Bu yöntem, araştırmacının, her ikisi de daha standart uygulamalar kullanarak genellikle zor olan peptitler ve birinci sıra geçiş metal iyonları gibi sistemleri incelemek için zor prob yapmasına izin verecektir. Buradaki temel avantaj, ortogonal teknikler kullanmaktır, çünkü birbirlerini iyi tamamlarlar ve bu da sistem hakkında daha fazla fikir verebilir ve herhangi bir fenomeni kaçırmamamıza yardımcı olabilir. Bu videoda ayrıntılı olarak açıklanan yöntem, diğer sistemleri incelemek için çok uygundur.
Cu(II) ve bir peptit ile göstermemize rağmen, birçok farklı metal peptit ve metal protein etkileşimi için kullanılabilir. Bence en zor kısım, metal iyonunuz ve peptidiniz için iyi bir tampon seçeneği bulmak olacaktır. Daha önce başkaları tarafından hangi tamponların kullanıldığını görmek için literatüre başvururdum.
Prosedürü gösteren, araştırma laboratuvarımda yüksek lisans öğrencisi olan Sohee Choi olacak. Başlamak için, elektronik absorpsiyon spektrofotometresini açın ve kullanımdan önce yaklaşık 15 ila 20 dakika ısınmasına izin verin. Ardından spektrofotometre yazılımını başlatın ve 200 ila 900 nanometre tarama aralığı, saniyede 200 nanometre tarama aralığı ve düzeltilmiş çift ışın tabanı gibi parametreleri yapılandırın.
Ardından, ışın yollarında küvet veya numune içermeyen bir taban çizgisi toplayın. Çift ışınlı spektrofotometrede iki eşleşen küvet kullanarak, bir küvete 115 mikrolitre ultra saf su ve diğer küvete 115 mikrolitre peptit numunesi ile doldurun ve küvetlerde hava kabarcığı olmadığından emin olun, çünkü bunlar sinyale müdahale edecektir. Daha sonra, küveti referans ışınına ultra saf su ile ve numune ışınına peptidli küvet yerleştirin.
Daha sonra metal içermeyen peptidin absorpsiyon spektrumunu toplayın. Peptit numunesi ile küvete Cu(II)solüsyonunun substokiyometrik miktarını ekleyin ve daha sonra analiz için hacmi kaydedin. Hava kabarcıklarının oluşmasını önlerken çözeltiyi karıştırmak için yavaşça yukarı ve aşağı borulayın.
Beş dakika boyunca dengeledikten sonra küveti numune hücre tutucusuna geri koyun ve absorpsiyon spektrumunu kaydedin. Ardından, çeşitli eşdeğerleri için peptit çözeltisine Cu (II) alikotlarının eklenmesini tekrarlayın ve küvete eklenen toplam Cu (II) hacmini kaydedin. Yazılımı daha önce iki eşleşen küvette açıklandığı gibi başlattıktan sonra, bir küvete 115 mikrolitre ultra saf su ve 115 mikrolitre bakır-fen kompleks çözeltisi içeren diğer küvet yükleyin.
Küvetin referans kirişine su ile ve bakır-fen kompleks çözeltisi içeren küvetin numune kirişine yerleştirilmesini sağlayın. Daha sonra metal ligand kompleksinin absorpsiyon spektrumunu toplayın. Daha sonra, bakır-fen kompleks çözeltisine stokiyometrik miktarda peptit ekleyin ve herhangi bir hava kabarcığı sokmamaya dikkat ederken iyice karıştırmak için yavaşça yukarı ve aşağı borulayın.
Daha sonra, dengeye ulaşmak için çözeltiyi beş dakika boyunca inkübe edin. Küveti numune hücre tutucusuna geri koyun ve absorpsiyon spektrumunu kaydedin. Daha sonra, çeşitli eşdeğerleri için bakır-fen kompleks çözeltisine peptid alikotlarının eklenmesini tekrarlayın ve seyreltilmiş konsantrasyonun belirlenebilmesi için eklenen peptid hacmini kaydedin.
İlk önce ITC'yi açın ve cihazı çalıştırmak için ITC yazılımını başlatın. İlk başlatmadan sonra, büreti yeniden yerleştirin ve ekrandaki talimatları izleyin. Ardından büreti ve kapağı referans hücresinden çıkarın.
Daha sonra, referans hücresinden herhangi bir suyu çıkarın ve 450 mikrolitre gazdan arındırılmış ultra saf su ile üç kez durulayın. Şırıngaya hava kabarcıkları sokmamaya dikkat ederek ultra saf suyu bir yükleme şırıngasının 450 mikrolitre işaretine yavaşça çekin. Ardından, yükleme şırıngasını alttan yaklaşık bir milimetre uzakta olana kadar referans hücresine yerleştirin ve yükleme şırıngasında 150 mikrolitre kalana kadar çözeltinin bir kısmını yavaşça enjekte edin.
Daha sonra, hücre yüzeyindeki kabarcıkları yerinden çıkarmak için yükleme şırıngası pistonunu birkaç kez yaklaşık 25 mikrolitre yukarı ve aşağı doğru hareket ettirin. Ardından, piston yükleme şırıngası üzerindeki 100 mikrolitre işaretine ulaşana kadar yavaşça enjekte edin, böylece referans hücresine toplam 350 mikrolitre ultra saf su dağıtın ve referans hücre kapağını değiştirin. Numune hücresinden herhangi bir artık çözeltiyi çıkardıktan sonra, bir yükleme şırıngası kullanarak 450 mikrolitre 10 milimolar EDTA yükleyin ve EDTA eser metalleri bağlayacağı için eser metal iyonlarının çıkarılmasını sağlamak için 10 dakika bekletin.
EDTA çözeltisini çıkardıktan sonra, yükleme şırıngasını bol miktarda ultra saf su ile iyice durulayın. Numune hücresini ultra saf suyla durulayarak ITC'yi üreticinin talimatlarına uygun olarak temizleyin. Numune hücresinden kalan suyu çıkarın ve ardından 450 mikrolitre tamponla en az üç kez durulayarak numune hücresini şartlandırın.
Ardından, numune hücresini koşullandıran artık tamponu çıkarın ve yükleme şırıngasını kullanarak peptid çözeltisini numune hücresine yükleyin. Daha sonra önce pistonu çıkararak titrasyon şırıngasını 200 mikrolitre tamponlu çözelti ile durulayın. Bir mikro pipet kullanarak, tampon çözeltisini cam titrasyon şırıngasının üstündeki delikten şırıngadan geçirin ve aşağıdaki iğneyi çıkarın.
Daha sonra, pistonu titrasyon şırıngasına tamamen yerleştirin. Ardından, titrasyon şırınga iğnesinin ucunu metal çözeltiye batırın ve pistonu yavaşça yukarı çekerek metal çözeltinin şırıngayı doldurmasına neden olarak titrasyon şırıngasının cam kısmının üstünde bir boşluk hacmi oluşmasına neden olun. Boşluk hacmini gidermek için titrasyon şırıngasını zemine paralel olarak döndürün.
Ardından pistonu çıkarın ve cam kısmı hafifçe zemine doğru eğin. Titrasyonun şırıngasını nazikçe sallayın, böylece çözelti titrasyon şırıngasının cam kısmına taşınır ve boşluk hacminin çoğunu doldurur. Ancak iki ila üç mikrolitre boşluk hacminin kaldığından emin olun.
Şırıngayı zemine paralel tutarken pistonu tekrar takın. Ardından titrasyon şırıngasını dik tutun ve iğnenin ucunu tekrar metal çözeltiye batırın. Ardından, iğneden hava çıkmayı bırakana kadar pistonu aşağı doğru itin ve iğnenin ucunu çözeltide tutarken pistonu yavaşça 50 mikrolitre işaretinin hemen üstüne çekerek titrasyon şırıngasını yükleyin.
Titrasyon şırıngasının cam kısmını dikkatlice bürete yerleştirin ve parmağınızı sıkana kadar vidalayın. Daha sonra, hafif hizmet tipi hassas bir silecek kullanarak, iğnenin ucuna dokunmadan pistonun sıkıştırılması nedeniyle titrasyon şırıngasından çıkan çözeltiyi emer. Ardından, büreti bir titrasyon şırıngasıyla numune hücresine yerleştirin ve güvenli bir şekilde sabitleyin.
ITC yazılımının parametrelerini ayarlamak için Enstrüman Kontrolü'nü seçin. Karıştırma hızını ve sıcaklığı ayarlayın. Daha sonra Deney Detayları altında, şırınga ve hücre konsantrasyonlarını milimolar birimler halinde girin.
Ardından, Deneme Yöntemi bölümünde Artımlı Titrasyon'u seçin. Kurulum'a tıklayın ve 2.5 mikrolitrelik 20 enjeksiyon belirtin ve bağlanma olayını gözlemlemek için daha fazla çözünürlük gerekiyorsa, enjeksiyon sayısını artırın ve enjeksiyon başına hacmi azaltın. Daha sonra, her enjeksiyon arasındaki zaman aralığını girin, böylece sinyalin dengelenmesi ve taban çizgisine geri dönmesi için yeterince uzun, tipik olarak 300 saniye.
Ardından, denemeyi başlatmak ve verilerin nereye kaydedileceğini belirtmek için Çalıştır düğmesini tıklayın. Cu(II)'nin titrasyonunun C-Peptit'e dönüştürülmesi gerçekleştirildi ve 150 mikromolar Cu(II) ilavesinin Cu(II)'nin d-d bandına atfedilen 600 nanometrede bantta anında bir artışa neden olduğunu ve 300 milimolar Cu(II) eklenene kadar artmaya devam ettiğini gösterdi. 300 mikromolar Cu(II)'nin üzerindeki ilave eklemeler, doygunluğu gösteren d-d yasağının emilimini arttırmadı ve Cu(II), 1: 1 kompleksinde C-Peptit'e bağlandı ve log K değeri altıdan fazlaydı.
C-Peptit, yaklaşık 10 mikromolar bakır-fen kompleksine titre edildi ve 265 nanometrede yük transfer bandından emilim, C-Peptit'in fenantropin ligandından Cu (II) 'yi 7.4 ila 7.8 log K değeri ile şelatlayabildiğini gösteren azaldı. ITC termogramı, 15 milimolar MOPS tamponunda 1,4 milimolar Cu(II)'nin 154 mikromolar C-Peptit'e titrasyonunu gösterir. Bağlanma afinitesinin log K değerinin sekizde olduğu ve entalpi değişiminde mol başına 8 kilojoule olduğu bulunmuştur.
Gibbs serbest enerjiyi mol başına eksi 46 kilojoule olarak ve entropide kelvin başına mol başına 120 joule olarak değişir. C-Peptit yokluğunda 15 milimolar MOPS tamponuna 1,4 milimolar Cu(II)'nin kontrollü titrasyonunun termogramda bağlanma göstermez. Her şeyin temiz olduğundan emin olmak söyleyebilirim.
Önceki deneylerden kalan metal iyonları veya peptitler varsa, stokiyometriyi büyük ölçüde etkileyebilir ve bağlama deneylerinde bilinmeyen bir rekabet sağlayabilir. Dairesel dikroizm, metal peptid veya metal protein etkileşimlerini incelemek için başka bir yöntemdir, çünkü kiraliteye bakar. Kütle spektrometresi, kütledeki değişikliklere bakarak bu kompleksleri de sorgulayabilir.
Bu teknik seti, peptitler veya proteinlerle etkileşime giren metal iyonlarını inceleyen birçok laboratuvar tarafından kullanılmıştır.
