Yağ biyolojisi alanındaki zorluklardan biri de kültürde olgun adipositi korumakolmuştur. Biz büyük değişiklikler boyunca uzun vadeli adiposit çalışma sağlayan yeni bir yöntem geliştirdik. Bizim adiposit kültür tekniği hücre etkileşimleri çalışma sağlar ve umarım diyabet ve obezite için yeni tedavilerin geliştirilmesi için yararlı olacaktır.
Olgun adipositlerin gen kalitesini ve canlılığını büyük ölçüde etkileyen bazı kritik adımlar olduğundan protokolü dikkatle takip etmek önemlidir. Örneğin, kaplama önce tüm serbest lipid ve yıkama tampon kaldırıldı emin olun aksi takdirde lipocytes ekler ters olduğunda rip off olabilir. İnsan deri altı yağ dokusu örneği aldıktan sonra, 15 santimetre Petri çanak steril bir biyolojik güvenlik kabininde doku yerleştirin.
Çanak orta 199 küçük bir hacim. Doku içinde büyük fibrotik damarları kavramak için cımbız kullanın ve yavaşça adipositler serbest bırakmak için damar boyunca yağ hurda makas kapalı bir çift ucunun arka kullanın. Tüm hücreler toplandığında fibrotik doku büyük parçaları atın ve kesilmiş yağ tartmak.
Daha fazla yağ dokusu hücreleri serbest bırakmak için, yeni bir 15 santimetre Petri çanak içine yağ dokusu nun 10 gram aktarın ve yağ dikkatlice yağ kıyma kullanabilirsiniz yağ büyük parçalar ile pürüzsüz bir homojen karışım haline gelene kadar. Tüm yağ işlendiğinde, tek tek 50 mililitre tüpler içine kıyma doku 10 mililitre aktarmak için bir kaşık kullanın ve her tüp için sindirim tampon 30 mililitre ekleyin. Daha sonra tüpleri 37 santigrat derecede sallayarak bir kuluçka makinesine yerleştirin ve 30 ila 35 dakika boyunca dakikada 150 dönüş yerleştirin.
Yağ çözeltisi homojen, kayısı renkli ve büyük parçalar olmadığında sindirim tamamlanır. Sindirim sonunda, steril bir litre likat içine ayarlanmış bir huni içinde 250 mikrometre örgü filtre içine sindirilmiş yağ çözeltisi decant. Adiposit süspansiyonunun tüm hacmi atlatıldığında, adipositlerin verimini artırmak için kafes filtresini hafifçe sıkın ve filtreyi tekrar sıkmadan önce 50 ila 100 mililitre yıkama tamponuyla yıkayın.
İzole edilmiş adiposit çözeltisini bir ayırma hunisine aktarın ve huni neredeyse tamamen dolana kadar yıkama tamponu ekleyin. Adiposit süspansiyonu tamponla karıştırmak için huniyi birkaç kez hafifçe ters çevirin ve katmanların ayrı bir ayrımı olana kadar süspansiyonun 2-3 dakika bekletin. Katmanlar ayrıldığında, huniüzerindeki nozulu açın ve alt çözeltiyi yavaşça steril bir şişeye dönüştürün.
Tüm kollajenaz çıkarıldığında, 50 mililitrekonik tüpler saflaştırılmış olgun adiposit çözeltisi toplamak ve hafifçe santrifüj ile hücreleri paketi. Daha sonra, adiposit süspansiyon altında kalan yıkama tampon kaldırmak için bir 18 gauge iğne ile donatılmış bir 10 mililitreşü kullanın ve olgun adipositler üzerinde yüzen serbest lipid tabakası kaldırmak için bir pipet kullanın. Olgun adipositlerin tohumlanması için, geçirimli membran kesici bileşeni steril bir yüzeye ters yerleştirin ve hücrelerin eşit dağılımını sağlamak için paketlenmiş adiposittüplerini birkaç kez hafifçe ters çevirin.
Geniş delikli pipet ucu kullanarak, her membran üzerine paketlenmiş olgun adipositler 30 mikrolitre ekleyin. Seri uç panelini tek bir düzgün hareketle ters çevirin, böylece tohumlu adipositler kesici uçların alt kısmında dır. Eklerin panelini kuyu başına 500 ila 1,000 mikrolitre tam 37 derece santigrat orta içeren 24 kuyu plakasına yerleştirin.
Sonra, plaka kapağı ve dikkatle bir doku kültürü kuluçka içine plaka yerleştirin. Kültürün her yedi gün, her eklemek kesme deliği ile orta değiştirin. Bir haftalık kültürden sonra, deri altı yağ dokusundan izole edilen olgun adiposit agregaları sadece olgun adipositlerde gözlenen karakteristik tekiloküler lipid damlacık morfolojisini korurlar.
PPAR-GAMMA agonistleri pioglitazone ve rosiglitazone ile tedavi PPAR-GAMMA duyarlı genlerde artan bir ekspresyon ile sonuçlanır, glukokortikoid reseptör agonist deksamet azminde tedavi bu genler üzerinde hiçbir etkisi yoktur. Benzer şekilde, glukokortikoid reseptör agonistsağlam glukokortikoid reseptör hedef genlerin gen ekspresyonunu sürücüler, PPAR-GAMMA agonistleri bu genler üzerinde önemli bir etkisi yok iken. Buna ek olarak, PPAR-GAMMA agonistleri ile yedi günlük tedavi sağlam kahverengi yağ özgü gen gen ekspresyonu indükler, UCP1.
Yeni adiposit in vitro modelimiz, glikoz alımı, lipogenez ve lipoliz gibi olgun adipositlerde fonksiyonel çalışmalarda kullanılabilir. Bu yeni adiposit kültür tekniği ile insan olgun beyaz adipositlerin kahverengi benzeri adipositlere dönüşebileceğini gösterdik.
