Name: electrophysiological recording from drosophila trichoid sensilla in response to odorants of low volatility
Uploaded: 2017-07-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Electrophysiological Recording from Drosophila Trichoid Sensilla in Response to Odorants of Low Volatility at JoVE.com

Resimlerle ilgili yardım için örnek eserleri ve Tin Ki Tsang&#39;a yardım için Ye Zhang&#39;a teşekkür ediyoruz. Bu çalışma, Ray Thomas Edwards Vakfı Erken Kariyer Ödülü ve JWW&#39;ye verilen C.-YS ve NIH hibelerine (R01DC009597 ve R01DK092640) NIH hibe (R01DC015519) tarafından desteklendi.

1.4 Kayıt için Donanımın Hazırlanması <ol><li> Alüminosilikat cam kapiller (OD 1.0 mm, ID 0.64 mm) ile elektrotlar hazırlamak için bir pipet çekme aletini kullanın. Sineğin sivri içine sokmayı kolaylaştırmak için referans elektrodun ucunu hafifçe bir çift forsepsle hafifçe kıvırın ( ör . Sinek başının önünde, ağız parçalarının üzerinde yuvarlak bir plaka). NOT: Bu çalışmada 7 günlük WT erkekleri (Berlin) kullanıldı. Her iki elektrot için elektrolit olarak AHL tuzlu su çözeltisi 14 kullanın. </li><li> NaCI 6,312 g, KCI 0.373 g, NaHCO 3 0.337 g damıtılmış su 900 mL karıştırılmasıyla AHL 1 L hazırlayın, NaH2? 4, Trehaloz ּ 2H 2 O 1.892 g 0,1120 g, sükroz 3,423 g HEPES 1.192 gr, ve 1 M MgCl2 8.2 ml&#39;si. Damıtılmış su kullanarak toplam hacmi 1 L&#39;ye getirin. 1 N NaOH kullanarak pH&#39;ı 7.4&#39;e getirin ve çözeltiyi bir a ile sterilize edinVakumla çalışan filtre sistemi. Uzun süreli saklama için AHL alikotları 4 ° C&#39;de tutun. NOT: Tutarlı palmitoleik asit salınımı, kartuşlar arasındaki tekdüzeliğe bağlıdır. Her kartuşun tekrarlanabilir bir şekilde monte edilmesi kritik önem taşır. </li><li> Bir tıraş bıçağı kullanarak, 200 ml&#39;lik pipet ucunun ucundan 0,9 cm çıkarıp, ilk kartuş bölümünü oluşturun, 4,1 cm ölçün; Şekil 1A&#39;da ayrıntılı olarak verilen boyutlara bakın. Başka bir 200 mcL pipet ucu kullanın ve 1,8 cm ( Şekil 1A ) ikinci kartuş bölümü oluşturmak için, sırasıyla ucu ve tabandan 1,7 cm ve 1,5 cm kaldırın. Tekrarlanabilir olmasını sağlamak için bir cetvel kullanın. </li><li> Diskleri filtre kağıdından kesmek için ¼ &quot;delik açıcı kullanın. </li><li> İkinci kartuş bölümünün ucuna bir filtre kağıdı diski yerleştirmek için forseps kullanın. Kartuş ucunda hava yoluyla geçebileceği bir açıklık olduğunu görsel olarak teyit edin. </li><li> Şekil 1A&#39;da gösterildiği gibi, birinci ve ikinci kartuş bölümlerini bir arada tutturun. İkinci kartuş bölümünü ön hazırlığa doğru kare oluşturmak için aşağı doğru eğin ( Şekil 1B ). </li><li> Kartuşu bir mikromanipülatör üzerine monte edilmiş koku iletme tüpüyle bağlayın. NOT: Bu tasarım kartuşun değiştirmeyi kolaylaştırmak için dışa doğru döndürülmesini sağlar ( Şekil 1C ). </li><li> Bir kütle kontrolöründe sabit nemlendirilmiş hava akışını 2 L / dk olarak ayarlayın ve odorant akışı başka bir kütle kontrolöründe 500 mL / dakika&#39;a ayarlayın. </li><li> Yazılımı kullanarak ( Malzeme Tablosuna bakın), 500 ms&#39;lik bir koku püskürtmeyi yönetmek için prosedürü programlayın. </li></ol> 2. Teslimat İçin Palmitoleik Asit Odorant Çözümlerinin Hazırlanması NOT: Or47b ORNs hem cis- hem de trans- palmitoleik aside tepki verir. Palmitoleik asit R&#39;de kararsız olduğu içinT, stoklar -20 ° C&#39;de saklanır ve açıldıktan sonra bir ay içinde kullanılır. Etanol, palmitoleik asit için tercih edilen çözücüdür. <ol><li> 1.7 mL mikro tüplerde on kat seri dilüsyonlar için 10 uL cis- veya trans- palmitoleik asit stoğu veya dilüsyonları 90 uL% 100 etanol ile iyice karıştırmak için bir girdap mikseri kullanın. Deneylerden önce günlük taze palmitoleik asit seyreltileri hazırlayın ve bir gün içinde kullanın. NOT: Etanolde çözünmeyen koku maddeleri için, diğer organik çözücülerle koku giderme hazırlamak için cam şişe kullanılması önerilir. </li><li> Bir P10 mikropipet kullanarak, ilgili her kartuştaki filtre kağıdına istenen dilüsyonların 5 μL cis- palmitoleik asit solüsyonları uygulayın. NOT: En yüksek dozaj miktarı (10 -1 ) bileşikten 450 μg içerir. Trans- palmitoleik asit solüsyonları için bunun yerine en yüksek dozajın (10 -1 ) 450 μg t içermesi için 4.5 μL uygulayınO bileşik. </li><li> Çözücüyü tamamen buharlaştırmak için, palmitoleik asit kartuşlarını bir vakum desikatörde oda sıcaklığında 1 saat ve basınç olarak 7.59 mmHg yerleştirin. NOT: Kartuşlar oda sıcaklığında 4 saate kadar kullanılabilir. </li></ol> 3. İn vivo Elektrofizyolojik Kayıtlar için at4 Sensilla&#39;ya Hazır Erişim için Drosophila&#39;nın Hazırlanması NOT: WT sinekleri (Berlin) standart mısır mezesi ortamında 25 ° C&#39;de 12:12 açık karanlık döngüde yetiştirilir. Ekillenme üzerine, sinekler cinsiyete göre onlu gruplara ayrılırlar; böylece gruplar 7 yaşına kadar gruplandırılırlar. Or47b erkek ve dişi sineklerde ORNs, palmitoleik aside tepki verir. Basitlik amacıyla, yalnızca erkek sinekler mevcut çalışmada incelenmektedir. <ol><li> Bir sinek hazırlama slaydı oluşturun: cam slaytta, cam slaytla ~ 3 ° açı oluşturan küçük bir modelleme kilinin üzerine bir cam lamel yerleştirin (18 x 18 mm 2 ). İç tarafa çift taraflı bant yerleştirinDg lamel ve hemen altındaki slayt alanı. Her kayıt günü için yeni bantla değiştirin ( Şekil 2A ). </li><li> Boru içinde ilgi sinek toplamak için bir sinek aspiratör 15 kullanın ve daha sonra boru sonuna 200 mcL pipet uç takın. Aynı anda pipet ucunun sonuna kadar sinek itmek için tüp içine hava üfleme sırasında tüp ileri hareket. Sinek gövdesinin hemen altında ve sinek üzerinde 2 baş uzunluğunda kesmek için traş bıçağı kullanın. </li><li> Pipet ucunun altını modelleme kili ile sıkıştırın, hem havadaki hem de antenler açık kalana kadar yukarı doğru itin ( Şekil 2B ). Sinek öldürmekten kaçınmak için, sineklerin karnının ezilmesine engel olduğu için, antenleri ve aristeleri ortaya çıkarmak için yalnızca yeterli kil ilave edin. Ayrıca, ani bir daralmayı önlemek için kil yavaş yavaş ve nazikçe ekleyin. Sinekin canlı olup olmadığını antennal&#39;ı kontrol ederek doğrulayın.Veya hortum hareketi. </li><li> Sineği barındıran pipet ucunu manevra yapmak için forseps kullanın. Kafanın gözlemcinin sağında olacağı şekilde başın yönünü ayarlayın. Antenin yan tarafı bantlanmış örtücü yüzeye ( Şekil 2B ) dayanıncaya kadar ince forseps kullanarak lamel boyunca hazırlıkları yapın. </li><li> Hareketi önlemek için antenin çift taraflı banda sabitlenmesi için tutucu çubuğu arista üzerine yerleştirin ( Şekil 2B ). NOT: Tutucu çubuk borosilikat cam kapilerden bir pipet çekici ile çekilir ve modelleme kili ile konumunda tutulur ( Şekil 2A ). </li><li> Hazneyi teçhizatın sahnesine yerleştirin ( Şekil 2C ). Mikroskopu kullanarak, trikoidlerin antenin üçüncü bölümünün distal-yanal kenarı boyunca görünür olduğunu teyit edin. NOT: İdeal olarak, sensilla, arka plana karşı açıkça siluetlenmelidir;<html> Kayıt etmeyi kolaylaştırır ( Şekil 3 ). Bu hazırlıkta erişilebilir trichoid sensürün çoğunluğu at4 tipindedir. </li><li> Hazırlık 2 , 15&#39;te tarif edildiği gibi, hazneden yaklaşık 2 cm uzaktaki ayrı bir hava besleme tüpü aracılığıyla verilen nemlendirilmiş hava akışının (2 L / dak.) Hazırlanmasını sağlayın ( Şekil 4 ). </li></ol> 4. Palmitoleik Asit&#39;e Yanıt Vermek İçin AT4 Trikoidlerde Or47b ORN&#39;lerinden At4 Sensillum Aktivitesinin Kaydedilmesi <ol><li> Referans elektrodu cıvataya sokun ( Şekil 3A ). Doku hasarını önlemek için, elektrotun, kütikül altındaki hemolimfe temas edebileceği yüzeyin hemen altına, hızlı ve düzgün bir hareketle yerleştirildiğinden emin olun. </li><li> Kayıt elektrodunu, hedef sensillum ile aynı görüş alanına girene kadar yavaş yavaş indirin (= &quot;Xfig&quot;&gt; Şekil 3B). 50X objektif lens altında kaydedin. NOT: Sert trikoidal kütikül, kayıt elektrodunun, daha geniş olan alanı, elektrotun dışarıya sapma ihtimalini azaltan daha büyük bir hedef sağlayan sensil tabana yerleştirilmesini gerektirir ( Şekil 3B , yerleştirme). </li><li> Bir duyarlığa koku uyarılarını uygulamadan önce, aşağıdaki seçim kriterlerine uyun; Bu standartları karşılamayan herhangi bir trikoid reddedilmeli ve bunun yerine bir başka sensillum seçilmelidir. <ol><li> Yüksek bir sinyal-gürültü oranına dikkat edin (bir örnek için Şekil 3C&#39;ye bakın). </li><li> At4A ve at4C nöronlarından belirlenebilir sivri gözlemleyin ( Şekil 3C ). Not: at4B başak genliği at4A 10&#39;a çok benzemektedir ve koku uyarımı olmadan kolayca tanımlanamaz. </li><li> At4A nöronlarının bazal ateşleme hızının20 Hz civarında veya altında. NOT: nöron için bazal ateşleme hızı basiconic ORNs 2 daha yüksek olduğu için bu kriter at4A özeldir. Çok daha yüksek bazal bir ateşlenme, elektrot yerleştirilmesi sırasında nöronların hasar görmüş olabileceğini gösterir. </li></ol></li><li> Kartuşu koku giderme borusuna bağlayın. Solvent kontrolü ile başlayın ve daha sonra düşük konsantrasyonlardan yüksek konsantrasyona kadar olan lokantaları kullanın. Kartuşu hazneye doğru manevra yapmak için mikromanipülatörü kullanın ve kartuşu hazırlığın başında kare şeklinde tutun. Kartuşun doğrudan birkaç milimetreden itibaren antene ( Şekil 4 ) işaret ettiğini görsel olarak teyit edin. NOT: Amaç, kartuşun açılmasını direkt olarak antende yönlendirmek ve hedef dokuya çok yakın konumlandırmaktır. </li><li> Odorant kartuşunun kayıt elektrodundan sağa 1 - 2 mm ve sinek önünden ayrıldığından emin olunP aşağıya yaklaşık 1 mm kaydırın. NOT: Burada açıklanan kurulumda, odorant kartuşu kayıt elektrodu, referans elektrotu ve slayt hazırlama slaydı ile yakından sınırlanmıştır ( Şekil 4 ). NOT: Kartuş ile kayıt / referans elektrotları arasındaki mesafeye dikkat edin. Yaklaşık 4 mm&#39;lik bir mesafe önerilir 1 . Kasıtsız temas, sinyali sonlandırabilir ve kayıt elektrotunun ucunu kırabilir, mevcut nörona zarar verebilir ve sonraki kayıtları zorlaştırabilir. NOT: Kartuşu ve hazır önlü slayt arasındaki mesafeyi göz önünde bulundurun. Lamelliğe dokunulduğunda, kaydı kesmek için kayıt elektrodunu yerinden oynatabilir. </li><li> Kaydı başlatmak için veri toplama yazılımındaki &quot;Kaydet&quot; düğmesine basın. NOT: Her 10 saniyelik kayıt için, 1.9. Adımda anlatıldığı gibi tek bir 500 ms koku kaynağı doğrudan antene gönderilir. </li><li> Odorant uygulamasından sonra,Kartuşu bir sonraki en yüksek yoğunluğa sahip bir kartuşla değiştirmeden önce dikkatlice geri çekin. Tüm dozaj aralığı elde edilinceye kadar devam edin. NOT: Uyumun muhtemel etkilerinden kaçınmak için, her sineğin tek bir Or47b ORN kaydettirilmesi önerilir. </li><li> Gün kayıt işlemini tamamladıktan sonra kayıt elektrodunu damıtılmış su ile iyice yıkayın. </li><li> Piyasada bulunan çevrimdışı analiz yazılımını kullanarak verileri analiz edin ve çizin. </li></ol>

<ol>
	<li>Lin, H. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormonal+modulation+of+pheromone+detection+enhances+male+courtship+success.">Hormonal modulation of pheromone detection enhances male courtship success.</a> Neuron. 90 (6), 1272-1285 (2016).</li><li>Hallem, E. A., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coding+of+odors+by+a+receptor+repertoire.">Coding of odors by a receptor repertoire.</a> Cell. 125 (1), 143-160 (2006).</li><li>Silbering, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+function+and+integrated+wiring+of+the+evolutionarily+distinct+Drosophila+olfactory+subsystems.">Complementary function and integrated wiring of the evolutionarily distinct Drosophila olfactory subsystems.</a> J Neurosci. 31 (38), 13357-13375 (2011).</li><li>Min, S., Ai, M., Shin, S. A., Suh, G. S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dedicated+olfactory+neurons+mediating+attraction+behavior+to+ammonia+and+amines+in+Drosophila.">Dedicated olfactory neurons mediating attraction behavior to ammonia and amines in Drosophila.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 110, 1321-1329 (2013).</li><li>Kurtovic, A., Widmer, A., Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+class+of+olfactory+neurons+mediates+behavioural+responses+to+a+Drosophila+sex+pheromone.">A single class of olfactory neurons mediates behavioural responses to a Drosophila sex pheromone.</a> Nature. 446 (7135), 542-546 (2007).</li><li>Van der Goes van Naters, W., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptors+and+neurons+for+fly+odors+in+Drosophila.">Receptors and neurons for fly odors in Drosophila.</a> Curr Biol. 17, 606-612 (2007).</li><li>Schlief, M. L., Wilson, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+processing+and+behavior+downstream+from+highly+selective+receptor+neurons.">Olfactory processing and behavior downstream from highly selective receptor neurons.</a> Nat Neurosci. 10 (5), 623-630 (2007).</li><li>Laughlin, J. D., Ha, T. S., Jones, D. N. M., Smith, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+Pheromone-sensitive+neurons+is+mediated+by+conformational+activation+of+pheromone-binding+protein.">Activation of Pheromone-sensitive neurons is mediated by conformational activation of pheromone-binding protein.</a> Cell. 133 (7), 1255-1265 (2008).</li><li>Gomez-Diaz, C., Reina, J. H., Cambillau, C., Benton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligands+for+pheromone-sensing+neurons+are+not+conformationally+activated+odorant+binding+proteins.">Ligands for pheromone-sensing neurons are not conformationally activated odorant binding proteins.</a> PLoS Biol. 11 (4), e1001546 (2013).</li><li>Dweck, H. K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pheromones+mediating+copulation+and+attraction+in+Drosophila.">Pheromones mediating copulation and attraction in Drosophila.</a> Proc Nat Acad USA. 112, 2829-2835 (2015).</li><li>Cappa, C. D., Lovejoy, E. R., Ravishankara, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaporation+rates+and+vapor+pressures+of+the+even-numbered+C8-C18monocarboxylic+acids.">Evaporation rates and vapor pressures of the even-numbered C8-C18monocarboxylic acids.</a> J Phys Chem A. 112 (17), 3959-3964 (2008).</li><li>Kimura, K. -. I., Sato, C., Yamamoto, K., Yamamoto, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+the+back+or+front:+the+courtship+position+is+a+matter+of+smell+and+sight+in+Drosophila+melanogaster+males.">From the back or front: the courtship position is a matter of smell and sight in Drosophila melanogaster males.</a> J Neurogenet. 29 (1), 18-22 (2015).</li><li>Grosjean, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+olfactory+receptor+for+food-derived+odours+promotes+male+courtship+in+Drosophila.">An olfactory receptor for food-derived odours promotes male courtship in Drosophila.</a> Nature. 478 (7368), 236-240 (2011).</li><li>Wang, J. W., Wong, A. M., Flores, J., Vosshall, L. B., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+calcium+imaging+reveals+an+odor-evoked+map+of+activity+in+the+fly+brain.">Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain.</a> Cell. 112 (2), 271-282 (2003).</li><li>Pellegrino, M., Nakagawa, T., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+sensillum+recordings+in+the+insects+Drosophila+melanogaster+and+Anopheles+gambiae.">Single sensillum recordings in the insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae.</a> J Vis Exp. (36), e1-e5 (2010).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Burada Or47b ORN&#39;lerin palmitoleik aside verdiği yanıtların sağlam bir şekilde indükte edilebildiği ve kaydedilebildiği bir prosedürü açıkladık. Yetersiz feromon odorant verme sorununu gidermek için 2 , 7 , 10 numaralı geleneksel uzun mesafe koku alma yöntemini değiştirdik. Bileşimi, açılışları hazırlığın milimetre içinde konumlandırılmış olan odorant kartuşları vasıtasıyla dağıtarak düşük odorant volatilite sorununu ele aldık. Her bir odorant kartuşunun tutarlı yapımı ve yerleştirilmesi göz önüne alındığında, bu protokol kendiliğinden erişilemeyen odorantları tekrarlanabilir bir şekilde sunmanın etkili bir yöntemi olarak kendini gösterir. Burada açıklanan yakın menzilli koku sunma prosedürü, mevcut koku verme yöntemlerine göre önemlidir. Tarama dahil olmak üzere gelecekteki çeşitli uygulamalara izin verir.ow uçuculukta trichoid Sensilla 1 &#39;de yer sadece ORNs tepkiler için koku, ancak herhangi bir Sensillum türü bulunanlar. Prosedür, odorantları taşıyan bir cam kılcalı fiziksel olarak anten 6&#39;ya doğru hareket ettirmek yerine feromon oda sıcaklığının etkili bir şekilde havaya gönderilmesine izin verir. Modifikasyonumuz, sadece koku nabızını verdikten sonra palmitoleik asidin tetiklediği tepkileri gözlemlediğimiz deney sonuçları tarafından desteklendiği üzere, odorant içeren cam kılcalla doğrudan dokuya dokunma olasılığını en aza indirir. Buna ek olarak, yöntemimiz hızlı koku başlangıcı ve ofsetinin mükemmel zamansal kontrolü sağlar. İşlemin gösterilen potansiyeline rağmen sınırlamaları içermediği de belirtilmelidir. Prosedürümüzde, kartuşun konumlandırılması tamamen el ile yapılan ayarlara bağlıdır, bu kartuşu teknik olarak kartuşunDeneme duruşmaya kadar aynı yerde sally. Ek olarak, başarıyla yürütülmesini sağlamak için protokolün kritik adımlarına özel dikkat gösterilmelidir. Bazen belirli bir koku yoğunluğuna karşı oldukça değişken tepkiler elde edilir. Çoğu durumda, neden tutarsız kartuş yerleşimi izlenir. Buna ek olarak, kaydetmeden önce at4 sensilla için sıkı seçim kriterlerine uyulmalıdır. Yüksek sinyal-gürültü oranlarına sahip ( Şekil 3C ) düzgün at4A başak büyüklükleri, temel bir kriter iken mütevazi bir bazal ateşleme oranı nöronal hasarın yokluğunu gösterir. Bu prosedürün teknik zorluk derecesi, kuralı olan bir erkek ile hedef kadın arasındaki gözlemlenen yakını taklit eden aralıklardan feromon odorantlar verme kabiliyeti ile dengelenmiştir. Özetle, odorant sunum yöntemimiz Or47b ORN&#39;lerden SSR&#39;de kullanılmak üzere palmitoleik aside erişmenizi sağlar. Bununla birlikte,Bu teknik tek bir feromon ile sınırlı değildir, fakat daha önce erişilemeyen odorantları test ederken onu çok yönlü bir analitik teknik haline getiren diğer düşük volatiliteli odorantlara kolayca adapte edilebilir.

<html> Drosophila ORNs, geniş çapta karbon zinciri uzunlukları ve esterler, alkoller, ketonlar, laktonlar, aldehitler, terpenler, organik asitler, aminler, kükürt bileşikleri, heterosiklikler ve aromatikler dahil olmak üzere çeşitli işlevsel gruplarla çok sayıda kokuya tepki verirler 2 , 3 . Fizikokimyasal özelliklerinde çeşitlilik gösteren koku maddeleri, bileşiğin buhar basıncı ile belirtilen belirgin derecede farklı uçuculuklara sahip olabilirler. Özellikle, Drosophila melanogaster için biyolojik açıdan önemli olan odorantlar, uçuculuklarında muazzam farklılıklar göstermektedir. Örneğin, Ir92a ORNs 20 ° C&#39;de 6.432 mmHg buhar basıncı ile yüksek oranda uçucu olan amonyak 4&#39;e tepki verir. Buna karşılık Or67d ORN&#39;leri 20 ° C&#39;de 43 mmHg buhar basıncı olan bir erkek feromon cis- vekseten asetat ( c VA) 5 , 6&#39;ya cevap verir. Düşük uçuculuktaki odorantlara karşı olfactory yanıtını incelemek, odorantların bir taşıyıcı hava akımı yoluyla nispeten uzun bir mesafe boyunca ( yani, birkaç santimetre) iletildiği klasik koku iletme yöntemleri ile özellikle zordur.Böylece, bildirilen koku yanıtları Koku giderme sisteminin tasarımına bağlı olarak, büyük oranda değişiklik gösterebilir Örneğin Or67d ORN&#39;lerin yüksek bir c VA dozuna karşılık gelen yanıt, ~ 40 7 -&gt; 200 çarpı / s 6 aralığındadır Ayrıca c VA&#39;nın konvansiyonel verme yöntemleri ile etkisiz hale getirilmesi büyük olasılıkla sahte negatif sonuçlara neden olmakta ve bu da c VA&#39;nın Or67d ORN&#39;leri 8 harekete geçirmek için yeterli olmadığını yorumlamasına yol açmaktadır. Yakın menzilli koku iletme yöntemi 9. Bu nedenle imperaDüşük uçuculukta koku veren maddelerin etkin bir şekilde sunumu için sağlam bir koku iletim sistemi geliştirmek. Son zamanlarda, Or47b ORN&#39;ler için ligandlar olarak birkaç uzun zincirli kekiküler yağ asitleri tespit ettik. Tip 4 Antenn Trichoid Sensillum&#39;da (at4) yer alırlar. Uzun zincirli yağlı asit koku arasında, Or47b ORNs 1 etkinleştirerek erkek kur teşvik afrodizyak feromon olarak bu palmitoleik asit fonksiyonları bulundu. Bununla birlikte, geleneksel koku iletim yöntemini kullanan başka bir çalışmada, metil lauratın Or47b ORN&#39;lerinden yanıtlar çıkardığı gösterilirken, palmitoleik asit, aynı mesafeden 10 sunulduğunda tepki vermedi. VA C ile kıyaslandığında, uzun zincirli yağ asitleri, 25 ° C&#39;de 11 dan daha az 0,001 mm Hg buhar basınçları ile, daha az uçucu olan. Uzun zincirli yağlı asit odorantlarının doğal olarak düşük uçuculuğu, antene etkili sunumun önünü engeller;Geleneksel koku giderme sistemleri, muhtemelen sahte negatif sonuçlardan sorumluydu 10 . Bu tutarsızlık, düşük uçuculukta olan odorantları sunarken geleneksel koku iletim sistemlerinin yetersizliğini vurgular. Daha önce sinek cuticular kokuların etkili teslim koku kaynağı ve hedef dokuya 6 arasındaki yakınlığı gerektirdiğini gösterilmiştir. Bu nedenle, 12 , 13 doğadaki meyve sinekleri tarafından muhtemelen karşılaşılan mesafeyi taklit ederek biyolojik olarak aktif feromonların etkilerini tam olarak karakterize etmek için prosedürümüzde minimum mesafeye öncelik verilmesi gerektiği konusunda anlaşmıştık. Metodumuz, standart elektrofizyoloji teçhizatları ve teknikleriyle uyumluluk da dahil olmak üzere diğer avantajları barındırır. Mevcut teçhizat kurulumları, bu protokolü barındırabilmek için minimal modifikasyon gerektirir ve çoğu SSR basamağı küçük ayarlamalar gerektirir. BuTekniğini SSR&#39;de deneyimli araştırmacılar tarafından kolayca erişilebilir kılmaktadır. Ayrıca, tekniğimiz, uyaran iletimini nöronal yanıt ile ilişkilendirerek keskin başlangıçlı ve ofsetli düşük volatiliteli odorantların sunumuna izin verir. Sonunda, donanım yerleşimi, odorant kartuşları arasında hızlı alışveriş yapılmasını kolaylaştırarak, istenen bir doz aralığında veri toplamanın hızlandırılmasını sağlar. Başvuru ve kayıt elektrotlarının, Yetişkin Hemolimf-Benzeri (AHL) çözeltinin, koku iletici kartuşların ve ilgili olfaktometre hazırlığının incelenmesi ile başlayacağız. Ardından, palmitoleik asit odorant solüsyonlarının hazırlanmasını ve ardından kayıt için sineğin hazırlanmasını tartışırız. Bu yöntemi kullanarak elde edilen temsili verileri sunmadan önce, odorant kartuşunun konumunu daha yakından kaydetmek ve daha yakından incelemek için trichoid sensillum seçme kriterlerini dikkate almaya devam ediyoruz. Son olarak, bu tekniğin faydalı uygulamaları keşfederek sonuçlandırıyoruzUe, bazı karşılaşılan sorunlar ve çözümleri.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Prep Setup &amp;amp; Miscellaneous Materials&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette Puller Instrument&amp;nbsp;</td><td>Sutter Instruments&lt;br/&gt; Novato CA USA</td><td>P97</td><td>Pipette Puller</td></tr><tr><td>Borosilicate Glass Capillaries</td><td>World Precision Instruments&lt;br/&gt; Sarasota FL USA</td><td>1B100F-4</td><td>to make holding rods</td></tr><tr><td>Aluminosilicate Glass Capillaries&amp;nbsp;</td><td>Sutter Instruments&lt;br/&gt; Novato CA USA</td><td>AF100-64-10</td><td>to make electrodes</td></tr><tr><td>Superfrost Microscope Slides</td><td>Fisher Scientific&lt;br/&gt; Pittsburgh PA USA</td><td>12-550-143</td><td>for fly-prep station</td></tr><tr><td>Permanent Double Sided Tape</td><td>Scotch&lt;br/&gt; St. Paul MN USA</td><td>NA</td><td>for fly-prep station</td></tr><tr><td>Upright microscope</td><td>Olympus&lt;br/&gt; Shinjuku Tokyo Japan</td><td>BX51</td><td>for recording rig</td></tr><tr><td>Plastalina modeling clay</td><td>Van Aken&lt;br/&gt; North Charleston SC USA</td><td>B0019QZMQQ</td><td>for prep station and to stablize the holding rod</td></tr><tr><td>Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Unit with SFCA Membrane, 0.45 mm</td><td>Nalgene&lt;br/&gt; Rochester NY USA</td><td>#156-4045</td><td>to sterilize AHL solution</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Cartridge Materials&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;micro;L pipette tip&amp;nbsp;</td><td>VWR&lt;br/&gt; Radnor PA USA</td><td>53508-810</td><td>to make odor cartridges and fly prep</td></tr><tr><td>Filter Paper</td><td>Whatman&lt;br/&gt; Maidstone Kent UK</td><td>740-E</td><td>to make odor cartridges&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Vacuum Desiccator&amp;nbsp;</td><td>Cole-Parmer&lt;br/&gt; Vernon Hills IL USA</td><td>VX-06514-30</td><td>to vaporize ethanol solvent</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Odorant Materials&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cis-palmitoleic acid</td><td>Cayman Chemical&lt;br/&gt; Ann Arbor MI USA</td><td>#10009871 (CAS # 373-49-9)</td><td>Or47b odorant</td></tr><tr><td>trans-palmitoleic acid</td><td>Cayman Chemical&lt;br/&gt; Ann Arbor MI USA</td><td>#9001798 (CAS # 10030-73-6)</td><td>Or47b odorant</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Spectrum Chemical MFG.&amp;nbsp;&lt;br/&gt; New Brunswick NJ USA</td><td>E1028-500MLGL</td><td>to dilute palmitoleic acid&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Rig Setup Materials&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Odorant Cartridge Micromanipulator</td><td>Siskiyou&lt;br/&gt; Grants Pass OR USA</td><td>MX130R</td><td>to position the olfactometer</td></tr><tr><td>Flow Vision software&amp;nbsp;</td><td>Alicat&lt;br/&gt; Tuscon AZ USA</td><td>FLOWVISIONSC</td><td>software to control flow rate</td></tr><tr><td>Mass Controller</td><td>Alicat&lt;br/&gt; Tuscon AZ USA</td><td>MC-2SLPM-D</td><td>to control the flow rate for humidified air</td></tr><tr><td>Mass Controller</td><td>Alicat&lt;br/&gt; Tuscon AZ USA</td><td>MC-500SCCM-D</td><td>to control the flow rate for odor stimulation</td></tr><tr><td>Clampex</td><td>Molecular Devices&lt;br/&gt; Sunnyvale CA USA</td><td>Ver. 10.4</td><td>Data acquisition software</td></tr><tr><td>Air delivery tube</td><td>Ace Glass&lt;br/&gt; Vineland NJ USA</td><td>8802-936&amp;nbsp;</td><td>to deliver humidified air</td></tr><tr><td>50X objective lens&amp;nbsp;</td><td>Olympus&lt;br/&gt; Shinjuku Tokyo Japan</td><td>LMPLFL50X</td><td>recording rig</td></tr><tr><td>Clampfit 10</td><td>Molecular Devices&lt;br/&gt; Sunnyvale CA USA</td><td>Ver. 10.4</td><td>software for spike analysis&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Igor Pro 6</td><td>WaveMetrics&lt;br/&gt; Lake Oswego OR USA</td><td>Ver. 6.37</td><td>software for data analysis&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Audio Monitor</td><td>ALA Scientific Instruments&lt;br/&gt; Farmingdale NY USA</td><td>NPIEXB-AUDIS-08B</td><td>Aurally reports individual spikes</td></tr><tr><td>Extracellular Amplifier</td><td>ALA Scientific Instruments&lt;br/&gt; Farmingdale NY USA</td><td>NPIEXT-02F</td><td>to increase the amplitude of electrical signals</td></tr><tr><td>Valve Controller</td><td>Warner Instruments&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>VC-8</td><td>to control the opening of the valve for odor stimulation</td></tr><tr><td>Recording Electrode Micromanipulator</td><td>Sutter Instruments&lt;br/&gt; Novato CA USA</td><td>MP-285</td><td>to position recording electrode</td></tr><tr><td>Headstage Amplifier</td><td>ALA Scientific Instruments&lt;br/&gt; Farmingdale NY USA</td><td>EQ-16.0008</td><td>to increase the amplitude of electrical signals</td></tr><tr><td>Oscilloscope</td><td>Tektronix&lt;br/&gt; Beaverton OR USA</td><td>TDS2000C</td><td>Visual report of individual spikes</td></tr></tbody></table>

electrophysiological recording from drosophila trichoid sensilla in response to odorants of low volatility

Böcekler, yiyecek arayışı, yırtıcılardan kaçınma, yumurta akı sağlığı ve çiftleşme gibi hayatta kalmaları için kritik olan geniş bir davranış yelpazesini yönlendirmek için koku duygularına güvenirler. Değişen uçuculuktaki sayısız kimyasal, böcek Koku Alıcısı Nöronlarını (ORNs) aktive eden doğal odorantlar olarak tanımlandı. Bununla birlikte, düşük uçuculuktan etkilenen odorantlara karşı olfaktör tepkiler üzerinde çalışmak, bu tür uyarıcı maddeleri geleneksel koku giderme yöntemlerini kullanarak etkin bir şekilde sunamamasından dolayı engellenmiştir. Burada, in - vivo Tek-Sensillum Kayıt (SSR) için düşük uçuculukta olan odorantların etkili bir şekilde sunumuna izin veren bir prosedürü açıklıyoruz. Koku kaynağı ile hedef doku arasındaki mesafeyi en aza indirerek, bu yöntem, palmitoleik asit, kur ve çiftleşme davranışı 1 &#39;de yer ORNs üzerinde gösterilen etkisi olan bir uyarıcı feromon içeren biyolojik olarak çıkıntı ama şimdiye kadar ulaşılamayan koku, uygulama için izin verir.Prosedürümüz böcek kokusu ve feromon iletişimi için düşük volatiliteli bir odorantı test etmek için yeni bir yol sağlar.

Tekniği, palmitoleik asidin cis ( Şekil 5B ) izomerlerine karşı trans ( Şekil 5A ) nispi etkinliğini belirlemek için başarılı bir şekilde uygulanmıştır. Temsilcili verilerimiz, trans- palmitoleik asidin, cis izoformuyla karşılaştırıldığında Or47b ORN&#39;ler için daha etkili bir ligandı olduğunu göstermektedir ( Şekil 5C ). Her sinekten, toplam 24 sinek için, dozaj eğrisi başına kaydedilen on iki sinek bulunan tek bir nöron kaydedildi. Kolektif veriler her birinde 8 sinek kaydedilmiş ve deneylerin üç bağımsız tekrarından elde edilmiştir. Hata çubukları sem&#39;i temsil eder Dikkat çekin, koku kartuşunun açıklığı ile sinek başı arasındaki mesafe kayıt sonucunda önemli bir etkiye sahiptir. P&#39;ye önemli bir cevap getirmek içinOr47b ORN&#39;lerde almitoleik asit, biz anten 1&#39;den yaklaşık 4 mm uzaklıktaki yakındaki yeşeyi takdim ettik ( Şekil 6A ). Palmitoleik asit antenden (~ 11 mm) uzakta sunulduğunda, aynı Or47b ORN&#39;lerinden anlamlı herhangi bir yanıt izleyemedik ( Şekil 6B ). Bu sonuçlar, palmitoleik asidin yakın menzil sunumunun önemini vurgulamaktadır ( Şekil 6C- D ). Veriler, 6 erkek sinekten (Berlin, 7 yaşında) paralel deneylerden toplanmıştır. Tek bir Or47b ORN kaydedildi / sineklendi. Hata çubukları sem&#39;i temsil eder <img alt="Şekil 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56147/56147fig1.jpg" /> Şekil 1: Kartuş ve Olfaktometre Ayarı. ( A ) Koku kartuşlarının hazırlanması. Soldan sağa: standart 200 μLPipet ucu, birinci ve ikinci kartuş bölümleri ve tamamlanmış bir odorant kartuşu. ( B ) Kartuş, ikinci bölümün aşağı doğru eğim açısını gösteren, olfaktometreye bağlandı. ( C ) Mikromanipülatör üzerine monte edilmiş koku iletme tüpünü gösteren, koku veren bir kartuş bulunan olfaktometre ayarı. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56147/56147fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56147/56147fig2.jpg" /> Şekil 2: Drosophila Hazırlama. ( A ) Sinek, lamel ve tutma çubuğunun göreli konumlarını gösteren eksiksiz bir hazırlık. ( B ) Hazırlamanın yakın plan görüntüsü, sinek, anten orientasyonu ve sivri uçlarının konumunu gösterir. Tutucu çubuk arista üzerine yerleştirilir,Üçüncü anten segmentinin çift taraflı banda sabitlenmesi. ( C ) Rig kurulumu. Tüm önemli bileşenlere açıklama yapılır. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56147/56147fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56147/56147fig3.jpg" /> Şekil 3: SSR için at4 Sensillum&#39;un Tanımlanması. ( A ) hazırlamanın 4X görüntüsü, referans elektronun klipee yerleştirildiğini, tutma çubuğunun arista üstte olduğunu ve kayıt elektrodunun üçüncü anten bölümünün yakınına yerleştirildiğini gösterin. ( B ) at4 trikoid içine sokulmaya hazır elektrodun 50X görüntüsü. Başlangıç: Kayıt elektrodunun konumunun gösterimi. ( C ) Temsilci SSR temel sivri aktivite izleri, iyi (üst) veya zayıf (alt) sinyal-to-nois olduğunu gösterirE oranı. İyi bir sinyal-gürültü oranı, at4A ve at4C sivri uçlarının güvenilir tanımlanmasına izin verir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56147/56147fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56147/56147fig4.jpg" /> Şekil 4: Kartuş Yerleştirme. ( A ) Odorant kartuşu birkaç mm&#39;lik bir mesafeden sivri başlı kare şeklinde hedeflenmektedir. ( B ) Farklı açıdan hazırlık ve olfaktometre hakkında bir başka görüş. ( C ) Hazırlık ve olfaktometre yakınlaştırma görüntüsü, yanıcı preparatın hazırlık öncesi slayt üzerindeki konumunu gösterir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56147/56147fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> Şekil 5: Or47b ORN&#39;lerin, cis - veya trans- palmitoleik Asite tepki olarak Temsilci İzleri ve Dozaj Eğrileri. Or47b reseptörünü trans- ( A ) veya cis- palmitoleik asit ( B ) ile ifade eden at4A ORN&#39;lerden ( AB ) SSR. Kayıtlar, 7 günlük WT Berlinli erkeklerle yapıldı. Karşılık gelen başak rasterleri (ortada) ve bir peri uyarı zamanı histogramı (alt, 50 ms&#39;de binned) örnek izlerin altında (n = 12) gösterilmektedir. ( C ) Or47b ORN başak yanıtlarını cis - veya trans -palmitoleik aside kıyasla doz-yanıt eğrileri. Ortalama ± sem (* p &lt;0.05; ** p &lt;0.01; t- testi). Ctrl: Palmitoleik asit içermeyen negatif kontrol. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56147/56147fig5large.jpg" target="_blank">Lütfen buraya tıklayınız</a>Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için. <img alt="Şekil 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56147/56147fig6.jpg" /> Şekil 6: At4A&#39;nın palmitoleik asit ile aktivasyonu, yakın menzil stimülasyonunu gerektirir. ( AB ) 7 gün yaşlı vahşi tip Berlin erkek at4A ORN&#39;lerinden SSR. Cis- palmitoleik asit yakın bir aralıkta (~ 4 mm) veya daha uzakta (~ 11 mm) (n = 6) verildi. ( C ) Karşılık gelen tepe tepkilerinin karşılaştırılması (50 ms&#39;de binned, yumuşatılmış peri uyarı zamanı histogramları). ( D ) Karşılık gelen ortalama spike tepkilerinin karşılaştırılması. At4A&#39;nın palmitoleik asit yanıtları, uyaran mesafesi arttıkça belirgin şekilde düşer. Referans 1&#39;de Şekil S4&#39;ün izniyle basılacaktır. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56147/56147fig6large.jpg" target="_blank">Görüntülemek için lütfen tıklayınız.</a>Bu rakamın daha büyük versiyonu.

Watch this Scientific Journal Video about Electrophysiological Recording from Drosophila Trichoid Sensilla in Response to Odorants of Low Volatility at JoVE.com

Electrophysiological Recording from Drosophila Trichoid Sensilla in Response to Odorants of Low Volatility

Bu protokolün genel amacı, uzun zincirli kütiküler feromonlara tepki gösteren Drosophila olfaktör reseptör nöronlarından tek duyarlılık kaydı için düşük uçuculukta odorantları nasıl göstereceğini göstermektir.

Elektrofizyolojik Kayıt<em&gt; Drosophila</em&gt; Düşük Volatilite Kokularına Karşı Trikoid Sensilla

Insects rely on their sense of smell to guide a wide range of behaviors that are critical for their survival, such as food-seeking, predator avoidance, ...

electrophysiological-recording-from-drosophila-trichoid-sensilla

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Electrophysiological Recording from Drosophila Trichoid Sensilla in Response to Odorants of Low Volatility

8.8K Görüntüleme.  University of California San Diego.  Bu protokolün genel amacı, uzun zincirli kütiküler feromonlara tepki gösteren Drosophila olfaktör reseptör nöronlarından tek duyarlılık kaydı için düşük uçuculukta odorantları nasıl göstereceğini göstermektir. 

Video: Electrophysiological Recording from Drosophila Trichoid Sensilla in Response to Odorants of Low Volatility

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed in sensory hairs called sensilla, which cover the surface of olfactory organs. The surface of each sensillum is covered with tiny pores, through which odorants pass and dissolve in a fluid called sensillum lymph, which bathes the sensory dendrites of the OSNs housed in a given sensillum. The OSN dendrites express odorant receptor (OR) proteins, which in insects function as odor-gated ion channels4, 5. The interaction of odorants with ORs either increases or decreases the basal firing rate of the OSN. This neuronal activity in the form of action potentials embodies the first representation of the quality, intensity, and temporal characteristics of the odorant6, 7.
Given the easy access to these sensory hairs, it is possible to perform extracellular recordings from single OSNs by introducing a recording electrode into the sensillum lymph, while the reference electrode is placed in the lymph of the eye or body of the insect. In Drosophila, sensilla house between one and four OSNs, but each OSN typically displays a characteristic spike amplitude. Spike sorting techniques make it possible to assign spiking responses to individual OSNs. This single sensillum recording (SSR) technique monitors the difference in potential between the sensillum lymph and the reference electrode as electrical spikes that are generated by the receptor activity on OSNs1, 2, 8. Changes in the number of spikes in response to the odorant represent the cellular basis of odor coding in insects. Here, we describe the preparation method currently used in our lab to perform SSR on Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae, and show representative traces induced by the odorants in a sensillum-specific manner.

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Electrophysiological responses of olfactory sensory neurons to odorants can be measured in insects using single sensillum recordings. In this video article we will demonstrate how to perform single sensillum recordings in the antennae of the vinegar fly (Drosophila melanogaster) and the maxillary palps of the malaria mosquito (Anopheles gambiae).

Böcekler Tek Sensillum Kayıtlar Drosophila melanogaster Ve Anofel gambiae</em

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed ...

Nörobilim

High-resolution Measurement of Odor-Driven Behavior in Drosophila Larvae

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral paradigm, the experimenter usually assumes that the rapid diffusion of odorant molecules from the source leads to the creation of a stable gradient in the dish. To establish a quantitative correlation between sensory inputs and behavioral responses, it is necessary to achieve a more thorough characterization of the odorant stimulus conditions. In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

Yüksek çözünürlüklü Ölçüm Drosophila Larva Koku-Driven Davranış

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral ...

Biyoloji

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory bulb1-5. Olfactory information in the external world is transmitted to the antennal lobe by olfactory sensory neurons (OSNs), which segregate to distinct regions of neuropil called glomeruli according to the specific olfactory receptor they express. Here, OSN axons synapse with both local interneurons (LNs), whose processes can innervate many different glomeruli, and projection neurons (PNs), which convey olfactory information to higher olfactory brain regions.
Optical imaging of the activity of OSNs, LNs and PNs in the antennal lobe - traditionally using synthetic calcium indicators (e.g. calcium green, FURA-2) or voltage-sensitive dyes (e.g. RH414) - has long been an important technique to understand how olfactory stimuli are represented as spatial and temporal patterns of glomerular activity in many species of insects6-10. Development of genetically-encoded neural activity reporters, such as the fluorescent calcium indicators G-CaMP11,12 and Cameleon13, the bioluminescent calcium indicator GFP-aequorin14,15, or a reporter of synaptic transmission, synapto-pHluorin16 has made the olfactory system of the fruitfly, Drosophila melanogaster, particularly accessible to neurophysiological imaging, complementing its comprehensively-described molecular, electrophysiological and neuroanatomical properties2,4,17. These reporters can be selectively expressed via binary transcriptional control systems (e.g. GAL4/UAS18, LexA/LexAop19,20, Q system21) in defined populations of neurons within the olfactory circuitry to dissect with high spatial and temporal resolution how odor-evoked neural activity is represented, modulated and transformed22-24.
Here we describe the preparation and analysis methods to measure odor-evoked responses in the Drosophila antennal lobe using G-CaMP25-27. The animal preparation is minimally invasive and can be adapted to imaging using wide-field fluorescence, confocal and two-photon microscopes.

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

We describe an established technique to measure and analyze odor-evoked calcium responses in the antennal lobe of living Drosophila melanogaster.

Koku-uyarılmış Cevaplarının Kalsiyum Görüntüleme Drosophila Antennal Lob

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory ...

Electrophysiological Recording From Drosophila Labellar Taste Sensilla

The peripheral taste response of insects can be powerfully investigated with electrophysiological techniques. The method described here allows the researcher to measure gustatory responses directly and quantitatively, reflecting the sensory input that the insect nervous system receives from taste stimuli in its environment. This protocol outlines all key steps in performing this technique. The critical steps in assembling an electrophysiology rig, such as selection of necessary equipment and a suitable environment for recording, are delineated. We also describe how to prepare for recording by making appropriate reference and recording electrodes, and tastant solutions. We describe in detail the method used for preparing the insect by insertion of a glass reference electrode into the fly in order to immobilize the proboscis. We show traces of the electrical impulses fired by taste neurons in response to a sugar and a bitter compound. Aspects of the protocol are technically challenging and we include an extensive description of some common technical challenges that may be encountered, such as lack of signal or excessive noise in the system, and potential solutions. The technique has limitations, such as the inability to deliver temporally complex stimuli, observe background firing immediately prior to stimulus delivery, or use water-insoluble taste compounds conveniently. Despite these limitations, this technique (including minor variations referenced in the protocol) is a standard, broadly accepted procedure for recording Drosophila neuronal responses to taste compounds.

Electrophysiological Recording From Drosophila Labellar Taste Sensilla

This protocol describes extracellular recording of the action potential responses fired by labellar taste neurons in Drosophila.

Elektrofizyolojik Kayıt<em&gt; Drosophila</em&gt; Labellar Sensilla Taste

The peripheral taste response of insects can be powerfully investigated with electrophysiological techniques. The method described here allows the ...

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila express gustatory receptors1,2, ion channels3-6, and ionotropic receptors7 that are involved in the detection of volatile and non-volatile sensory cues. These neurons directly contact tastants such as food, noxious substances and pheromones and therefore influence many complex behaviors such as feeding, egg-laying and mating. Electrode recordings and calcium imaging have been widely used in insects to quantify the neuronal responses evoked by these tastants. However, electrophysiology requires specialized equipment and obtaining measurements from a single taste sensillum can be technically challenging depending on the cell-type, size, and position. In addition, single neuron resolution in Drosophila can be difficult to achieve since taste sensilla house more than one type of chemosensory neuron. The live calcium imaging method described here allows responses of single gustatory neurons in live flies to be measured. This method is especially suitable for imaging neuronal responses to lipid pheromones and other ligand types that have low solubility in water-based solvents.

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

The forelegs and proboscis of Drosophila contain a rich repertoire of gustatory sensory neurons. Here, we present a method using calcium imaging to measure physiological responses from sensory neurons in the foreleg and proboscis of live flies upon exogenous application of a gustatory pheromone.

Fizyolojik Yanıtları Ölçüm<em&gt; Drosophila</em&gt; Canlı Kalsiyum Görüntüleme kullanma Lipit Feromonlar Sensory Nöronlar

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To complicate matters even further, the odors detected by the insect nervous system usually are not single compounds but mixtures whose composition and concentration ratios vary. This leads to an almost infinite amount of different olfactory stimuli which have to be evaluated by the nervous system.
To understand which aspects of an odor stimulus determine its evaluation by the fly, it is therefore desirable to efficiently examine odor-guided behavior towards many odorants and odor mixtures. To directly correlate behavior to neuronal activity, behavior should be quantified in a comparable time frame and under identical stimulus conditions as in neurophysiological experiments. However, many currently used olfactory bioassays in Drosophila neuroethology are rather specialized either towards efficiency or towards resolution.
Flywalk, an automated odor delivery and tracking system, bridges the gap between efficiency and resolution. It allows the determination of exactly when an odor packet stimulated a freely walking fly, and to determine the animal&#180;s dynamic behavioral reaction.

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

The automated tracking system Flywalk is used for high-resolution quantification of odor-guided behavior in Drosophila melanogaster.

Koku kılavuzluğunda Davranış Yüksek çözünürlüklü Niceleme<em&gt; Drosophila melanogaster</emKullanma&gt;<em&gt; Flywalk</em&gt; Paradigma

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method described here enables the investigator to measure long-lasting (from minutes to hours) high-quality intracellular responses from single Drosophila R1-R6 photoreceptors and Large Monopolar Cells (LMCs) to light stimuli. Because the recording system has low noise, it can be used to study variability among individual cells in the fly eye, and how their outputs reflect the physical properties of the visual environment. We outline all key steps in performing this technique. The basic steps in constructing an appropriate electrophysiology set-up for recording, such as design and selection of the experimental equipment are described. We also explain how to prepare for recording by making appropriate (sharp) recording and (blunt) reference electrodes. Details are given on how to fix an intact fly in a bespoke fly-holder, prepare a small window in its eye and insert a recording electrode through this hole with minimal damage. We explain how to localize the center of a cell's receptive field, dark- or light-adapt the studied cell, and to record its voltage responses to dynamic light stimuli. Finally, we describe the criteria for stable normal recordings, show characteristic high-quality voltage responses of individual cells to different light stimuli, and briefly define how to quantify their signaling performance. Many aspects of the method are technically challenging and require practice and patience to master. But once learned and optimized for the investigator's experimental objectives, it grants outstanding in vivo neurophysiological data.

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Sharp microelectrodes enable accurate electrophysiological characterization of photoreceptor and visual interneuron output in living Drosophila. Here we show how to use this method to record high-quality voltage responses of individual cells to controlled light stimulation. This method is ideal for studying neural information processing in insect compound eyes.

Recording Hücre içi Gerilim Yanıtları için Elektrofizyolojik Yöntem<em&gt; Drosophila</em&gt; Işık Uyaranların için Fotoreseptörler ve internöronlar<em&gt; İn Vivo</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

A key challenge in neurobiology is to understand how neural circuits function to guide appropriate animal behaviors. Drosophila melanogaster is an excellent model system for such investigations due to its complex behaviors, powerful genetic techniques, and compact nervous system. Laboratory behavioral assays have long been used with Drosophila to simulate properties of the natural environment and study the neural mechanisms underlying the corresponding behaviors (e.g. phototaxis, chemotaxis, sensory learning and memory)1-3. With the recent availability of large collections of transgenic Drosophila lines that label specific neural subsets, behavioral assays have taken on a prominent role to link neurons with behaviors4-11. Versatile and reproducible paradigms, together with the underlying computational routines for data analysis, are indispensable for rapid tests of candidate fly lines with various genotypes. Particularly useful are setups that are flexible in the number of animals tested, duration of experiments and nature of presented stimuli. The assay of choice should also generate reproducible data that is easy to acquire and analyze. Here, we present a detailed description of a system and protocol for assaying behavioral responses of Drosophila flies in a large four-field arena. The setup is used here to assay responses of flies to a single olfactory stimulus; however, the same setup may be modified to test multiple olfactory, visual or optogenetic stimuli, or a combination of these. The olfactometer setup records the activity of fly populations responding to odors, and computational analytical methods are applied to quantify fly behaviors. The collected data are analyzed to get a quick read-out of an experimental run, which is essential for efficient data collection and the optimization of experimental conditions.

Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

We describe here a behavioral setup and data analysis method for assaying olfactory responses of up to 100 vinegar flies (Drosophila melanogaster). This system may be used with single or multiple olfactory stimuli, and adaptable for optogenetic activation or silencing of neuronal subsets.

Of Bilgisayar İzleme tarafından Analiz Edilmiş Olfaktor Davranışlar<em&gt; Drosophila</em&gt; Dört kadranda olfactometer içinde

A key challenge in neurobiology is to understand how neural circuits function to guide appropriate animal behaviors. Drosophila melanogaster is an ...

Single Sensillum Recordings for Locust Palp Sensilla Basiconica

The palps of locust mouthparts are considered to be conventional gustatory organs that play an important role in a locust&#39;s food selection, especially for the detection of non-volatile chemical cues through sensilla chaetica (previously named terminal sensilla or crested sensilla). There is now increasing evidence that these palps also have an olfactory function. An odorant receptor (LmigOR2) and an odorant-binding protein (LmigOBP1) have been localized in the neurons and accessory cells, respectively, in the sensilla basiconica of the palps. Single sensillum recording (SSR) is used for recording the responses of odorant receptor neurons, which is an effective method for screening active ligands on specific odorant receptors. SSR is used in functional studies of odorant receptors in palp sensilla. The structure of the sensilla basiconica located on the dome of the palps differs somewhat from the structure of those on the antennae. Therefore, when performing an SSR elicited by odorants, some specific advice may be helpful for obtaining optimum results. In this paper, a detailed and highly effective protocol for an SSR from insect palp sensilla basiconica is introduced.

This paper describes a detailed and highly effective protocol for single sensillum recordings from the sensilla basiconica on the palps of insect mouthparts.

Tek Sensillum kayıtları Locust Palp Sensilla Basiconica için

The palps of locust mouthparts are considered to be conventional gustatory organs that play an important role in a locust&#39;s food selection, especially ...

Böcek Tat Nöron Aktivitesinin Gelişmiş Analizi için Yeni Bir Yöntem

Base Recording: A Technique for Analyzing Responses of Taste Neurons in Drosophila

Insects taste the external world through taste hairs, or sensilla, that have pores at their tips. When a sensillum comes into contact with a potential food source, compounds from the food source enter through the pore and activate neurons within. For over 50 years, these responses have been recorded using a technique called tip recording. However, this method has major limitations, including the inability to measure neural activity before or after stimulus contact and the requirement for tastants to be soluble in aqueous solutions. We describe here a technique that we call base recording, which overcomes these limitations. Base recording allows the measurement of taste neuron activity before, during, and after the stimulus. Thus, it allows extensive analysis of OFF responses that occur after a taste stimulus. It can be used to study hydrophobic compounds such as long-chain pheromones that have very low solubility in water. In summary, base recording offers the advantages of single-sensillum electrophysiology as a means of measuring neuronal activity - high spatial and temporal resolution, without the need for genetic tools - and overcomes key limitations of the traditional tip recording technique.

Yazar Spot Işığı: Kemoresepsiyondaki Gelişmeler - Böcek Kokusu Reseptörlerinden Kodlamayan RNA'lara

A rarely used method of electrophysiological recording, base recording, allows analysis of features of taste coding that cannot be examined by conventional recording methods. Base recording also allows the analysis of taste responses to hydrophobic stimuli that cannot be studied using traditional electrophysiological methods.

Temel Kayıt: Drosophila'da Tat Nöronlarının Tepkilerini Analiz Etmek İçin Bir Teknik

Insects taste the external world through taste hairs, or sensilla, that have pores at their tips. When a sensillum comes into contact with a potential ...

Elektrofizyolojik Kayıt

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Böcekler Tek Sensillum Kayıtlar Drosophila melanogaster Ve Anofel gambiae

Yüksek çözünürlüklü Ölçüm Drosophila Larva Koku-Driven Davranış

Koku-uyarılmış Cevaplarının Kalsiyum Görüntüleme Drosophila Antennal Lob

Elektrofizyolojik Kayıt

Fizyolojik Yanıtları Ölçüm

Koku kılavuzluğunda Davranış Yüksek çözünürlüklü Niceleme

Recording Hücre içi Gerilim Yanıtları için Elektrofizyolojik Yöntem

Of Bilgisayar İzleme tarafından Analiz Edilmiş Olfaktor Davranışlar

Tek Sensillum kayıtları Locust Palp Sensilla Basiconica için

Temel Kayıt: Drosophila'da Tat Nöronlarının Tepkilerini Analiz Etmek İçin Bir Teknik