Bu protokol, ince bağırsağın tüm ana hücre tiplerini temsil eden enteroid türevi tek katmanlı rejenerasyon çalışmaları için kullanılan çok yaygın çizik yara testini genişletir. Bu teknik, bağırsak rejenerasyonunun erken dönem 2D enteroid tek katmanlı modelinde yara kapanmasının gerçek zamanlı olarak görselleştirilmesini sağlar. Tekniğimiz, dönüştürülmüş kolorektal kanser hücre hatları kullanılarak tipik olarak kötü modellenen preterm memeli bağırsağının çalışmasına uygulanabilir.
96 mikrolitre hücre dışı matrisi veya ECM bazlı hidrojel BME'yi, iki ila sekiz santigrat derecede buz üzerinde gece boyunca çözerek başlayın. ECM bazlı hidrojeli ve buz gibi soğuk PBS'yi kalsiyum veya magnezyum olmadan bir ila 50 oranında seyreltin. 24 delikli bir doku kültürü plakasının her bir kuyucuğunu, 200 mikrolitre buz gibi soğuk seyreltilmiş ECM bazlı hidrojel ile kaplayın ve kaplanmış plakayı 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte en az bir saat inkübe edin.
Daha sonra, medyayı tek katmanlara yönelik 3D enteroidleri içeren 24 delikli kültür plakasından aspire edin ve kuyucuk başına 500 mikrolitre hücre ayrışma reaktifi ile değiştirin. ECM bazlı hidrojel kubbeleri, sekiz ila 12 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek ve 12 kuyucuğun içeriğini 15 mililitrelik konik bir tüpe aktararak manuel olarak bozun. Tüm enteroidlerin çıkarıldığından emin olmak için 12 boş kuyuyu 250 mikrolitre hücre ayrışma reaktifi ile yıkayın ve içeriği 15 mililitrelik konik tüplere aktarın.
Konik tüpleri 300g'da dört santigrat derecede beş dakika boyunca santrifüj yapın ve süpernatanı atın. Konik tüplere 10 mililitre buz gibi soğuk DMEM/F-12 yıkama tamponu ekleyin ve tüpleri ters çevirerek enteroid peletleri askıya alın. Dört santigrat derecede beş dakika boyunca 300g'da santrifüj yapın ve süpernatanı çıkarın.
Hücre peletlerini 12 mililitre 37 santigrat derece Tripsin-EDTA'da yeniden askıya alın ve tüpleri 10 dakika boyunca veya hücreler çözünür görünene kadar 37 santigrat derece su banyosuna yerleştirin. Tripsin-EDTA'yı seyreltmek için her tüpe üç mililitre DMEM / F-12 yıkama tamponu ekleyin. Tüpleri ters çevirerek karıştırın ve buzun üzerine yerleştirin.
Ayrışmış enteroidleri 37 mikrometrelik bir ağ hücre süzgecinden süzün. İçeriği temiz 15 mililitrelik konik tüplere toplayın ve tüpleri dört santigrat derecede beş dakika boyunca 300g'da santrifüj edin. Süpernatantı konik tüplerden çıkarın ve hücre peletlerini altı mililitre HOMGY ile yeniden askıya alın.
Daha sonra, ECM bazlı hidrojel kaplı plakayı inkübatörden çıkarın ve kaplanmış yüzeyi çizmeden veya plakayı tamamen kurutmadan fazla ECM bazlı hidrojel çözeltisini aspire edin. ECM bazlı hidrojel ile kaplanmış 24 delikli plakanın her bir kuyucuğuna kombine 12 mililitre HOMGY hücre süspansiyonunun 500 mikrolitresini ekleyin. Kuyucuklar içindeki hücrelerin eşit dağılımını sağlamak için plakayı kapakla döndürün.
Plakayı 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin, tek katmanlar% 90'dan fazla akıcılığa ulaşana kadar her iki günde bir HOMGY ortamını değiştirin. Tek katmanlar% 90'dan fazla akıcılığa ulaştığında, yapışamayan hücreleri çıkarmak için ortamı aspire edin. Hücreleri, 24 saat boyunca HOMGY'de çözünmüş 500 mikrolitre HA35 veya PBS ile tedavi edin.
Bundan sonra, tek katmanın yüzeyini bozmadan ortamı çıkarın. 200 mikrolitrelik pipet ucu kullanarak, tek katmanların kurumasına izin vermemeye dikkat ederek, her bir kuyucuktaki tek katmanın tam yüzey çapı boyunca doğrusal bir çizik yapın. Çizilmiş tek katmanları 500 mikrolitre 1X PBS ile bir kez yıkayın ve HOMGY'de çözünmüş 500 mikrolitre HA35 veya PBS ekleyin.
Plakayı 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit inkübatörü içinde canlı hücre analiz cihazına aktarın. Canlı hücre analiz yazılımındaki Program simgesinin altında, Yeni Gemi Ekleme Sihirbazını Başlat simgesine tıklayın. Programa göre Tara'yı seçin, ardından İleri'ye tıklayın.
Gemi Oluştur altında Yeni'yi seçin ve İleri'ye tıklayın, ardından Tarama Türü altında Tam Kuyu'yu seçin ve İleri'ye tıklayın. Görüntü kanalları için Aşama'yı ve reklam verme amacı için 4x'i seçin. Sağlanan listeden plaka üreticisini ve katalog numarasını seçin ve İleri'yi tıklatın.
Boş bir gemi konumu ve ardından istenen tarama desenini seçin. Ad alanına plaka adını girin, ardından bir plaka düzeni oluşturmak için artı simgesini seçin. Bir tedavi adı oluşturmak için küçük artı'yı seçin.
Kısa adı ve ardından Tamam'ı girin. Bu işleme karşılık gelen plaka kuyularını vurgulayın ve bu işlemle kuyuları belirlemek için büyük artıya vurun. Bileşik konsantrasyonunu girin ve Tamam'ı tıklatın. Plaka tamamlandığında Tamam, İleri'yi seçin. Analizi daha sonraya ertele'yi ve ardından Dört saatlik aralıklarla taramalarla yeni zamanlama oluştur'u seçin.
Taramayı bir günde, sıfır saatte durdurun. Özetin doğru olduğundan emin olun ve ardından zamanlamaya ekleyin. Canlı hücre analizi yazılımında, ekranın üst kısmındaki Görüntüle'yi seçin.
Gemi Adı menüsünden, tamamlanan 24 saatlik taramanıza gidin ve gemi adına çift tıklayın. Soldaki Görüntüleri ve filmleri dışa aktar simgesini ve ardından Görüntülendiği Gibi seçeneğini seçin. İlgilendiğiniz kuyuları vurgulayın ve ardından İlgi çekici zaman noktalarını ve Görüntü Serisini Görüntüleniyor olarak seçin.
Sıra türünün ve taramaların doğru olduğundan emin olun. İstediğiniz hedef klasör konumunu seçin. Açılır menüden JPEG'i ve ardından Dışa Aktar'ı seçin.
ImageJ yazılımını açın ve çizik yara tahlili görüntüsünü yükleyin. Görüntü'yü seçin, sonra görüntüyü 24 bit RGB'den değiştirmek için 8 bit yazın. Yara İyileştirme Boyutu Eklentisini yüklemek için Eklentiler, Makrolar, Yükle Wound_healing_size eklentisini seçin.
Bundan sonra, varyans penceresi yarıçapını 20'ye, eşik değerini 100'e, doymuş piksellerin yüzdesini 0.001'e ayarlayın. Set Scale global için Evet ve ardından Tamam'a tıklayın. Belirtilen alanın yara alanı olduğunu doğrulayın ve ek çizikler için tekrarlayın. Son olarak, ekranda gösterilen denklemi kullanarak 24 saat boyunca göç eden veya çoğalan hücrelerin çizik alanı yara iyileşmesinin yüzdesini hesaplayın.
Burada, T0 sıfır saat zamanındaki alandır ve TC sıfır saat, dört saat, 12 saat veya 24 saatlik alandır. Bu görüntülerde enteroid jenerasyon ve enteroid kaynaklı tek katmanlı yara iyileşmesi testi prosedürü gösterilmiştir. Üç boyutlu, insan olmayan primat bağırsak enteroidlerinin kültürü, iki boyutlu tek katmanlara ayrışmak için kullanılır.
Tek katmanlar, 24 delikli bir plakada% 90'dan fazla birleşime kadar büyütüldü ve daha sonra 24 saat boyunca HA35 veya PBS ile muamele edildi. Tek katmanlar daha sonra bir P200 pipet ucu ile çizildi. Burada, insan dışı primat enteroid monokatmanlarının kontrol tedavilerinde HA35'in temsili görüntüleri gösterilmektedir.
Görüntüler, P200 pipet ucuyla çizik yapıldıktan sonra sıfır saat, dört saat, 12 saat ve 24 saatte elde edildi. HA35'in yara iyileşmesi ve oid monokatmanlar üzerindeki etkisi burada gösterilmiştir. Enteroid tek katmanlı çocuklarda zamanla yara iyileşmesindeki değişim, HA35 tedavi konsantrasyonuna bağlıdır.
HA35, kontrole kıyasla mililitre başına 100 mikrogram ve mililitre başına 200 mikrogramda dört saat ve 12 saat sonra yara iyileşmesini önemli ölçüde arttırdı, ancak iyileşme oranları tedaviler arasında 24 saat yakınsadı. Bu prosedürle hatırlanması gereken en önemli şeylerden biri, bağırsak enteroid monokatmanlarının kısa ömürlü olmasıdır. Bu nedenle,% 90 konakışkan olduklarında, araştırmacılar bunları hızlı bir şekilde kullanmaya çalışmalıdır.
Bu teknik, özellikle enflamatuar yaralanmadan ziyade daha mekanik olarak ilgileniyorsak, in vitro erken bağırsak rejenerasyonu için başvurduğumuz model haline gelmiştir.
