emin olun. Kalkoflor-beyaz boya ile hücre duvarı boyama kontrolü olarak sağlam hücrelerle muayeneyi tekrarlayın.
Tüpleri manyetik bir rafa yerleştirin ve bulamaç tamamen temizlenene kadar bekleyin. Süpernatantı pipet kullanarak atın. 50 mikrolitre antikor tamponu ekleyin ve pipetleyerek, hafifçe karıştırın.
Tüplere üç mikrolitre anti-GFP poliklonal antikoru ekleyin ve tüpleri iki saat boyunca 4 santigrat derecede bir somun karıştırıcı üzerinde inkübe edin. Tüpleri oda sıcaklığında 100 kez g'de beş saniye boyunca kısaca santrifüj edin ve tüpleri manyetik bir rafa yerleştirin. Bulamaç temizlendikten sonra, süpernatantı bir pipet kullanarak atın.
Boncuklu tüpler hala manyetik raf üzerindeyken, doğrudan boncukların üzerine 200 mikrolitre buz gibi soğuk hücre geçirgenlik tamponu ekleyin. Süpernatantı pipet kullanarak atın. Buz gibi soğuk hücre geçirgenlik tamponu ile iki yıkamayı tekrarlayın.
Her tüpe 50 mikrolitre buz gibi soğuk hücre geçirgenlik tamponu ekleyin ve pipetleme ile nazikçe karıştırın. Her numuneye 2,5 mikrolitre AG-MNaz proteini ekleyin ve pipetle karıştırın. Numuneleri 4 santigrat derecede bir nutasyon karıştırıcısına yerleştirin ve numuneleri bir saat boyunca inkübe edin.
Şerit tüpleri beş saniye boyunca oda sıcaklığında 100 kez g'de kısaca santrifüj edin, ardından tüpleri manyetik bir rafa yerleştirin. Bulamaç temizlendikten sonra, süpernatantı bir pipet kullanarak atın. Boncuklu tüpler hala manyetik raf üzerindeyken, doğrudan boncukların üzerine 200 mikrolitre buz gibi soğuk hücre geçirgenlik tamponu ekleyin.
Süpernatantı pipet kullanarak atın. Buz gibi soğuk hücre geçirgenlik tamponu ile iki yıkamayı tekrarlayın. Numunelere 100 mikrolitre buz gibi soğuk hücre geçirgenlik tamponu ekleyin ve beş kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin.
Jel dökümünü jel kutusundan çıkarın ve üreticinin talimatlarına göre jel dökümünü açın. Jeli jel dökümünden yavaşça çıkarın ve 100 mililitre tek mukavemetli TBE içeren bir jel tutma tepsisinin içine yerleştirin. Tepsiye 10 mikrolitre nükleik asit jel lekesi ekleyin ve yavaşça döndürün.
Işıktan korumak için folyo ile örtün ve 10 dakika boyunca oda sıcaklığında statik olarak inkübe edin. Daha sonra jeli 100 mililitre deiyonize musluk suyu ile iki kez durulayın. Sarı filtre kapağı kullanarak jeli mavi ışık aydınlatması altında görüntüleyin.
Her kütüphane için, jeli yaklaşık 125 baz çifti belirgin adaptör dimer bandının biraz üstünde ve 400 baz çift merdiven işaretinin altında kesin. 22 gauge'lik bir iğne kullanarak 0.65 mililitrelik bir tüpün tabanını delin ve delinmiş tüpü steril iki mililitrelik bir mikrofüj tüpünün içine yerleştirin. Jel dilimini iki mililitrelik mikrofüj tüpünün içindeki delinmiş tüpe aktarın.
0.65 mililitrelik delinmiş tüpü içeren iki mililitrelik mikrofüj tüpünü santrifüj edin ve iki mililitrelik mikrofüj tüpünün içindeki jel bulamacını toplamak için iki dakika boyunca oda sıcaklığında 10.000 kez g'de numune alın. Jel bulamacına 300 mikrolitre buz gibi soğuk jel elüsyon tamponu ekleyin. Oda sıcaklığında bir nutator üzerinde en az üç saat veya gece boyunca karıştırın.
Tüm sıvı ve jel bulamacı 0,22 mikrometrelik bir filtre kolonuna aktarın ve bir dakika boyunca oda sıcaklığında 10.000 kez g'da santrifüj yapın. Yeşil Kod düğmesine ve ardından ZIP İndir seçeneğine tıklayarak GitHub sayfasından CUT&RUN analizi için kaynak kodunu indirin. Klasörü yerel makinede ilgili bir konuma açın.
Conda Ortamını yükleyin ve yalnızca bir kez çalıştırın. Conda kurulduktan sonra, ilgili komutla sağlanan sanal bir ortam oluşturun. Bu iş akışı her yürütüldüğünde sanal ortamı etkinleştirin.
Hücre duvarı sindirimi ve nükleer bütünlük, hem kontrol sağlam hücreleri hem de floresan hücre duvarı ve nükleik asit lekeleri ile boyanmış izole çekirdekleri görselleştirerek değerlendirildi. Hücre duvarı boyamasının gözlenmediği izole edilmiş bozulmamış çekirdeklerin aksine, hem çekirdekler hem de hücre duvarları, bozulmamış kontrol hücrelerinde floresan olarak etiketlenir. Şekil, kılcal elektroforez cihazı kullanılarak analiz edilen CUT&RUN TF kütüphanelerini göstermektedir.
Başarılı CUT&RUN TF kütüphaneleri, 200 baz çiftinden küçük kısa parçalar için zenginleştirilmiştir. Optimal olmayan CUT&RUN TF kütüphaneleri büyük DNA fragmanları için zenginleştirme gösterir. Buradaki şekil, Ndt80 DNA bağlayıcı motiflerin, CUT&RUN tarafından tanımlanan tüm Ndt80'e bağlı lokuslarda zenginleştirildiğini göstermektedir, bu da bu metodoloji tarafından tanımlanan ek zirvelerin muhtemelen iyi niyetli Ndt80'e bağlı bölgeler olduğunu göstermektedir.
Karşılaştırmalı analiz, CUT&RUN protokolünün biyofilm oluşumu sırasında Ndt80 ve Efg1 için daha önce bilinen bağlanma olaylarının çoğunu tanımladığını göstermiştir. Genel olarak, lokuslara bağlı hem Ndt80 hem de Efg1, daha önce yayınlanmış kromatin immün çökeltme ChIP verileriyle örtüşür ve yalnızca CUT & RUN kullanılarak tanımlanır. Transkripsiyonel düzenleyici ağlara ve Candida albicans'a odaklanan araştırmamızın kapsamını ve hızını önemli ölçüde artırmamızı sağlar.
