Kültür plakalarında insan hava yolu epitelinin organoid kültürünü oluşturmak için bir yöntem sunuyoruz. İnsan akciğer organoidini doğrudan primer akciğer dokularından yüksek verimlilikle elde ediyoruz. Türetilmiş insan akciğer organoidi bir yıldan fazla bir süre boyunca istikrarlı bir şekilde genişletilir ve bir proksimal farklılaşma protokolü, insan hava yolu epitelini yakın bir fizyolojik seviyeye sadık bir şekilde simüle edebilen olgun hava yolu organoidlerinin üretilmesine izin verir.
Bu nedenle, kültür sistemi, bilim adamlarının kültür plakalarındaki insan hava yolu epitelini yeniden yapılandırmalarına ve genişletmelerine izin verir. Prosedürü gösteren Man Chun Chiu ve Yifei Yu, laboratuarımızdaki doktora öğrencileri 3D organoid kültür için insan akciğer dokularından hücre izolasyonuna başlamak için, akciğer dokularını steril bir neşterle bir milimetre küçük parçalara ayırın ve doku parçalarını 10 mililitre soğuk bazal ortam ile yıkayın. Dokuları dört santigrat derecede beş dakika boyunca 400 kez G'de santrifüj edin ve peleti, mililitre başına iki miligramlık son bir konsantrasyonda kollajenaz ile desteklenmiş sekiz mililitre bazal ortamda yeniden askıya almadan önce süpernatantı atın.
Daha sonra, tüpü 120 RPM'de 37 santigrat derecede 30 ila 40 dakika çalkalayarak doku parçalarını sindirin. Sindirimden sonra, sindirilen doku parçalarını kesmek için 10 mililitrelik serolojik pipet kullanarak 20 kez yukarı ve aşağı pipet uygulayın. Ardından, süspansiyonu 100 mikronluk bir süzgeçle 50 mililitrelik bir tüpe filtreleyin.
Doku parçalarını süzgeçten geri kazanın ve bazal ortama sahip 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Sindirimi sonlandırmak için, akışa% 2'lik bir son konsantrasyona fetal sığır serumu ekleyinDaha sonra, tüpü santrifüj edin ve hücre peletini daha önce tarif edildiği gibi bazal ortamın 10 mililitresinde yeniden askıya alın. Santrifüjlemeden sonra, peleti 80 ila 160 mikrolitre soğuk bodrum matrisi ortamında yeniden askıya alın ve tüpleri buz üzerine yerleştirin.
Daha sonra, önceden ısıtılmış 24 delikli bir süspansiyon kültürü plakasının her bir kuyucuğuna 40 mikrolitre süspansiyon dağıtın. Plakayı 10 ila 15 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Bodrum matrisinin katılaşmasına ve bir damlacık oluşturmasına izin verin.
Kuluçkadan sonra, her bir kuyucuğa beş nanomolar heregulin-beta 1 ile desteklenmiş 500 mikrolitre insan akciğer organoidi genişleme ortamı ekleyin ve plakayı bir hücre kültürü inkübatöründe inkübe edin. Üç gün sonra, damlacığı sağlam tutarken eski ortamı çıkarın ve dikkatlice taze ortam ekleyin. 10 ila 14 günlük geçişten sonra, organoidleri mikroskop altında gözlemleyin ve organoidlerin çok yüksek bir hücre yoğunluğu ile gömülmediğinden emin olun.
Akciğer organoidlerini kesme ile geçirmek için, damlacıkları bir mililitrelik bir uçla yukarı ve aşağı pipetleyerek, kırın. Daha sonra, organoidleri ortamla birlikte 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve soğuk bir bazal ortamla hacmi 10 mililitreye ayarlayın. Tüpü dört santigrat derecede beş dakika boyunca 300 kez G'de santrifüj yapın, süpernatanı atın ve organoidleri 10 mililitre soğuk bazal ortam ile yıkayın.
Daha sonra, organoidleri iki mililitre soğuk bazal ortamda yeniden askıya alın ve bir Pasteur pipet ile küçük parçalara ayırın. Daha sonra, organoid parçalarını 1: 3 ila 1: 5 genleşme sağlamak için yeterli soğuk bir bodrum matrisi ile yeniden askıya almadan önce toplam 10 mililitrelik bir hacme bazal ortam ekleyin ve tüpleri buz üzerine yerleştirin. Bodrum matrisinin 10 ila 15 dakika boyunca katılaşmasını sağlamak için 37 santigrat derecede inkübe etmek için önceden ısıtılmış 24 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna 40 mikrolitre organoid süspansiyon dağıtın.
Daha sonra, her bir oyuğa 500 mikrolitre akciğer organoid genleşme ortamı ekleyin ve bir hücre kültürü inkübatöründe inkübe edin. Ortamı her üç günde bir yenileyin ve organoidleri her iki haftada bir geçirin. Akciğer organoidlerini tripsinizasyonla geçirmek için, hasat edilen akciğer organoidlerini bir mililitre ayrışma enziminde yeniden askıya alın.
Organoidi 37 santigrat derecelik bir su banyosunda üç ila beş dakika boyunca inkübe edin. Daha sonra, tüpe bir mililitre bazal ortam ekleyin ve organoidleri yukarı ve aşağı pipetleyerek, mekanik olarak kesin. 40 mikrolitre fetal sığır serumu ile sindirimi sonlandırmadan önce mikroskop altında organoid parçaların boyutunu 100X büyütmede kontrol edin.
Organoid parçaları soğuk bir bodrum matrisinde 1:5 ila 1:10 oranında geçmek için yeterli hacme sahip yeniden askıya almadan önce bazal ortam ve santrifüj ile hacmi 10 mililitreye kadar yapın. Daha sonra, 24 kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna 40 mikrolitre organoid süspansiyon dağıtın ve plakayı daha önce gösterildiği gibi kültürleyin. 3D hava yolu organoidleri üretmek için, akciğer organoidlerini mekanik kesme yoluyla geçtikten sonra yedi ila 10 gün boyunca genleşme ortamında inkübe edin.
Daha sonra, genişleme ortamını proksimal farklılaşma ortamı ile değiştirin ve organoidleri bir hücre kültürü inkübatöründe inkübe edin. 14 gün sonra, ortamı her bir kuyucukta atın ve RNA ekstraksiyonu ve RT-qPCR testi ile hücresel gen ekspresyonunun tespiti için farklılaşmış hava yolu organoidini toplamak için hücre lizat tamponu ekleyin. Hücre kültürü inkübatöründeki ekleri, sırasıyla 24 delikli bir plakanın üst ve alt haznesinde 250 ve 500 mikrolitre bazal ortam ile önceden inkübe edin.
Daha sonra, organoidleri tek hücrelere kesmek için tüpe bir mililitre bazal ortam ve pipet yukarı ve aşağı ekleyin. 40 mikrolitre fetal sığır serumu ile sindirimi sonlandırmadan önce hücreleri mikroskop altında gözlemleyin. Hücreleri 40 mikronluk bir süzgeçten 50 mililitrelik bir tüpe filtreleyin ve filtrelenmiş hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik bir tüpe aktarın.
Süspansiyonu bazal orta ile toplam 10 mililitre hacme doldurun. Santrifüjlemeden sonra, hücre yoğunluğuna bağlı olarak, 1 ila 2,5 mililitre akciğer organoid genleşme ortamında 24 damlacıktan toplanan peleti yeniden askıya alın. Mikroskop altında hücre sayacı olan hücre sayısını sayın, ardından 24 kuyucuklu ekler için hücre konsantrasyonunu mililitre başına 1.3 çarpı 10'a altı katına ayarlayın.
Alt hazneye 500 mikrolitre genleşme ortamı eklemeden önce bazal ortamı üst ve alt odalardan çıkarın. Tohum 100 mikrolitre hücre süspansiyonu, 24 kuyucuklu ekin apikal odasına daha önce hazırlanır ve inkübe edilir. İki gün sonra, genleşme ortamını plakanın hem apikal hem de alt odasında proksimal farklılaşma ortamı ile değiştirin.
Organoidleri 14 gün boyunca inkübe edin ve ortamı her üç günde bir yenileyin. Transepitelyal elektrik direncini her gün bir elektriksel direnç ölçüm sistemi kullanarak ölçün. Temsili mikrofotoda, yeni izole edilmiş akciğer hücreleri, indirgenmiş büyüme faktörü bazal membran matrisi tip ikide gömülü olarak görülebilir.
Kistik organoidler zamanla ortaya çıkmış ve büyümüştür. Dördüncü pasajdan sonraki akciğer organoidleri burada gösterilmiştir. Mekanik kesmeden sonraki iki saat içinde, bazal membran ekstraktına gömülü organoid fragmanlar kistik alanları oluşturdu.
Aynı alanın beşinci gündeki mikrofotografı, zamanla organoid büyümesini doğruladı. Genişleyen organoidler, ACCTUB-pozitif veya FOXJ1-pozitif siliye hücre, P63-pozitif bazal hücre, CC10-pozitif kulüp hücresi ve MUC5AC-pozitif kadeh hücresi dahil olmak üzere dört ana hava yolu epitel hücre tipinin tümünü erken bir durumda barındırıyordu. Genleşme ve proksimal farklılaşma ortamında inkübe edilen organoidler zamanla farklı morfoloji geliştirmiştir.
Proksimal farklılaşma ortamında iki haftalık farklılaşmadan sonra, her organoidde hareketli kirpikler fark edilebildi. Senkron olarak dövülen celia'nın hücre kalıntılarını organoid lümenin içine sürdüğü ve solunan parçacıkları çıkarmak için tek yönlü olarak döndürdüğü gözlendi. Ayrıca, akım sitometrisi analizi, farklılaşmış organoidlerin proksimal diferansiyasyon ve genişleme ortamında dört hava yolu epitel hücre tipini barındırdığını göstermiştir.
İki haftalık farklılaşmadan sonra, 2D hava yolu organoidleri sağlam bir epitel bariyeri geliştirdi. 2D hava yolu organoidlerinde oluşan epitel bariyerinin bütünlüğünü değerlendirmek için bir dekstran blokaj testi yapıldı. 2D organoidler bol miktarda siliyer hücre içeriyordu.
Uzun süreli genişletilebilir akciğer organoidi ve farklılaşmış hava yolu organoidi, COVID-19 dahil olmak üzere solunum biyolojisi ve patolojisini incelemek için fizyolojik olarak aktif ve evrensel bir model sistemi sağlar.
