Yazarlar U19 AI157984, U01 DK103168, U19 AI144297, P30 DK56338, P01 AI057788, U19 AI116497 hibeleri ve NASA İşbirliği Anlaşması Bildirimi/TRISH NNX16AO69A.

Burada kullanılan organoid hatlar, Teksas Tıp Merkezi Sindirim Hastalıkları Merkezi GEMS Core'dan elde edildi. Kısaca, başlangıçta organoid hatları oluşturmak için, donör doku örnekleri yıkandı ve bağırsak kriptlerini serbest bırakmak için enzimatik olarak sindirildi. Kriptler bir bazal membrana gömüldü ve bir ortamda kültürlendi. Baylor College of Medicine'deki Kurumsal İnceleme Kurulu, organoid hatlarının oluşturulduğu doku örneklerinin alınması için çalışma protokolünü onayladı ve bağışlanan dokudan organoid hatlarının oluşturulması için tüm donörlerden bilgilendirilmiş onam alındı.
1. Farklılaşma için genişletmek için 3D HIO'ların geçirilmesi
<ol><li>Bir P1000 pipeti ile 24 oyuklu plakalarda (katı bazal membranın etrafında) büyütülen organoid kuyularından ortamı çıkarın ve atın. Kuyuya 300 μL% 0.05 Tripsin-EDTA ekleyin ve bir P1000 pipeti ile 5 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek organoidleri mekanik olarak parçalayın.</li>
	<li>Plakayı 37 °C'de 4 dakika inkübe edin. Her oyuğa %10 FBS içeren büyüme faktörleri (CMGF-orta) içermeyen 500 μL tam ortam ekleyin (Tablo 1). Bir P1000 pipet ve pipet CMGF ortamı ve HIO karışımı, kuyuda 10 kez ileri geri kullanın. Tüm hacmi 15 mL'lik bir tüpe aktarın. Birden fazla kuyudan geçişi aynı 15 mL'lik tüpte birleştirin. Tüp başına 10'dan fazla kuyu birleştirmeyin.</li>
	<li>5 dakika boyunca 100 x g'da bir döner rotorlu santrifüj kullanarak hücreleri 4 °C'de döndürün. Peleti tüpün altında tutarak tüm ortamı çıkarın. Tüpü buz üzerinde tutun.</li>
	<li>Kaplanan HIO sayısı için gereken bazal membran miktarını hesaplayın ve soğuk P200 pipet uçları kullanarak HIO peletini 30 μL/kuyu bazal membranda yeniden süspanse edin. HIO bazal membran karışımını, soğuk P200 pipet uçları kullanarak 24 oyuklu bir plakanın ortasına bir damlacık şeklinde pipetleyin.</li>
	<li>Plakayı 37 °C'lik bir inkübatöre aktarın. Bazal membranın 5-10 dakika katılaşmasına izin verin, ardından WNT, R-spondin, noggin, EGF ve ROCK inhibitörü (WRNE+Y; Tablo 1) 37 °C'lik bir inkübatörde her bir kuyuya ve kültüre. 7 gün boyunca her gün WRNE + Y ile kültürü yenileyin. NOT: Sağlıklı bir HIO, parlak tomurcuklanan bir epitel ile kistik bir şekle sahip olacaktır (Şekil 2). Kistin ortasındaki hücreler görüntülenemez. Sağlıksız bir HIO donuk görünecek ve sağlam bir ortası olan kalın bir epitele sahip olacaktır. En önemli özelliği parlak görünümüdür.</li>
</ol>2. HIO farklılaşması: 3D formatı
<ol><li>Kültürlemeden 1 hafta sonra 3 kuyu 3B farklılaştırılmış HIO için bir kuyu 3D HIO kullanın.</li>
	<li>Ortamı kuyulardan çıkarın. Bir P1000 pipeti kullanarak bazal membranı ve HIO'ları dağıtın ve oyuk başına soğuk 500 μL CMGF- ekleyin ve en az 5 kez yukarı ve aşağı pipetleyin. 5 dakika boyunca 100 x g'da bir döner rotor santrifüjü kullanarak HIO'ları 4 °C'de döndürün. Peleti tüpün dibinde tutarak tüm ortamı çıkarın.</li>
	<li>Kaplanan HIO'ların kuyusu başına 30 μL bazal membran ekleyin. 30 μL'lik bazal membran damlacığını HIO'larla 24 oyuklu bir plakanın kuyusuna pipetleyin. 37 °C'de 10 dakika inkübe edin. 500 μL WRNE+Y/Diff (50/50) ortam ekleyin.</li>
	<li>Ortamı 24 saat sonra 3 gün daha farklılaşma ortamına geçirin ve ortamı iki günde bir yenileyin. Teknik değişkenliği azaltmak için havuza numune başına 3 kuyu hazırlayın.</li>
</ol>3. HIO farklılaşması: Tek katmanlı format
<ol><li>Membran hücre kültürü eklerini veya 96 oyuklu bir plakanın kuyucuklarını soğuk H2O (1:30) ile seyreltilmiş 100 μL / kuyucuklu insan plasental kollajen IV (100mM asetik asit içinde 1 mg / ml) ile kaplayın. 37 ° C'de en az 1,5 saat veya en fazla gece boyunca inkübe edin. Membran hücre kültürü eki için, plakayı nemlendirmek için plaka boşluğuna steril H2O ekleyin; 96 oyuklu plaka için, kullanılmayan kuyucuklara steril H2O ekleyin.</li>
	<li>Ortamı çıkararak ve 500 μL / kuyu soğuk 0.5 mM EDTA (steril PBS'de 1:1000 seyreltilmiş 0.5 M EDTA) ekleyerek bazal membranı ve hücreleri geri kazanarak 7 gün boyunca WRNE'de kültürlenen 3D HIO'ları toplayın. Organoidleri ve çözeltiyi 5 kat yukarı ve aşağı pipetlemek için bir P1000 pipeti kullanın ve 15 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Tüp başına 10'dan fazla organoid kuyusu toplamayın. 4 °C'de sallanan bir kova rotorunda 300 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. NOT: 96 oyuklu bir plaka üzerinde 3 kuyu hazırlamak için 1 kuyucuklu 3D HIO kullanın. 1 membran hücre kültürü eki hazırlamak için, 1 oyuklu 3D HIO kullanın (tek hücrelerin tohumlama yoğunluğu yaklaşık 1-2 x 105 hücre/96 oyuklu plaka için kuyu, 2.5-3 x 105 hücre/zar hücre kültürü eki için kuyucuktur).</li>
	<li>Peleti tüpün dibinde bırakarak 500 μL ortamı çıkarın. 500 μL% 0.05 Tripsin / 0.5 mM EDTA ekleyerek ve 37 ° C'de 4-5 dakika inkübe ederek HIO'ları ayırın. Bir P50 kullanarak ~1000x boyunca kuvvetlice yukarı ve aşağı pipetleyin. Tüpün yan tarafına pipetleyerek kabarcık yapmaktan kaçının.</li>
	<li>% 10 FBS içeren 1 mL CMGF ekleyerek tripsini inaktive edin. 40 μm'lik bir hücre süzgecini %10 FBS içeren 1 mL CMGF ile ıslatarak ve hücreleri hücre süzgecinin üstüne ekleyerek büyük sindirilmemiş hücre kümelerini filtreleyin. Hücrelerin süzgeçten geçmesine izin vermek için yerçekimini kullanın ve hücre kümeleri içeren hücre süzgecini atın.</li>
	<li>Hücreleri, oda sıcaklığında sallanan bir kova rotorunda 400 x g'da 5 dakika santrifüjleyerek toplayın.</li>
	<li>Sıvıyı kollajen kaplı membran hücre kültürü ekinden veya 96 oyuklu plakadan çıkarın. HIO peletini 10 μM Y-27632 içeren 100 μL / oyuklu WRNE'de yeniden süspanse edin, daha sonra membran hücre kültürü ekinin üst bölmesine veya 96 oyuklu plakaya pipetleyin. Membran hücre kültürü eki için, kuyucuğun alt bölmesine 10 μM Y-27632 içeren 600 μL WRNE ekleyin.</li>
	<li>Ortamı 24 saat sonra membran hücre kültürü ekinin hem üst hem de alt kısmından veya 96 oyuklu plakadan çıkarın ve 5 gün boyunca farklılaşma ortamı ile değiştirin. Teknik değişkenliği azaltmak için havuza numune başına 3 kuyu hazırlayın.</li>
</ol>4. Tek hücreli transkriptomikler için farklılaşmış 3D HIO'lardan tek hücreli süspansiyonların hazırlanması
<ol><li>Enzimatik hücre sindirim reaktifini, 3D HIO sindiriminin başlamasından 30 dakika önce çözülmesi ve ısıtılması için bir CO2 inkübatörüne 37 ° C'de yerleştirin. Hücre sağlığını sağlamak için 10x'te parlak bir alan mikroskobu kullanarak HIO'ları kontrol edin.</li>
	<li>Ortamı kuyulardan çıkarın ve kuyucuklara 500 μL soğuk hücre geri kazanım çözeltisi ekleyin. Bir P1000 pipet ve standart pipet uçları kullanarak hücreleri bazal zardan kurtarmak için birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Hücre süspansiyonunu 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. NOT: Replike kuyucukların kullanılması, yeterli hücre sayısını sağlar ve kuyudan kuyuya varyasyonu azaltır. Aşağıdaki adım 4.7'den önce kuyucukları birleştirmeyin.</li>
	<li>Hücre tüplerini buz üzerinde 10 dakika inkübe edin, her 5 dakikada bir yukarı ve aşağı pipetleyin. Hücreleri 4 ° C'de 400 x g'da 3 dakika santrifüjleme ile toplayın.</li>
	<li>Hücre peletini rahatsız etmemeye dikkat ederek sıvıyı tüpten çıkarın. Hücreleri 500 μL önceden ısıtılmış enzimatik hücre sindirim reaktifi içinde yeniden süspanse edin. P1000 ile en az 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyin.</li>
	<li>HIO'ları bir CO2 inkübatörde 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin. Her 10 dakikada bir, hücrelerin ayrışmasına yardımcı olmak için bir P1000 pipet kullanarak tüm hacmi 10x pipetleyin. Hücre süspansiyonuna hava kabarcıkları sokmaktan kaçının.</li>
	<li>Hücreleri 4 ° C'de 400 x g'da 3 dakika boyunca peletleyin. Süpernatanı çıkarın, hücreleri 1 mL farklılaşma ortamında yeniden süspanse edin ve buz üzerinde saklayın. NOT: Bu noktadan itibaren, HIO'lar her zaman buz üzerinde tutulmalıdır.</li>
	<li>HIO'ların tek hücrelere ayrıldığından emin olmak için bir P50 kullanarak hücreleri hızlı bir şekilde 1000 kat yukarı ve aşağı pipetleyin. Hücre kaybına neden olacağı için bu adımda hava kabarcıkları oluşturmamaya dikkat edin.</li>
	<li>P1000 pipet ucu kullanarak tüm hacmi 70 μm'lik bir süzgeçten süzün. Elüatı toplamak için 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpü kullanın. NOT: Sindirim süresi yeterliyse filtre ucu tıkanmaz. Filtre tıkanırsa birden fazla filtre ucu kullanın; Sesi filtreden geçirmeye zorlamayın.</li>
	<li>4.8 μm'lik bir süzgeçle 40. adımı tekrarlayın. Numuneleri buz üzerinde saklayın.</li>
	<li>5 μL hücre süspansiyonuna 5 μL %0.4 tripan mavisi ekleyerek tripan mavisi dışlamasını kullanarak bir hücre sayma odasındaki canlı tek hücreleri sayın. Numuneyi gerektiği gibi 1000 hücre/μL'ye seyreltin. Hücre yoğunluğu 1000 hücre / μL'den azsa, hücreleri 4 ° C'de 400 x g'de 2 dakika boyunca pelet haline getirin, orijinal ortamı çıkarın ve hücre kültürü ortamında yeniden süspanse edin. Bu protokol tipik olarak 5 x 105-1 x 106 hücre verir. NOT: Yüksek kaliteli tek hücreli veriler için yüksek kaliteli bir süspansiyonun (%90 uygulanabilir ve %90 tek hücreli) hazırlanması çok önemlidir. Bununla birlikte, deneyimler, enfeksiyon veya küçük molekül uygulaması gibi tedavinin canlılığı etkilediği durumlarda% 75 kadar düşük bir canlılığın kabul edilebileceğini göstermektedir.</li>
	<li>Üreticinin protokollerine göre tek hücreli transkripsiyonel profil oluşturma platformları için DNA kitaplıkları hazırlayın. Verileri scRNAseq veri analiziiçin en iyi uygulama protokollerine göre işleyin 13,14.</li>
</ol>5. Membran hücre kültürü ekinde farklılaştırılan HIO'lardan tek hücre süspansiyonlarının hazırlanması
<ol><li>Enzimatik hücre sindirim reaktifini, HIO membran hücre kültürü eki sindiriminin başlamasından 30 dakika önce çözülmesi ve ısıtılması için bir CO2 inkübatörüne 37 ° C'de yerleştirin. Önceden ısıtılmış enzimatik hücre sindirim reaktifini, 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerinde 200 μL'lik alikotlara, zar hücre kültürü eki başına 1 tüpe bölün. Tüpleri kullanıma hazır olana kadar 37 °C inkübatörde saklayın.</li>
	<li>5 mL PBS'ye 5 μL 0,5 M EDTA ekleyerek PBS-EDTA'yı hazırlayın. 500 μL PBS-EDTA'yı 24 oyuklu bir plakaya, zar hücre kültürü eki başına 1 oyuklu bir plakaya alikot edin.</li>
	<li>Hücreleri PBS-EDTA ile yıkayın: membran hücre kültürü eklerini büyüme ortamı içeren kuyucuklardan PBS-EDTA içeren kuyucuklara aktarın. Hücre kültürü ortamını apikal taraftan çıkarın ve 100 μL PBS-EDTA ile değiştirin. Hücre tabakasını rahatsız etmemeye özen gösterin.</li>
	<li>Membran hücre kültürü eklerinin apikal tarafına eklenen PBS-EDTA'yı hemen atın. Membran hücre kültürü ekini kuyudan çıkarın, kenarını bir kağıt havluya hafifçe dokundurarak kurulayın ve ardından tezgah üzerinde ters çevirin. Zarın iç çevresini keserek zarı ek parçadan çıkarmak için keskin bir neşter bıçağı kullanın. Kurumayı önlemek için hızlı çalışın.</li>
	<li>Membranı, enzimatik hücre sindirim reaktifi ile doldurulmuş önceden ısıtılmış 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarmak için forseps kullanın ve zarın tamamen suya batırıldığından emin olun. Tüm ek membran hücre kültürü ekleri için tekrarlayın. NOT: Enzimatik hücre sindirim reaktifinin hacminin 500 μL'ye çıkarılması, yoğun tek tabakaların ayrılmasına yardımcı olabilir.</li>
	<li>Bir CO2 inkübatöründe 37 ° C'de membranlı tüpleri inkübe ederek hücreleri ayırın. Her 10 dakikada bir 200 μL'lik bir pipetle tüm hacmi 5x olacak şekilde toplam 30 dakika boyunca nazikçe pipetleyerek karıştırın. Canlılığı korumak için kabarcıklardan ve zarın emilmesinden kaçının.</li>
	<li>Tek hücrelerin yüzdesini kalitatif olarak değerlendirerek ayrışmayı değerlendirmek için her 10 dakikada bir küçük bir hücre alikotunu (1-2 μL) bir cam slayta aktarın. HIO tipine bağlı olarak %80 ila %90 tek hücre elde etmek ek pipetleme ile 50 dakikaya kadar sürebilir. Özellikle ayrışması zor hücreler için ayrışmayı teşvik etmek için karıştırma adımları sırasında zarı bir pipet ucuyla nazikçe kazıyın, ancak kazıma canlılığı etkileyebilir.</li>
	<li>Tek bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpünde (toplam 600 μL) koşul başına 3 çoğaltma kuyusunu birleştirin. 400 μL hücre kültürü ortamı (fark) + 10 μM ROCKi (1 mL toplam hacim) ekleyin. Pipetleme ile nazikçe karıştırın. NOT: Replike kuyucukların kullanılması, yeterli hücre sayısını sağlar ve kuyudan kuyuya varyasyonu azaltır. Kuyular bu adımda bir araya getirilmelidir.</li>
	<li>1 mL'lik bir pipet ucu kullanarak tüm hacmi 70 μm'lik bir süzgeçten süzün. Akışı 1,5 mL'lik yeni bir mikrosantrifüj tüpünde toplayın. NOT: Sindirim süresi yeterliyse filtre ucu tıkanmaz. Filtre tıkanırsa birden fazla filtre ucu kullanın; Sesi zorlamayın.</li>
	<li>Adım 5.9'u 40 μm'lik bir süzgeçle tekrarlayın. Numuneleri buz üzerinde saklayın.</li>
	<li>5 μL hücre süspansiyonuna 5 μL %0.4 tripan mavisi ekleyerek tripan mavisi dışlamasını kullanarak bir hücre sayma odasındaki canlı tek hücreleri sayın. Numuneyi gerektiği gibi 1000 hücre / μL'ye seyreltin. Hücre yoğunluğu 1000 hücre / μL'den azsa, hücreleri peletlemek için 4 ° C'de 400 x g'de 2 dakika döndürün, orijinal ortamı çıkarın ve istenen hücre yoğunluğunda WRNE + Y'de yeniden süspanse edin. Bu protokol tipik olarak 4 x 105 - 6 x 105 hücre verir. NOT: Yüksek kaliteli tek hücreli veriler için yüksek kaliteli süspansiyonun (%90 uygulanabilir ve %90 tek hücreli) hazırlanması çok önemlidir. Bununla birlikte, deneyimler, enfeksiyon veya küçük molekül uygulaması gibi tedavinin canlılığı etkilediği durumlarda% 75 kadar düşük bir canlılığın kabul edilebileceğini göstermektedir.</li>
	<li>Üreticinin protokollerine göre tek hücreli transkripsiyonel profil oluşturma platformları için DNA kitaplıkları hazırlayın. Verileri scRNAseq veri analiziiçin en iyi uygulama protokollerine göre işleyin 13,14.</li>
</ol>6. 96 oyuklu tek tabakalar olarak farklılaştırılan HIO'lardan tek hücreli süspansiyonların hazırlanması
<ol><li>Enzimatik hücre sindirim reaktifini, tek katmanlı HIO sindiriminin başlamasından 30 dakika önce çözülmesi ve ısıtılması için bir CO2 inkübatörüne 37 ° C'ye yerleştirin.</li>
	<li>5 mL PBS'ye 5 μL 0,5 M EDTA ekleyerek PBS-EDTA'yı hazırlayın. Hücre kültürü ortamını 96 oyuklu plakadan atın ve 100 μL PBS-EDTA ile değiştirin. Hücre tabakasını rahatsız etmemeye özen gösterin.</li>
	<li>Hücreleri ayırın: PBS-EDTA'yı atın ve her oyuğa 100 μL ılık enzimatik hücre sindirim reaktifi ekleyin. Plakayı %5 CO2 inkübatörde 37 °C'ye yerleştirin ve 20-30 dakika boyunca her 10 dakikada bir 200 μL'lik bir pipet ucuyla tüm hacmi 5x hafifçe pipetleyerek karıştırın. Canlılığı korumak için baloncuklardan kaçının. NOT: Enzimatik hücre sindirim reaktifinin hacminin 500 μL'ye çıkarılması, yoğun tek tabakaların ayrılmasına yardımcı olabilir.</li>
	<li>Ayrışmayı değerlendirmek için her 10 dakikada bir küçük bir hücre alikotunu (1-2 μL) bir cam slayta aktarın. HIO tipine bağlı olarak% 80 -% 90 tek hücre elde etmek 50 dakika kadar sürebilir. Özellikle ayrışması zor hücreler için ayrışmayı teşvik etmek için karıştırma adımları sırasında plakayı bir pipet ucuyla nazikçe kazıyın; Bununla birlikte, kazıma canlılığı etkileyebilir.</li>
	<li>Tek bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpünde (toplam 300 μL) koşul başına 3 çoğaltma kuyusunu birleştirin. 700 μL hücre kültürü ortamı (fark) + 10 uM ROCKi (1 mL toplam hacim) ekleyin. Pipetleme ile nazikçe karıştırın. NOT: Çoğaltılmış kuyuların kullanılması, yeterli hücre sayısını sağlar ve kuyudan kuyuya varyasyonu azaltır.</li>
	<li>1 mL'lik bir pipet ucu kullanarak tüm hacmi 70 μm'lik bir süzgeçten süzün. Akışı 1,5 mL'lik yeni bir mikrosantrifüj tüpünde toplayın. NOT: Enzimatik hücre sindirim reaktifi sindirim süresi yeterliyse filtre ucu tıkanmaz. Filtre tıkanırsa birden fazla filtre ucu kullanın; Sesi zorlamayın.</li>
	<li>Adım 6.6'yı 40 μm'lik bir süzgeçle tekrarlayın. Numuneleri buz üzerinde saklayın.</li>
	<li>5 μL hücre süspansiyonuna 5 μL %0.4 tripan mavisi ekleyerek tripan mavisi dışlamasını kullanarak bir hücre sayma odasındaki canlı tek hücreleri sayın. Gerektiği gibi 1000 hücre / μL'ye seyreltin. Hücre yoğunluğu 1000 hücre / μL'den azsa, hücreleri peletlemek için 400 x g 4 ° C'de 2 dakika döndürün, orijinal ortamı çıkarın ve istenen hücre yoğunluğunda hücre kültürü ortamı + ROCKi'de yeniden süspanse edin. Bu protokol tipik olarak 2 x 105 - 6 x 105 hücre verir. NOT: Yüksek kaliteli tek hücreli veriler için yüksek kaliteli süspansiyonun (%90 uygulanabilir ve %90 tek hücreli) hazırlanması çok önemlidir. Bununla birlikte, deneyimler, enfeksiyon veya küçük molekül uygulaması gibi tedavinin canlılığı etkilediği durumlarda% 75 kadar düşük bir canlılığın kabul edilebileceğini göstermektedir.</li>
	<li>DNA kütüphanelerini tek hücreli transkripsiyonel profil oluşturma platformu üreticisinin protokollerine göre hazırlayın. Verileri scRNAseq veri analiziiçin en iyi uygulama protokollerine göre işleyin 13,14.</li>
</ol>

Tek Hücreli Transkriptomiklerin İnsan Bağırsak Organoidleri ile Entegre Edilmesi

<ol>
	<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Blutt, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+microphysiological+systems.">Gastrointestinal microphysiological systems.</a> Exp Biol Med. 242 (16), 1633-1642 (2017).</li><li>VanDussen, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+enhanced+human+gastrointestinal+epithelial+culture+system+to+facilitate+patient-based+assays.">Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays.</a> Gut. 64 (6), 911-920 (2015).</li><li>Elmentaite, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+of+the+human+intestinal+tract+mapped+across+space+and+time.">Cells of the human intestinal tract mapped across space and time.</a> Nature. 597 (7875), 250-255 (2021).</li><li>Hickey, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+the+human+intestine+at+single-cell+resolution.">Organization of the human intestine at single-cell resolution.</a> Nature. 619 (7970), 572-584 (2023).</li><li>Burclaff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proximal-to-distal+survey+of+healthy+adult+human+small+intestine+and+colon+epithelium+by+single-cell+transcriptomics.">A proximal-to-distal survey of healthy adult human small intestine and colon epithelium by single-cell transcriptomics.</a> Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 13 (5), 1554-1589 (2022).</li><li>Triana, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomics+reveals+immune+response+of+intestinal+cell+types+to+viral+infection.">Single-cell transcriptomics reveals immune response of intestinal cell types to viral infection.</a> Mol Syst Biol. 17 (7), e9833 (2021).</li><li>Triana, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analyses+reveal+SARS-CoV-2+interference+with+intrinsic+immune+response+in+the+human+gut.">Single-cell analyses reveal SARS-CoV-2 interference with intrinsic immune response in the human gut.</a> Mol Syst Biol. 17 (4), e10232 (2021).</li><li>Fujii, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+intestinal+organoids+maintain+self-renewal+capacity+and+cellular+diversity+in+niche-inspired+culture+condition.">Human intestinal organoids maintain self-renewal capacity and cellular diversity in niche-inspired culture condition.</a> Cell Stem Cell. 23 (6), 787-793 (2021).</li><li>Beumer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP+gradient+along+the+intestinal+villus+axis+controls+zonated+enterocyte+and+goblet+cell+states.">BMP gradient along the intestinal villus axis controls zonated enterocyte and goblet cell states.</a> Cell Rep. 38 (9), 110438 (2022).</li><li>Beumer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+mRNA+and+secretome+atlas+of+human+enteroendocrine+cells.">High-resolution mRNA and secretome atlas of human enteroendocrine cells.</a> Cell. 182 (4), 1062-1064 (2020).</li><li>Busslinger, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+gastrointestinal+epithelia+of+the+esophagus,+stomach,+and+duodenum+resolved+at+single-cell+resolution.">Human gastrointestinal epithelia of the esophagus, stomach, and duodenum resolved at single-cell resolution.</a> Cell Rep. 34 (10), 108819 (2021).</li><li>Luecken, M. D., Theis, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+best+practices+in+single-cell+RNA-seq+analysis:+a+tutorial.">Current best practices in single-cell RNA-seq analysis: a tutorial.</a> Mol Syst Biol. 15 (6), e8746 (2019).</li><li>Heumos, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Best+practices+for+single-cell+analysis+across+modalities.">Best practices for single-cell analysis across modalities.</a> Nat Rev Genet. 24 (8), 550-572 (2023).</li></ol>

Yazarların herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Tek hücreli genomik platformlar kullanılarak, bağırsak epitelini modelleyen doku türevli HIO kültürleri gibi karmaşık biyolojik sistemler, genel biyolojik yanıtabireysel hücresel katkılar sağlamak için parçalanabilir 4,5,6. Hücresel heterojenlik ve nadir hücre popülasyonları da tanımlanabilir ve sorgulanabilir. Tek hücreli transkriptomik tabanlı platformlar kullanılarak çıktıyı en üst düzeye çıkarm...

İnce bağırsak epitelinin iki ayrı bölgesi vardır: bağırsak kök hücresini (ISC) barındıran kript ve salgı ve emici soyların farklılaşmış hücrelerinden oluşan villus. Bu karmaşıklığa ek olarak, ince bağırsak bölgeleri arasında benzersiz fonksiyonel özellikler sağlayan epitelin bölgesel özgüllüğü de vardır. Öncü çalışmalar, hem insan ince bağırsak kriptinin hem de villus bölgelerinin cerrahi dokulardan veya doku biyopsilerinden ex vivo olarak oluşturulabileceği kültür koşullarını oluşturmuştur1. Bu kültürler, hayvan çalışmaları ile klinik deneyler arasındaki boşluğu dolduruyor ve daha önce tanınmayan hücre biyolojisini, biyokimyasını ve gastrointestinal sistemin fizyolojisini ortaya çıkarıyor. HIO'lar, kök hücre canlılığını ve hücre dışı destek matrislerini destekleyen büyüme faktörlerine sahip bir ortam kullanılarak 3D küresel yapılar olarak yayılır. Bu koşullar, çoğunlukla progenitörlerden ve kök hücrelerden oluşan kript benzeri bir HIO modeli ile sonuçlanır. Büyüme faktörlerinin uzaklaştırılması, hücre proliferasyonu ve farklılaşması, polarizasyon, bariyer bütünlüğü, bölgesel spesifik özellikler ve uygun fizyolojik yanıtlar ile birlikte uygun oranlarda ISC farklılaşmasını (villus benzeri model) ve olgun bağırsak epitel hücrelerinin (goblet, enteroendokrin, tutam, enterosit) üretimini teşvik eder2. HIO kültürleri genetik olarak kararlıdır ve kript benzeri durumlarında süresiz olarak çoğaltılabilir. Bu kültürlerin apikal yüzeyine kolay erişim, tek katmanlı bir formatta büyümeye izin veren kültür koşulları ile sağlanır3. HIO'lar ayrıca genetik, yaş, cinsiyet, etnik köken ve hastalık durumu gibi konakçı bireysel değişkenliğin dikkate alınmasının biyolojik analizlere dahil edilmesine izin verir. Analitik ve fonksiyonel değerlendirme araçları, dönüştürülmüş hücre hatlarına odaklanan yaklaşımlarda kullanılanlarla aynıdır ve akış sitometrisi, mikroskopi, transkriptomik, proteomik ve metabolomik gibi çeşitli moleküler teknikleri içerir.
Tek hücreli transkriptomik, her hücre tipinin biyolojik bir sürece bireysel katkıları hakkında bilgi sağlayarak ince bağırsağın biyolojisi ve fizyolojisi hakkındaki anlayışımızda devrim yaratıyor. Bu teknolojiyi kullanan öncü çalışmalar, doğal insan bağırsağında bulunan hücre tiplerinin bir manzarasını sağlamıştır 4,5,6. Tek hücreli transkripsiyonel profil oluşturma platformları, tek tek hücrelerin transkripsiyonel manzarasının araştırılmasına izin vererek, hücre heterojenliğinin bilimsel araştırmaların ön saflarında yer almasına izin verir. Bazı tek hücreli transkripsiyonel profil oluşturma platformlarında, numune başına 10.000'e kadar hücreden elde edilen hücresel poliadenillenmiş mRNA'lardan cDNA kitaplıkları oluşturmak için mikroakışkan bölümleme ve barkodlama kullanılır. Bu platformda, tek hücreler, barkodlu oligonükleotidler, ters transkripsiyon reaktifleri ve yağ içeren damlacıklar, tek bir hücreden gelen tüm cDNA'ların aynı barkoda sahip olmasıyla sonuçlanan bir reaksiyon vezikülü oluşturur. Barkodlu cDNA'lar daha sonra yeni nesil dizileme kullanılarak verimli bir şekilde dizilenebilir. Oluşturulan veriler, barkodlu dizileri görselleştirme haritalarına ve tek hücreli transkripsiyonel profillere dönüştüren yazılım ve görselleştirme araçları aracılığıyla işlenebilir. Hücre popülasyonları, insan ince bağırsak epitelinin halka açık veri tabanları kullanılarak tanımlanabilir 4,5,6. Birçok çalışma, murin bağırsak organoidlerini tek hücre düzeyinde sorgulamak için bu platformu kullanmış olsa da, HIO'ların tek hücreli transkripsiyonel yanıtlarının analizi 7,8,9,10,11,12'nin gerisinde kalmıştır.
Burada, tek hücreli transkripsiyonel profil oluşturma platformlarında işlenmek üzere ince bağırsak HIO'larından canlı hücreleri izole etmek için adım adım bir kılavuz sunuyoruz (Şekil 1). Epitelyal farklılaşma için optimize edilmiş medya bileşenleriyle birlikte kültürleme ve farklılaşma kılavuzları sağlıyoruz. Üç farklı kültür formatı için hücre geri kazanım yöntemlerini özetliyoruz: plastik veya membran hücre kültürü ekleri üzerinde üç boyutlu (3D) ve tek katmanlı kültürler. Her kümede diferansiyel olarak ifade edilen genleri türetmek için açık kaynaklı yazılım kullanılarak elde edilen örnek kümeleme verileri sağlıyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>[Leu15]-Gastrin I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9145</td>
			<td>10 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4% Trypan blue</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-034-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS Ca- Mg-</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 mm Transwell</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well Nunclon delta surface tissue culture dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>142475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m Flowmi tip strainer</td>
			<td>SP Bel-Art Labware</td>
			<td>H13680-0040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m Flowmi tip strainer</td>
			<td>SP Bel-Art Labware</td>
			<td>H13680-0070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-83-01</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2939</td>
			<td>500 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12634-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Next GEM Single Cell 3&#8217; GEM, Library &#38; Gel Bead Kit v3.1</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>PN-1000128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5533-5MG</td>
			<td>33 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Cell Recovery Solution&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>354253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (Mg2-, Ca2-)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14190-136</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX-I</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1M</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-WRN conditioned media</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3276</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, GFR, phenol free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse recombinant EGF</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PMG8043</td>
			<td>50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetylcysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165-5G</td>
			<td>500 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7067</td>
			<td>10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>72308</td>
			<td>10 &#181;M</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using human intestinal organoids to understand the small intestine epithelium at the single cell transcriptional level

Tek hücreli transkriptomik, insan vücudunun hücre biyolojisi anlayışımızda devrim yarattı. Son teknoloji insan ince bağırsak organoid kültürleri, hayvan modelleri ve klinik çalışmalar arasındaki boşluğu dolduran ex vivo model sistemleri sağlar. Tek hücreli transkriptomiklerin insan bağırsak organoid (HIO) modellerine uygulanması, daha önce tanınmayan hücre biyolojisini, biyokimyasını ve GI yolunun fizyolojisini ortaya çıkarmaktadır. Gelişmiş tek hücreli transkriptomik platformlar, cDNA kitaplıkları oluşturmak için mikroakışkan bölümleme ve barkodlama kullanır. Bu barkodlu cDNA'lar, yeni nesil dizileme platformları tarafından kolayca dizilenebilir ve haritalar oluşturmak için çeşitli görselleştirme araçları tarafından kullanılabilir. Burada, insan ince bağırsak HIO'larını farklı formatlarda kültürlemek ve ayırt etmek için yöntemleri ve tek hücreli transkripsiyonel profilleme platformlarında kullanıma uygun olan bu formatlardan canlı hücreleri izole etmek için prosedürleri açıklıyoruz. Bu protokoller ve prosedürler, çeşitli farklı ortamlar bağlamında transkripsiyonel düzeyde insan bağırsak epitelinin hücresel tepkisinin daha iyi anlaşılmasını sağlamak için ince bağırsak HIO'larının kullanımını kolaylaştırır.

The small intestinal epithelium has two distinct zones: the crypt that houses the intestinal stem cell (ISC) and the villus, which is comprised of differentiated cells of the secretory and absorptive lineages. Adding to this complexity is the regional specificity of the epithelium that provides unique functional properties between the regions of the small intestine. Pioneering work established culture conditions in which both the human small intestinal crypt and villus zones can be generated ex vivo from surgical tissues or tissue biopsies1. These cultures are bridging the gap between animal studies and clinical trials and are revealing previously unrecognized cell biology, biochemistry, and physiology of the gastrointestinal tract. The HIOs are propagated as 3D spherical structures using a media with growth factors that promote stem cell viability and extracellular support matrices. These conditions result in a crypt-like HIO model that consists mostly of progenitors and stem cells. Removal of the growth factors promotes ISC differentiation (villus-like model) and production of mature intestinal epithelial cells (goblet, enteroendocrine, tuft, enterocyte) in appropriate ratios along with cell proliferation and differentiation, polarization, barrier integrity, regional specific features, and appropriate physiological responses2. HIO cultures are genetically stable and can be propagated indefinitely in their crypt-like state. Easy access to the apical surface of these cultures is provided by culture conditions that allow growth in a monolayer format3. HIOs also allow considerations of host individual variability such as genetics, age, sex, ethnicity, and disease status to be included in biological analyses. Analytic and functional assessment tools are identical to those used in approaches centered on transformed cell lines and include a variety of molecular techniques such as flow cytometry, microscopy, transcriptomics, proteomics, and metabolomics.
Single cell transcriptomics is revolutionizing our understanding of the biology and physiology of the small intestine by providing insight into the individual contributions of each cell type to a biological process. Pioneering work using this technology has provided a landscape of the cell types present in the native human intestine4,5,6. Single cell transcriptional profiling platforms allow exploration of the transcriptional landscape of individual cells, allowing cell heterogeneity to come to the forefront of scientific exploration. In some single cell transcriptional profiling platforms, microfluidic partitioning and barcoding are used to generate cDNA libraries from cellular polyadenylated mRNAs obtained from up to 10,000 cells per sample. On this platform, droplets containing single cells, barcoded oligonucleotides, reverse transcription reagents, and oil form a reaction vesicle that results in all cDNAs from a single cell having the same barcode. The barcoded cDNAs can then be efficiently sequenced using next generation sequencing. Data generated can be handled through software and visualization tools, which convert the barcoded sequences into visualization maps and single cell transcriptional profiles. Cell populations can be identified using publicly available databases of human small intestinal epithelium4,5,6. Although many studies have utilized this platform to interrogate murine intestinal organoids at the single cell level, the analysis of single cell transcriptional responses of HIOs has lagged behind7,8,9,10,11,12.
Here, we provide a step-by-step guide to isolating viable cells from small intestinal HIOs for processing on single cell transcriptional profiling platforms (Figure 1). We provide culturing and differentiation guidelines along with media components that have been optimized for epithelial differentiation. We outline cell recovery methods for three different culture formats: three dimensional (3D) and monolayer cultures either on plastic or on membrane cell culture inserts. We provide sample clustering data obtained using open-source software to derive differentially expressed genes in each cluster.

Yazar Spotlight: İleri Araştırma ve Terapötik İçgörüler için Tek Hücreli Transkriptomikleri Organoid Kültürlerle Entegre Etme

Tek Hücreli Transkripsiyonel Seviyede İnce Bağırsak Epitelini Anlamak için İnsan Bağırsak Organoidlerini Kullanma

We are integrating single-cell transcriptomics and organoid technology to better understand the biology of the small intestine. These technologies are allowing us deeper insight into the cellular heterogeneity that exists within that tissue. The tools that improve the throughput, sensitivity, and the resolutions are the keys that advanced research in the field.Some examples are improved computational methods and the technological innovations. Cost reductions also a major focus. The process of preparing and sequencing the libraries of samples can cause transcription variations, which is one challenge.For organoids, specific challenges include limited spatial context or information about temporal dynamics. Single-cell analysis of the human intestinal organoids provides previously unattainable information into the cell types that make up the intestinal epithelium. This, thereby, opens the window to the transcriptional landscape of those cells.We are using these technologies to identify biomarkers and mechanisms of human intestinal diseases. These biomarkers and mechanisms will advance our ability to utilize personalized medicine-based approaches to treat human disease and improve human health overall.

Tek hücreli süspansiyonlar, yeterli hücre verimini sağlamak ve kuyudan kuyuya varyasyonu azaltmak için 2-3 kuyulu membran hücre kültürü eki, tek tabaka ve 3D HIO'lardan toplandı. Tek hücre kütüphaneleri, tek hücreli transkripsiyonel profilleme platformuna özgü reaktifler kullanılarak hazırlandı. ve 30.000 okuma/hücre olan yeni nesil bir sıralama platformunda eşleştirilmiş uç okumalarla sıralanır. Okumalar, tek hücreli genomik için analitik araçlar kullanılarak haritalandı, sayıldı ve ana...

Protokol, daha önce keşfedilmemiş bağırsak biyolojisi hakkında önemli bilgiler sağlamak için insan bağırsak organoid teknolojisini tek hücreli transkriptomik analizle birleştirir.

Single cell transcriptomics has revolutionized our understanding of the cell biology of the human body. State-of-the-art human small intestinal organoid ...

using-human-intestinal-organoids-to-understand-small-intestine

Research

JoVE Journal

Biology

Using Human Intestinal Organoids to Understand the Small Intestine Epithelium at the Single Cell Transcriptional Level

406 Görüntüleme.  Baylor College of Medicine. İnce bağırsağın biyolojisini daha iyi anlamak için tek hücreli transkriptomik ve organoid teknolojisini entegre ediyoruz. Bu teknolojiler, o dokuda var olan hücresel heterojenlik hakkında daha derin bir içgörü sağlıyor. Verimi, hassasiyeti ve çözünürlüğü artıran araçlar, bu alandaki araştırmaları ilerleten anahtarlardır.Bazı örnekler, gelişmiş hesaplama yöntemleri ve teknolojik yeniliklerdir. Maliyet düşürme de öneml...

Video: Yazar Spotlight: İleri Araştırma ve Terapötik İçgörüler için Tek Hücreli Transkriptomikleri Organoid Kültürlerle Entegre Etme

Single cell transcriptomics has revolutionized our understanding of the cell biology of the human body. State-of-the-art human small intestinal organoid cultures provide ex vivo model systems that bridge the gap between animal models and clinical studies. The application of single cell transcriptomics to human intestinal organoid (HIO) models is revealing previously unrecognized cell biology, biochemistry, and physiology of the GI tract. The advanced single cell transcriptomics platforms use microfluidic partitioning and barcoding to generate cDNA libraries. These barcoded cDNAs can be easily sequenced by next generation sequencing platforms and used by various visualization tools to generate maps. Here, we describe methods to culture and differentiate human small intestinal HIOs in different formats and procedures for isolating viable cells from these formats that are suitable for use in single-cell transcriptional profiling platforms. These protocols and procedures facilitate the use of small intestinal HIOs to obtain an increased understanding of the cellular response of human intestinal epithelium at the transcriptional level in the context of a variety of different environments.

The protocol combines human intestinal organoid technology with single cell transcriptomic analysis to provide significant insight into previously unexplored intestinal biology.

Biyoloji

Preparation of Single Cell Suspensions from Differentiated 3D Human Intestinal Organoids for Single Cell Transcriptomics

To begin, thaw the enzymatic cell digestion reagent at 37 degrees Celsius for 30 minutes. Under a brightfield microscope at 10x magnification, observe the differentiated three-dimensional human intestinal organoids to ensure cell health. Replace the media from the wells of a 24-well plate containing differentiated organoids with 500 microliters of cold cell recovery solution.Pipette up and down to release the cells from the basement membrane. Transfer the cell suspension to a 1.5-milliliter microcentrifuge tube. Incubate the tube on ice for 10 minutes, pipetting up and and down every five minutes.Centrifuge the cell suspension at 400 g for three minutes at four degrees Celsius. Remove the supernatant from the tube without disturbing the pellet. Resuspend the pellet in 500 microliters of prewarmed enzymatic cell digestion reagent, pipetting up and down 10 times.Place the organoids for 30 minutes at 37 degrees Celsius in a carbon dioxide incubator. Every 10 minutes, pipette the entire volume 10 times using a P1000 pipette to help dissociate the cells. Centrifuge the cell suspension at 400 g for three minutes at four degrees Celsius, and resuspend the pellet in one milliliter of differentiation media.Rapidly pipette the cells up and down 50 times on ice to dissociate organoids into single cells. Filter the entire volume through a 70 micron tip strainer and collect the eluate in a fresh 1.5-milliliter tube. Then filter the eluate obtained through a 70 micron strainer on a 40 micron tip strainer.Add five microliters of 0.4%Trypan Blue to five microliters of cell suspension, and count viable single cells using Trypan Blue Exclusion. Dilute the sample with cell culture media to obtain 1000 cells per microliter. A total of 4, 402 single cells were isolated from differentiated ileal three-dimensional human intestinal organoids, representing expected cell types, including absorptive enterocytes and secretory cells.

Tek Hücreli Transkriptomikler için Farklılaşmış 3D İnsan Bağırsak Organoidlerinden Tek Hücreli Süspansiyonların Hazırlanması

Preparation of Single Cell Suspensions from Human Intestinal Organoids Differentiated on Membrane Cell Culture Insert

To begin, place the 15 milliliter tube containing prewarmed enzymatic cell digestion reagent in a 37 degree Celsius incubator until use. Aliquot 500 microliters of freshly prepared PBS/EDTA into the wells of a 24 well plate. Under a brightfield microscope, observe the growth of differentiated three dimensional human intestinal organoids and transwells.Transfer the cell culture inserts from the growth media to the PBS/EDTA solution. Remove the culture media from the apical side and replace it with 100 microliters of PBS/EDTA without disturbing the cell layer. After discarding PBS/EDTA, remove the insert from the well, blot it gently onto the edge of a paper towel and inverted on the bench top.Using a sharp scalpel blade, cut around the inner circumference of the membrane to remove the membrane from the insert. Transfer the membrane with forceps to the 1.5 milliliter tube containing 200 microliters of prewarmed enzymatic cell digestion reagent. Place the membrane for 30 minutes at 37 degrees Celsius in a carbon dioxide incubator.Every 10 minutes, pipette the entire volume five times using a P 200 pipette. Transfer, one to two microliters of cell suspension to a glass slide every 10 minutes to assess dissociation by qualitatively assessing the percentage of single cells. After dissociation, combine three replicate wells per condition in a single 1.5 milliliter micro centrifuge tube.Add 400 microliters of cell culture differentiation medium containing 10 micromolar ROCK inhibitor and mix gently by pipetting. Filter the entire volume through a 70 micron tip strainer, collecting the flowthrough in a fresh 1.5 milliliter tube. Then filter the flowthrough obtained through a 70 micron strainer on a 40 micron tip strainer.Add five microliters of 0.4%trypan blue to five microliters of cell suspension and count viable single cells. Dilute the sample with WRNE growth medium to obtain 1, 000 cells per microliter. A total of 5, 623 single cells were isolated from differentiated jejunal human intestinal organoids grown on membrane cell culture inserts.

Membran Hücre Kültürü Ekinde Farklılaşan İnsan Bağırsak Organoidlerinden Tek Hücreli Süspansiyonların Hazırlanması

Preparation of Single Cell Suspensions from Human Intestinal Organoids Differentiated as 96 Well Monolayers

To begin, prepare enzymatic cell digestion reagent and PBS/EDTA for human intestinal organoids digestion. Under a brightfield microscope, confirm the growth of differentiated three-dimensional human intestinal organoids as monolayers. Discard the cell culture media from monolayer culture and replace it with 100 microliters of PBS/EDTA.After removing PBS/EDTA, add 100 microliters of warm enzymatic cell digestion reagent to each well. Place the plate at 37 degrees Celsius in 5%carbon dioxide incubator and pipette the entire volume five times every 10 minutes for 20 to 30 minutes. Transfer one to two microliters of cell suspension to a glass slide every 10 minutes to assess dissociation by observing the percentage of single cells.After dissociation, combine three replicate wells per condition in a single 1.5 milliliter microcentrifuge tube. Add 700 microliters of cell culture differentiation medium containing 10 micromolar ROCK inhibitor, and mixed gently by pipetting. Filter the entire volume through a 70 micron tip strainer, collecting the flow-through in a fresh 1.5 milliliter tube.Filter the flow-through obtained through a 70 micron strainer on a 40 micron tip strainer. Add five microliters of 0.4%Trypan Blue to five microliters of cell suspension, and count viable single cells. Dilute the sample with cell culture media containing ROCK inhibitor to obtain 1, 000 cells per microliter.A total of 9, 952 single cells were isolated from differentiated intestinal human intestinal organoids grown in 96 well plates.