Koo BK ve Mustata RC Tıbbi Araştırma Konseyi (MRC) tarafından desteklenen Wellcome Trust ve Andersson-Rolf A Sir Henry Dale Bursu tarafından desteklenmektedir. Fink J Wellcome Trust 4 yıllık Doktora Programı tarafından desteklenmektedir.

Aşağıdaki protokole kullanılan farelerin belirli bir patojenden bağımsız koşullarda tutuldu ve tüm işlemler Birleşik Krallık Ofis düzenlemelerine uygun olarak yapıldı. 1. Hazırlık <ol><li> Kullanılmadan önce 1 saat süreyle ortam hazırlama en az 10 dakika kullanılmadan önce 37 ° C su banyosu içinde ön ısıtma işlemi (Tablo 1 ve Malzeme Listesi daha fazla bilgi için bkz.) </li></ol> 2. Kültürleme Küçük Bağırsak (SI) Organoids NOT: Aksi belirtilmedikçe, tüm inkübasyonlar nemli bir inkübatör içinde 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 ile gerçekleştirilir. Canlı hücreler ile temas eden aletler ve tepkime maddeleri steril olması gerekmektedir. Ön ısınma o bodrum matris (Matrıgel veya BME) Yayımlarken dışarı yayılmasını engeller damla gibi doku kültürü plaka önemlidir. Ayrıca, taban matris her zaman buz üzerinde tutulmalıdır. -20 ° C ve çözülme Mağazasıkullanımdan önce buz üzerinde. <ol><li> Kriptler Yalıtımlı <ol><li> Ince bağırsak izolasyonu için daha sonra, ulusal kurallar ve düzenlemelere göre fare kurban sırtında hayvan koyun ve% 70 etanol ile karın yıkayın. Sternum kasıktan bir uzunlamasına orta hat kesi gerçekleştirin. İlk olarak, deri ve deri altı doku daha sonra kesilir. Mideye çekumdan ince bağırsağı çıkarın. Duodenum, jejunum ve ileumdan izole kript organoid kültürü için de kullanılabilir. </li><li> Kalsiyum ya da magnezyum (PBS0) olmaksızın önceden soğutulmuş fosfat tamponlu serum fizyolojik ile, izole edilen ince bağırsağı yıkayın. </li><li> 3-5 cm uzunluğunda parçalar halinde doku kesmek ve uzunlamasına açık kesmek için makas kullanın. Forseps kullanarak doku yayıldı. </li><li> Lamel kullanarak villus kazımak. Dikkat, çok fazla kuvvet gözyaşı doku neden olur ve aşağıdaki adımları izleyerek kriptalarının verimini azaltacaktır. </li><li> Önceden soğutulmuş bir PBS0 usin içeren 50 ml&#39;lik bir tüpe transfer dokug forseps. Kuvvetli çalkalama ile doku parçaları yıkayıp PBS0 değiştirin. 2-3 x tekrarlayın veya PBS0 az bulutlu dönene kadar. </li><li> Bir tüp silindiri üzerindeki 4 ° C&#39;de 30 dakika boyunca 1 mM etilendiamin tetraasetik asit (EDTA) ile PBS0 30 ml içeren 50 ml&#39;lik bir tüp içinde doku inkübe edin. </li><li> Kuvvetlice çalkalanır tüp ve 5 mM EDTA ile PBS0 30 ml ihtiva eden bir 50 ml tüp doku aktarın. (Daha önce doku ihtiva etmektedir), 1 mM EDTA çözeltisi ve kript villi bir karışımını içerecektir. Genellikle villi yüksek bir oranda içerir, Bu fraksiyon organoids bir tohumlama için uygun değildir. </li><li> Bir tüp silindiri üzerindeki 4 ° C&#39;de 1 saat boyunca doku daha inkübe edin. </li><li> Kuvvetlice tüp sarsıntı ve temiz bir 50 ml tüp içinde çözeltisinin toplanması. Kript varlığını doğrulamak ve ışık mikroskopisi ile 50 ul crypts sayarak, örneğin sayısını tahmin ediyoruz. 50-100 kriptaları almak ve 1.5 ml t aktarmak için gerekli hacmi hesaplayınube. </li><li> 5 dakika boyunca 300 xg&#39;de Spin. , Supernatant Önceden ısıtılmış, 24 oyuklu bir plaka içerisinde temel matrisin 50 ul pelet ve tohum yeniden süspanse edin. Matris taban polimerize kadar 5-15 dakika boyunca bir doku kültür inkübatörü içinde inkübe edin. </li><li> 500 ul ENR ortamı ile Yerleşimi (bakınız Tablo 1). Küçük, yuvarlak bir şekil gösterir kistik organoids tohumlama sonra filizlenen ve yapıları 2-3 gün sonra yaklaşık 24 saat görünür hale gelir. Her 3 günde bir, taze ENR medya değiştirin. </li><li> Geçiş 7 günde kültürler organoid. </li></ol></li><li> Pasajlanması ve bakımı Organoids <ol><li> Her 3 gün ve geçiş 1 medyayı tazeleyerek organoids koruyun: lümen ölü hücreler, yaklaşık her 7 gün ile dolu olur 5: 3 veya 1. </li><li> 1 ml pipetman ucu kullanarak ortamı ile bodrum matris kubbeyi kırmak ve 1.5 ml tüp kuyudan aktarın. </li><li> Mekanik pipetleme ile a organoids ayırmakpproximately 50x cezası (örneğin, 200 ul) ucu kullanarak. </li><li> 5 dakika boyunca 300 xg&#39;de Spin. </li><li> Süpernatantı atın ve bodrum matris 150-250 ul pelletini. Bir tohum 24-kaynaklı plaka (/ oyuk taban matris 50 ul) önceden ısıtılmış. Kaplamak için bir kez bodrum matris yukarı ve aşağı ucunun duvar pipet ekim önce. Pipet yavaşça yayılmasını önlemek için matris temel kuyunun orta kabarcıkları ve tohum önlemek için. Bu iyi merkezinde taban kalıbının bir kubbe almak için arzu edilir. </li><li> Matris taban polimerize kadar 5-15 dakika boyunca bir doku kültür inkübatörü içinde inkübe edin. Kuyu başına 500 ul ENR medya ile Yerleşimi. </li></ol></li></ol> 3. Ön enfeksiyon SI Organoids Tedavisi NOT: Şekil 1, iletim prosedürü görüntülemektedir. <ol><li> ENRWntNic Exchange, ENR ortamı (Tablo 1 e bakınız) ve t organoids büyür3 gün veya bir kistik morfoloji kabul kadar en az onun orta. Nikotinamid (Nic) kültür etkinliğini iyileştirir Wnt3a kök ve Paneth hücrelerinin sayısını artırır. </li></ol> 4. Virüs Üretimi <ol><li> Platin-E hücreleri bir 150 mm tabak başına enfeksiyona gereklidir. Tohum yaklaşık puromycin (1 ug / ml) ve blasticidin (10 ug / ml) varlığında, 15-18 ml&#39;lik ortam (DMEM +% 10 FBS) ile 5 x 10 6 hücre. Bunlar% 70-80 ulaştığı zaman, 2-3 gün sonra hücrelerin transfekte. Puromisin olmayan ve de transfeksiyon önce blastisidin, DEM +% 10 FBS ile orta değiştirin. </li><li> Opti-MEM 1 ml içeren tüpler ayırmak için polietilenimin (PEI) retroviral DNA yapısının, 30 ug ve 240 ul ilave edin. Karıştırın ve 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Iki çözeltinin havuzu ve 20-30 dakika için oda sıcaklığında inkübe edin. Platin-E hücrelerinin ortamına tam karışımı ilave edilip dikkatle plat sallamake DNA PEI komplekslerinin eşit dağılımını sağlamak için. </li><li> Gece boyunca transfeksiyon karışımı ile platin-E hücreleri inkübe ve ortam ertesi gün yenileyin. 2 gün boyunca, yeni bir ortam içinde hücrelerin tutun. </li><li> , 50 ml&#39;lik bir Falcon tüpüne sadece orta toplamak 12-16 saat boyunca 4 ° C&#39;de 8000 x g&#39;de, bir 0.45 um filtre ve santrifüj geçirin. Süpernatantı atın ve İletimi orta 250 ul pelet (bakınız Tablo 1). </li></ol> 5. organoid Fragman hazırlanması <ol><li> Bir enfeksiyonu için bir 24 oyuklu plaka bir de gereklidir. 1 ml pipetman ucu kullanarak ortamı ile bodrum matris kubbeyi kırmak ve 1.5 ml tüp aktarın. </li><li> Ince bir ses ipucu (örneğin, 200 ul ipuçları) pipetle (30-50x) aracılığıyla organoids mekanik bozmaya kullanın. Çözelti bulanık hale ve herhangi bir tam organoids görünür olmalıdır. </li><li> 5 dakika boyunca oda sıcaklığında santrifüje, 900 x g<html> . </li><li> Süpernatantı atın ve hücre kültürü dereceli rekombinant proteaz (örneğin, TrypLE) 500 ul pelletini. 5 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edilir. İnkübasyondan sonra fragmanının başına hücre sayısının sayılması, ışık mikroskopisi kullanılarak organoid fragmanlarının boyutunu kontrol edin. 5-10 hücreleri içeren fragmanlar idealdir. Parçalarının çoğunluğu hücrelerinin daha yüksek bir sayı içeriyorsa inkübasyon süresi, aynı anda 2 dakika süre ile arttırılabilir. </li><li> ENR ortamının 500 ul ekleyerek ayrışma süreci sonlandırmak. </li><li> Oda sıcaklığında santrifüj, 5 dakika boyunca 900 x g. Süpernatantı ve buz ya da 4 ° C pelet tutmak. </li></ol> 6. retroviral İletimi <ol><li> Bir 48-yuvalı plakanın bir çukuruna (bölüm 4.5 &#39;dan itibaren) retroviral çözeltisi 250 ul organoid parçaları birleştirin. 1 ml pipetman ucu kullanarak yavaş pipetle hafifçe karıştırın. </li><li> Parafilm plaka mühür. </li></ol>e &quot;&gt; 7. Spinoculation ve Kaplama <ol><li> 1 saat boyunca, 32 ° C, 600 x g&#39;de santrifüje plaka. Parafilm dikkatlice çıkarın ve 6 saat boyunca bir doku kültür inkübatörü içinde inkübe edin. </li></ol> Enfekte organoid Fragments 8. Tohumculuk <ol><li> 5 dakika boyunca 900 xg&#39;de 1.5 ml tüp, ve spin kuyudan enfekte organoid fragmanlarını ve iletim ortamı aktarın. </li><li> Süpernatantı atın ve serin 5 dakika buz üzerinde pelet içeren tüp koymak. Bodrum matris 100 ul ekleyin ve yukarı ve aşağı yavaşça pipetleme pelletini. </li><li> Yeni 24-oyuklu bir plaka içerisinde 50 uL &#39;karışımı cell temel matris &quot;Tohum düşer. Matris taban katılaşıncaya kadar 5-15 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Oyuklara polibren olmayan iletim ortamı ilave edin ve bir doku kültürü inkübatörü içinde inkübe edin. 2-3 gün medya değiştirin. </li></ol> 9. Seçim <ol><li> Başlangıç ​​seortama puromisin (1 ug / ml) ilave edilerek 2-3 gün sonra lection. </li><li> Fragmanlar oluşturan organoids puromycin (1 mcg / ml) ile desteklenmiş, ENR medya ile İletimi ortamı değiştirmek için ne zaman başlıyor. </li></ol> 10. post-enfeksiyon SI Organoids Tedavisi <ol><li> Kültür göre, &quot;Pasajlanması ve organoids muhafaza&quot; protokolü (bölüm 2.2.1) organoids transdük. 1-2 hafta sonra SI organoids yeni kurdukları yapıları geri kazanacak. </li><li> 1 uM&#39;lik bir konsantrasyonda çalışma 4-OH (4-OHT) eklenerek miRNA ya da DNA ekspresyonunu tomurcuklanan yapıların görünüşünü ardından. Bu aşama Addgene (pMSCV-loxP-DsRed-loxP-EGFP-Puro-WPRE (32702), pMSCV-loxP-DsRed-loxP-3xHA-Puro-WPRE (32703) ve ikinci pMSCV, retroviral vektörler kullanılarak halinde geçerli olduğuna dikkat ediniz -Flip-puro-DsRed-GFP-miRNA (32704)) ve kre-ERT2 ifade organoids. </li></ol> Enfeksiyon ve Expr 11. Onayıİlgi geninin salgılamanın ardından / bastırılması <ol><li> Addgene (32702, 32703 ve 32704) için, retroviral vektörler kullanılarak Eğer iletim verimliliği DsRed ifade gözlemi ile teyid edilebilir. Koo ve arkadaşlarına 4 de örneklendiği gibi Buna ilaveten, ilgi konusu genin ifade veya bastırılması, GFP veya (gen demonte için) 3xHA (gen aşırı ifadesi için) epitopu ve QPCR kullanılarak, Western Blot ile teyit edilebilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li><li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+self-organizing+mini-guts+from+a+single+intestinal+stem+cell:+mechanism+and+applications.">Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications.</a> Science. 340, 1190-1194 (2013).</li><li>Stelzner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nomenclature+for+intestinal+in+vitro+cultures.+American+journal+of+physiology.">A nomenclature for intestinal in vitro cultures. American journal of physiology.</a> Gastrointestinal and liver physiology. 302, G1359-G1363 (2012).</li><li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+gene+expression+in+primary+Lgr5+organoid+cultures.">Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures.</a> Nature. 9, 81-83 (2012).</li><li>Schwank, G., Andersson-Rolf, A., Koo, B. K., Sasaki, N., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+BAC+Transgenic+Epithelial+Organoids.">Generation of BAC Transgenic Epithelial Organoids.</a> PloS one. 8, e76871 (2013).</li><li>Mustata, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr4+is+required+for+Paneth+cell+differentiation+and+maintenance+of+intestinal+stem+cells+ex+vivo.">Lgr4 is required for Paneth cell differentiation and maintenance of intestinal stem cells ex vivo.</a> EMBO reports. 12, 558-564 (2011).</li><li>Lau, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr5+homologues+associate+with+Wnt+receptors+and+mediate+R-spondin+signalling.">Lgr5 homologues associate with Wnt receptors and mediate R-spondin signalling.</a> Nature. 476, 293-297 (2011).</li><li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+suppressor+RNF43+is+a+stem-cell+E3+ligase+that+induces+endocytosis+of+Wnt+receptors.">Tumour suppressor RNF43 is a stem-cell E3 ligase that induces endocytosis of Wnt receptors.</a> Nature. 488, 665-669 (2012).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unlimited+in+vitro+expansion+of+adult+bi-potent+pancreas+progenitors+through+the+Lgr5/R-spondin+axis.">Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis.</a> The EMBO journal. 32, 2708-2721 (2013).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+single+Lgr5++liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration.">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494, 247-250 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose. The authors have no conflict of interest declared.

<html> Yüksek transdüksiyon verimi bazı yönleri kritik ulaşmak. Bir yuvarlak Kistik şeklinin benimsenmesi kadar bir ENRWntNic ortamı ile organoids öncesi bir tedavi yöntemidir. Bu kök hücrelerin sayısını ve transgenin kararlı entegrasyonu elde edilmesi, hem de transdüksiyon işlem boyunca SI organoids hayatta kalma oranının artması, dolayısıyla da olasılığını artırır. Diğer bir parametre spinoculation izleyen inkübasyon zamanı. Sırasıyla yoksul iletim verimliliği ve organoids kötü sağkalım, çok kısa veya çok uzun kuluçka sonuçları. Önemli ölçüde transduse organoids yüzdesini arttırdığı halde spinoculation aşaması esas teşkil etmemektedir. Son olarak, yüksek-titreli bir virüs başarılı iletimi için anahtardır. Bu paketleme hücre hattı ve virüs tipine bağlıdır. Platin-D hücre hattı ve murin stem hücre virüsü (MSCV) kombinasyonu, organoids transdüksiyonu için yeterince yüksek bir titreye ürettiği bulundu. ve_content &quot;&gt; Aşağıda başarılı iletimini elde etmek için yardımcı olabilir giderme için ipuçları. paketleme hücre hattının transfeksiyon düşük olup olmadığına, hücrelerin% 70-80 konflüansa ile kuluçkalama süresi bu olduğundan emin olmak Havuza alınan PEİ-DNA karışımı, 20-30 dakika arasındadır. iletimi aşamasında organoids hayatta kalması oldukça parçası boyutuna bağlıdır. çok uzun tripsinizasyon az 3 hücrelerinin oluştuğu parçalarının çoğunluğu neden olmakta ve böylece organoid hayatta kalma azaltır. bir başka etmen Wnt kıvamlandırılmış ortam aktivitesi, etkinliği çok düşük hayatta kalma oranları için 5 uM konsantrasyonda bir çalışma CHIR99021 ilavesi yoluyla da artırılması ise. CHIR99021 artmış Wnt sinyal ile sonuçlanır GSK3 inhibe eder. Ayrıca, Y&#39;nin-27362, burada önler organoids önce iletimine parçaları (1-10 hücresi içeren) için bozulur çünkü anoikis, organoid hayatta kalma artırmak için transdüksiyon ortama ilave edilir. gibi60, yukarıda belirtildiği gibi, spinoculation sonraki kuluçka süresi 6 saat geçmemelidir. Kötü iletim gözlenmesi halinde Son olarak, viral titresi ve retroviral vektör için ek parçanın boyut sınırını etkileyen belirtilen faktör dikkate alınmalıdır. Nakavt etkinliği miRNA son derece bağlıdır. Verimi, hedef gen ve miRNA kombinasyonu ile değiştiğinden dolayı, en iyi işlev yapanlardan belirlemek için bir ekran verim performans değerdir. Bu teknik alan organoid sisteminin epitel fenomeni ile sınırlandırılmıştır. Gelecekte sırasıyla, bağışıklık sistemi kaynaklı bileşenleri olan patojenlere ya da yeniden kurma ko-kültür ile enfeksiyon ya da bağışıklık aracılı hastalıklar çalışma mümkün olabilir. Ayrıca, retrovirüsler sadece nispeten küçük bir boyutta insertleri taşıyabilir. Sonuç olarak, doğal olarak ortaya çıkan düzenleyici bölgeleri hariç tutulması ve dolayısıyla transgen sentezleme bu taklit edilemezendojen gen. Yukarıda zikredildiği gibi, portatif verimi, hedef geni ve miRNA bağlıdır. Uygun Knockdown verimlilik ile hiçbir MiRNA bulunabilir Eğer o belirli hedef geni için tekniğin kullanımını sınırlayabilir. Teorik olarak, organoids hücre çizgileri için kullanılan tüm standart manipülasyonu teknikleri ile uyumludur. Retroviral transdüksiyon 4 rapor edilecek ilk yöntem oldu ve son zamanlarda BAC (bakteriyel yapay kromozom) -transgenesis 5 kullanılabilir hale gelmiştir. 2-3 haftalık bir toplam üretim süresi ile, paketleme hücre hattı viral plazmid transfeksiyonundan sonra, bir transgenik (TG) fare üretimi önemli ölçüde daha hızlıdır. Kök hücrelerin yanı sıra bağırsak epiteli tüm farklılaşmış hücre soyları içeren iken, in vivo crypt-villus mimarisini koruyarak, organoid kültür sistemi tg hayvan ve önceden kullanılan hücre kültürü arasındaki köprüdür. <psınıf = &quot;jove_content&quot;&gt; Burada açıklanan protokol, bir gain- yoluyla in vitro endodermal epitel fenotipik analizi gerçekleştirmek için bir yöntem ve fonksiyon testleri kaybı: içerir. Bu tg farelerde asgari ihtiyacı olan, yetişkin kök hücre biyolojisi fizyolojik ilgili soruları mümkün olur. Örneğin, koşullu nakavt farelerinin kuşak perinatal öldürücülüğü 6, yeni doğan mutantlardan türetilen organoids kullanılarak önlenebilir. Buna ek olarak, teknik, ilave, yok etme 7,8 gerçekleştirerek paralogues rolünü incelemek için, daha önce belirlenmiş knockout farelerden türetilen organoids uygulanabilir. Ince bağırsak organoids kurulmasından sonra, orijinal kültür protokol adaptasyon pankreas, karaciğer, kolon ve mide epiteliyalarının 9-11 kültürlenmesini izin verdi. Bundan başka, insan bağırsak organoids ve tümör organoids primer Aden, normal insan biyopsilerinden elde edilmiştiroma ve kolorektal kanser 10 biyopsisi. Viral enfeksiyon protokolü kolay organoids bu tür genişletilmiş ve insan kaynaklı dokularda fonksiyonel çalışmalar yapmak görülmemiş bir yol sağlar. Birlikte ele alındığında, küçük bağırsak organoids retroviral transdüksiyon kök hücre bakım, farklılaşma ve hücre kader kararı, yanı sıra hücre sinyalizasyon ve hücre-hücre etkileşimleri araştırmak için değerli bir kaynaktır.

Yüksek verim fonksiyonel genetik mevcut temel bilimleri ve tıp artırmak için, vücudun biyolojik anlayışı artırmak için gereklidir. Fare genetiği zaman alıcı ve masraflı hem de olmasına rağmen, in vivo gen fonksiyonlarını araştırmak için altın standart olmuştur. Daha az pahalı olmak için diğer yaygın bir seçim olan hücre çizgileri, daha yüksek bir randıman kapasitesine sahiptir. Ancak, in vivo olarak görülen uygun mikroçevresinin ve böylece fizyolojik cevapları yeniden kendi yetersizlik tarafından aksýyor. Dolayısıyla, maliyet / zaman verimli, yüksek verim analizi süre verir kolay bir-kolu model sistemi için kesin bir ihtiyaç vardır in vivo olarak transgenik (TG) fare deneylerde tespit edilen ve fizyolojik yanıtlar taklit edebilir. Endodermal epiteli böyle bir model sistem 2009 1 çıktı. Bilgisi Lgr5-pozitif bağırsak kök hücrelerin keşfinden elde Arasında edildikök hücre bakımı için gerekli ekstra-hücresel matris ve büyüme faktörlerine tekabül niş hakkında bilgi. O da organoids 2 olarak bilinen &#39;mini cesareti&#39; kurmak mümkün oldu bu bilgiyi kullanmak. En son organoids &#39;enteroids &quot;olarak adlandırılmaktadır, in vitro kültürler, için bir fikir birliği adlandırma 3 önerilmiştir. Hücre hatları gibi, organoids sürekli genişleyen ve ligandlar ve inhibitörlerle tedavi etmek kolaydır. Ancak, bunun yerine iki boyutlu olmanın üç-boyutlu kendi kendini düzenleyen crypt-villus düzenini korur yapılarının yanı sıra kök hücreler ve küçük bağırsak (SI) farklılaşmış hücre soyları vardır. Organoids bir lümen alanını çevreleyen epitel hücreleri, tek bir yüzeyden oluşmaktadır. Çıkıntılı tomurcuklanan yapılar kök hücre bölmesini içeren ince bağırsak crypts gelmektedir. Bunlar, akut MI ile tomurcuklanan yapının ucundan başlayarak projenitör hücrelerinin farklılaşmasınaterminal açıdan farklılaşmış hücreleri, lümenin içine dökülür epitelial doğru rendelenir. Hücre hatlarına kıyasla bu ex vivo olarak daha yakından sistem normal fizyolojisi tekrarlar ve bu nedenle, ince bağırsak epiteli için umut verici bir model sistem. Retroviral transdüksiyon Bu video protokolü, biz bu yeni organoid kültür sistemi ex vivo gen fonksiyon çalışmalarını sağlayan bir yöntem mevcut. Bu adım-adım bir şekilde tarif kültür organoid ile başlar ve transdüksiyon prosedürü takip retrovirüslerin üretimi gösteren devam edin. Son olarak, sorun giderme için ek tavsiye için bir bölüm vardır. Bu tekniğin bir avantajı, bağırsak epitel homeostazı, hücre hayati kararlan ve hücre-hücre etkileşimini incelemek canlı görüntüleme ve ilaç taraması ile birleştirilebilir olmasıdır. Nedeniyle, basit mimarisi ve hızlı ciro oranı, organoids ideal bir model s temsilyetişkin kök hücre biyolojisi çalışmaları için istem. Buna ek olarak Retroviral transdüksiyon, önceden belirlenmiş bir transgenik farelerin yanı sıra insan hasta örneklerinden türetilmiş organoids uygulanabilir. In-knock knock-out yaklaşımlar insanlara uzatılamaz gibi, insan SI organoids cazip bir alternatif oluşturmaktadır. Özetle, retrovirütik iletimi yoluyla gen manipülasyonu insan kaynaklı dokularında çalışmalar için yeni yollar açarken, böylece fare genetiğini ve tamamlayıcı hücre soyları, fare ya da insan doku örnekleri türetilmiş küçük bağırsak organoids fenotipik analiz sağlar. Retroviral transdüksiyon, gain- sağlar ve zarar fonksiyon-çalışmaları organoid 4 kültür sistemi içinde gerçekleştirilmelidir. Bu üç Rs (azaltma, arıtma, ve yedek) uyarınca olurken gen işlevi, yetişkin kök hücre biyolojisi ve hastalığı araştırmak için değerli bir kaynak haline getirmektedir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1090">
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:220px;">Advanced DMEM/F12&#160;</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">12634-034</td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Glutamax 100x&#160;</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">35050-068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Hepes 1M&#160;</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Penicillin- Streptomycin 100x</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">B27 supplement 50x</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">N2 supplement 100x&#160;</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">n-Acetylcysteine 500 mM&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">mouse EGF 500 &#181;g/ml</td>
			<td>Invitrogen Biosource</td>
			<td>PMG8043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">mouse Noggin 100 &#181;g/ml&#160;&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">R-Spondin conditioned medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>The conditioned media is generated&#160; from HEK293 cells, for details see Sato and Clevers 2013</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Wnt conditioned medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>The conditioned media is generated&#160; from L cells, for details see Sato and Clevers 2013</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Nicotinamide 1 M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Y-27632 10 &#181;M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y0503-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polybrene 8 &#181;g/ml)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9268-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;">Standard BD Matrigel matrix</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356231</td>
			<td style="width:595px;">Basement Matrix Extract (Cultrex PathClear BME Reduced Growth Factor Type 2, 3533-005-02 ) 
			supplied by AMSBIO can be used as an alterntive.</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:220px;">24 well plate</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>662960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">48 well plate</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>677980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">CHIR99021</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3734-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Platinum- E cells</td>
			<td>Cell biolabs</td>
			<td>RV-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Puromycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A1113802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:220px;">Blasticidin</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A1113902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:220px;">Polyethyleneimine (PEI)</td>
			<td style="width:157px;">Polysciences</td>
			<td style="width:119px;">23966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:220px;">opti-MEM</td>
			<td style="width:157px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">51985-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:220px;">TrypLE</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:220px;">Parafilm</td>
			<td style="width:157px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P7793-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:220px;">4-OHT</td>
			<td style="width:157px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H7904</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture

Lgr5-pozitif kök hücreler gerekli büyüme ile takviye edilebilir EGF Noggin, kültür ve in vitro birincil 3D epitel yapıları sürekli genişleyen için bize izin verir R-Spondin, faktörleri. Hem de organoids denilen bu &#39;mini cesaret&#39;, mimarisi ve fizyolojik özellikleri, yakından in vivo çok benzeyen. Bu onları küçük bağırsak epiteli için cazip bir model sistem yapar. Retroviral transdüksiyon ile fonksiyonel genetik hemen koşullu gen aşırı ifadesi ya da devirme ile gerçekleştirilebilir. Bu video organoid kültür prosedürü, retrovirüslerin üretimi ve in vitro olarak küçük bağırsak epiteli fenotipik analizi yardımcı olmak için organoids retroviral iletimini göstermektedir. Retroviral aracılı gen ekspresyonu ile kombinasyon halinde bu yeni Organotipik model sistemi costl gerek olmadan, in vitro olarak gen fonksiyonunun hızlı analiz için değerli bir araç sağlarTransjenik hayvanlar için, y ve zaman alıcı üretimi.

Organoids merkezi lümen bağlı olarak ölü hücreleri (Şekil 2) varlığı karanlık bölme zaman hazırdır. Tedavi öncesi organoids 2-3 gün sonra bir yuvarlak kistik morfoloji (Şekil 3) benimsemelidir. Bu stabil entegrasyonunu elde şansını arttıran kök hücrelerin sayısını artırır. Viral pelet boyutu nedeniyle topak boyutuna hücre artıkları arasında değişen katkısı, viral süpernatanın santrifüjleme ile en muhtemel değişebilir. Transdüksiyon verimliliği net bir korelasyon gözlenmiştir. Olanlar istikrarlı bir entegrasyon kalacaktır yerken seçim prosedürü sırasında sigara transdüksiyonlu organoids, ölecek. MSCV-EGFP retrovirüslerden floresan proteini (Şekil 4) transdüksiyonu takip eden 2-3 gün içinde kistik morfolojiye sahip kalan organoids gelen bu hücrelerde görülmektedir. <img alt<html> = &quot;Şekil 1&quot; fo: İçerik-width = &quot;6in&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 51765 / 51765fig1highres.jpg&quot; width = &quot;600&quot; /&gt; Şekil 1. retroviral transdüksiyon işlemin şematik bir çizimi. Önceki enfeksiyon organoids için önceden muamele edilmiş bir kistik yapı (aşama 1) ile uyum sağlayıncaya kadar ENRWntNic bulunmaktadır. Platin-E, hücreler paketleme hücre hattı olarak kullanılan, ve% 70-80 gelinceye kadar büyütülür. Bundan sonra, PEI ile retroviral yapı ile transfekte edilir. Virüsler 2 gün sonra (aşama 2) hasat edilmiştir. Organoids 1-10 hücreleri (aşama 3) ihtiva eden fragmanlar elde etmek, tripsinize edilir, ve daha sonra (adım 4) enfekte edilir. Kararlı bütünleşmesi (adım 7) yapılabilir ile spinoculation takiben enfeksiyon verimliliği (adım 5) artırmak için, enfekte organoid fragmanlar pozitif klonlar için (adım 6) ve 2-3 gün sonra seçim ekilir. 1765fig2highres.jpg &quot;width =&quot; 500 &quot;/&gt; Şekil kültür 4-6 gün sonra organoids 2. Temsilcisi görüntü. Lümen, ölü hücreleri ile dolu karanlık görünür yapıyor. Bu aşamada Organoids geçişli hazırdır. <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51765/51765fig3highres.jpg" width="500" /> 3-4 gün boyunca ENRWntNic medyada kültüre ince bağırsak organoids Şekil 3. Temsilcisi görüntü. Organoids kistik morfoloji benimsenmesi. <img alt="Şekil 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51765/51765fig4highres.jpg" width="500" /> Ince bağırsak organoids Şekil 4. Temsilcisi görüntüsü (a) viral transgen ifade (b eGFP) gösteriyor ki. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td colspan="2"> AdvaAdvanced DMEM / F12 +++ </td></tr><tr><td colspan="2"> 4 hafta boyunca 4 ° C&#39;de saklayın </td></tr><tr><td> Gelişmiş DMEM / F12 </td><td> 500 mi </td></tr><tr><td> Glutamax 100x </td><td> 5 mi </td></tr><tr><td> HEPES 1 M </td><td> 5 mi </td></tr><tr><td> Antibiyotikler 100x </td><td> 5 mi </td></tr><tr><td colspan="2"> ENRWntNic ortamı (20 ml) </td></tr><tr><td colspan="2"> 2 hafta boyunca 4 ° C&#39;de saklayın </td></tr><tr><td> Gelişmiş DMEM / F12 +++ </td><td> 7.2 mL </td></tr><tr><td> B27 takviyesi (50x) </td><td> 400 ul </td></tr><tr><td> N2 takviyesi (100x) </td><td> 200 ul </td></tr><tr><td> N-asetilsistein (500 mM) </td><td> 50 ul </td></tr><tr><td> fare EGF (500 ng / ml) </td><td> 2 ul </td></tr><tr><td> Noggin, fare (100 ug / ml) </td><td> 20 ul </td></tr><tr><td> R Spondin conditbahsettiğimiz orta </td><td> 2 mi </td></tr><tr><td> Wnt3a koşullandırılmış ortam </td><td> 10 mi </td></tr><tr><td> Nikotinamid (1 M) </td><td> 200 ul </td></tr><tr><td colspan="2"> Transdüksiyon ortamı (20 ml) </td></tr><tr><td colspan="2"> Taze hazırlayın </td></tr><tr><td> ENRWntNic orta </td><td> 20 mi </td></tr><tr><td> -Y-27632 (10 uM) </td><td> 20 ul </td></tr><tr><td> Polibren (8 ug / ml) </td><td> 20 ul </td></tr><tr><td colspan="2"> ENR ortamı (20 ml) </td></tr><tr><td colspan="2"> 4 hafta boyunca 4 ° C&#39;de saklayın </td></tr><tr><td> Gelişmiş DMEM / F12 +++ </td><td> 17.4 mi </td></tr><tr><td> B27 takviyesi (50x) </td><td> 400 ul </td></tr><tr><td> N2 takviyesi (100x) </td><td> 200 ul </td></tr><tr><td> N-asetilsistein (500 mM) </td><td> 50 ul </td&gt; </tr><tr><td> fare EGF (500 ng / ml) </td><td> 2 ul </td></tr><tr><td> Noggin, fare (100 ug / ml) </td><td> 20 ul </td></tr><tr><td> R Spondin koşullu ortam </td><td> 2 mi </td></tr><tr><td colspan="2"> Platin-E hücreleri için ortamı (500 ml) </td></tr><tr><td colspan="2"> 12 hafta boyunca 4 ° C&#39;de saklayın </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 449,45 mi </td></tr><tr><td> Fetal sığır serumu (FBS) </td><td> 50 mi </td></tr><tr><td> Puromisin (1 ug / ml) </td><td> 50 ul </td></tr><tr><td> Blastisidin (10 ug / ml) </td><td> 500 ul </td></tr></tbody></table> Platin-E hücreleri için Gelişmiş DMEM / F12 +++, ENRWntNic orta, Transdüksiyon orta, ENR orta ve orta Tablo 1. Medya bileşimi.

Watch this Scientific Journal Video about A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture at JoVE.com

A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture

Bu protokol ana Lgr5-pozitif yer alan organoid kültür ve Retroviral transdüksiyonun müteakip bir uygulama açıklanmaktadır. Bu in vitro olarak Organotipik bir roman içinde gerçekleştirilebilir fonksiyonel çalışmalar teslim transjenin uyarımlı Cre aşırı ekspresyonunu veya demonte sağlar ve sağlar model sistem.

İlköğretim Bağırsak organoid Kültür Retrovirütik Enfeksiyon Bir Video Protokolü

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding ...

a-video-protocol-retroviral-infection-primary-intestinal-organoid

Research

JoVE Journal

Biology

29.5K Görüntüleme.  University of Cambridge.  Bu protokol ana Lgr5-pozitif yer alan organoid kültür ve Retroviral transdüksiyonun müteakip bir uygulama açıklanmaktadır. Bu in vitro olarak Organotipik bir roman içinde gerçekleştirilebilir fonksiyonel çalışmalar teslim transjenin uyarımlı Cre aşırı ekspresyonunu veya demonte sağlar ve sağlar model sistem. 

Video: A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes (A. aegypti) and Infection Phenotype Determination

The purpose of this procedure is to infect the Aedes mosquito with dengue virus in a laboratory condition and examine the infection level and dynamic of the virus in the mosquito tissues. This protocol is routinely used for studying mosquito-virus interactions, especially for identification of novel host factors that are able to determine vector competence. The entire experiment must be conducted in a BSL2 laboratory. Similar to Plasmodium falciparum infections, proper attire including gloves and lab coat must be worn at all times. After the experiment, all the materials that came in contact with the virus need to be treated with 75% ethanol and bleached before proceeding with normal washing. All other materials need to be autoclaved before discarding them.

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes A. aegypti and Infection Phenotype Determination

Once a gene is identified as potentially refractory for the dengue virus, it must be evaluated for it's role in preventing viral infections within the mosquito. This protocol illustrates how the extent of dengue infections of mosquitoes can be assayed. The techniques for growing up the virus in culture, membrane feeding mosquitoes human blood, and assaying viral titers in the mosquito midgut are demonstrated.

Dang Enfeksiyonlar Sivrisinekler (A. aegypti) ve Enfeksiyon Fenotip belirlenmesi için protokol

The purpose of this procedure is to infect the Aedes mosquito with dengue virus in a laboratory condition and examine the infection level and dynamic of ...

Biyoloji

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the inner ear (fig 1). Hair cells in the developing cochlea, which are the mechanosensory cells of the auditory system, are aligned in one row of inner hair cells and three (in the base and mid-turns) to four (in the apical turn) rows of outer hair cells that span the length of the organ of Corti. Hair cells transduce sound-induced mechanical vibrations of the basilar membrane into neural impulses that the brain can interpret. Most cases of sensorineural hearing loss are caused by death or dysfunction of cochlear hair cells.
An increasingly essential tool in auditory research is the isolation and in vitro culture of the organ explant 1,2,9. Once isolated, the explants may be utilized in several ways to provide information regarding normative, anomalous, or therapeutic physiology. Gene expression, stereocilia motility, cell and molecular biology, as well as biological approaches for hair cell regeneration are examples of experimental applications of organ of Corti explants.
This protocol describes a method for the isolation and culture of the organ of Corti from neonatal mice. The accompanying video includes stepwise directions for the isolation of the temporal bone from mouse pups, and subsequent isolation of the cochlea, spiral ligament, and organ of Corti. Once isolated, the sensory epithelium can be plated and cultured in vitro in its entirety, or as a further dissected micro-isolate that lacks the spiral limbus and spiral ganglion neurons. Using this method, primary explants can be maintained for 7-10 days. As an example of the utility of this procedure, organ of Corti explants will be electroporated with an exogenous DsRed reporter gene. This method provides an improvement over other published methods because it provides reproducible, unambiguous, and stepwise directions for the isolation, microdissection, and primary culture of the organ of Corti.

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti.

This procedure describes a method for the isolation and culture of the murine organ of Corti with or without the spiral limbus and spiral ganglion neurons. We also demonstrate a method for the expression of an exogenous reporter gene in the organ of Corti explant by electroporation.

İlköğretim Kültür ve Corti murin Organ Plazmid Elektroporasyon.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

Sıçan Karaciğer Hücreleri İzolasyon ve İlköğretim Kültür

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Retroviral Infection of Murine Embryonic Stem Cell Derived Embryoid Body Cells for Analysis of Hematopoietic Differentiation

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for investigating the development of early hematopoietic progenitor cells (HPCs). Gene expression in ESCs can be manipulated by several techniques that allow the role for individual molecules in development to be determined. One difficulty is that expression of specific genes often has different phenotypic effects dependent on their temporal expression. This problem can be circumvented by the generation of ESCs that inducibly express a gene of interest using technology such as the doxycycline-inducible transgene system. However, generation of these inducible cell lines is costly and time consuming. Described here is a method for disaggregating ESC-derived embryoid bodies (EBs) into single cell suspensions, retrovirally infecting the cell suspensions, and then reforming the EBs by hanging drop. Downstream differentiation is then evaluated by flow cytometry. Using this protocol, it was demonstrated that exogenous expression of a microRNA gene at the beginning of ESC differentiation blocks HPC generation. However, when expressed in EB derived cells after nascent mesoderm is produced, the microRNA gene enhances hematopoietic differentiation. This method is useful for investigating the role of genes after specific germ layer tissue is derived.

Manipulating temporal gene expression in differentiating embryonic stem cells (ESCs) can be achieved using inducible gene systems. However, generation of these cell lines is costly and time consuming. This protocol achieves rapid expression of a transgene in differentiating ES-derived cells and subsequent analysis of downstream hematopoietic differentiation.

Kemirgen Embriyonik retroviral Enfeksiyon Hematopoetik Farklılaşma Analizi için Hücre Türetilmiş embriyoidlerin Vücut Kök Hücreler

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for ...

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and composed of mature enterocytes, goblet cells and enteroendocrine cells; and crypts, residing proximal to the submucosa and the muscularis, harboring adult stem and progenitor cells and mature Paneth cells, as well as stromal and immune cells of the crypt microenvironment. Until the last few years, in vitro studies of small intestine was limited to cell lines derived from either benign or malignant tumors, and did not represent the physiology of normal intestinal epithelia and the influence of the microenvironment in which they reside. Here, we demonstrate a method adapted from Sato et al. (2009) for culturing primary mouse intestinal crypt organoids derived from C57BL/6 mice. In addition, we present the use of crypt organoid cultures to assay the crypt metabolic profile in real time by measurement of basal oxygen consumption, glycolytic rate, ATP production and respiratory capacity. Organoids maintain properties defined by their source and retain aspects of their metabolic adaptation reflected by oxygen consumption and extracellular acidification rates. Real time metabolic studies in this crypt organoid culture system are a powerful tool to study crypt organoid energy metabolism, and how it can be modulated by nutritional and pharmacological factors.

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Small intestinal crypt organoids cultured ex vivo provide a tissue culture system that recapitulates growth of crypts dependent on stem cells and their niche. We established a method to assay the metabolic profile in real time in primary mouse crypt organoids. We found organoids maintain physiological properties defined by their source.

Metabolik Profil Gerçek Zamanlı Analizi<em&gt; Ex vivo</em&gt; Fare Bağırsak Crypt organoid Kültürleri

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and ...

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth factors. Since organoids are highly similar to the original tissue in terms of homeostatic stem cell differentiation, cell polarity and presence of all terminally differentiated cell types known to the adult intestinal epithelium, they serve as an essential resource in experimental research on the epithelium. The possibility to express transgenes or interfering RNA using lentiviral or retroviral vectors in organoids has increased opportunities for functional analysis of the intestinal epithelium and intestinal stem cells, surpassing traditional mouse transgenics in speed and cost. In the current video protocol we show how to utilize transduction of small intestinal organoids with lentiviral vectors illustrated by use of doxycylin inducible transgenes, or IPTG inducible short hairpin RNA for overexpression or gene knockdown. Furthermore, considering organoid culture yields minute cell counts that may even be reduced by experimental treatment, we explain how to process organoids for downstream analysis aimed at quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry. Techniques that enable transgene expression and gene knock down in intestinal organoids contribute to the research potential that these intestinal epithelial structures hold, establishing organoid culture as a new standard in cell culture.

In this video protocol we give a step by step explanation of lentiviral transduction in organoids of primary intestinal epithelium and of processing and downstream analysis of these cultures by quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry.

Lentiviral İletim ve Bağırsak Organoids Mansabında Analizi için Protokol

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

Yenidoğan ve Erişkin Fare Ciltlerindeki Primer Fare Keratinositlerin İzolasyonu ve Kültürü

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Apoptosis Induction and Detection in a Primary Culture of Sea Cucumber Intestinal Cells

Primary cultured cells are used in a variety of scientific disciplines as exceptionally important tools for the functional evaluation of biological substances or characterization of specific biological activities. However, due to the lack of universally applicable cell culture media and protocols, well described cell culture methods for marine organisms are still limited. Meanwhile, the commonly occurring microbial contamination and polytropic properties of marine invertebrate cells further impede the establishment of an effective cell culture strategy for marine invertebrates. Here, we describe an easy-to-handle method for culturing intestinal cells from sea cucumber Apostichopus japonicus; additionally, we provide an example of in vitro apoptosis induction and detection in primary cultured intestinal cells. Moreover, this experiment provides details about the appropriate culture medium and cell collection method. The described protocol is compatible with a variety of widely available tissue samples from marine organisms including Echinodermata, Mollusca, and Crustacea, and it can provide sufficient cells for multiple in vitro experimental applications. This technique would enable researchers to efficiently manipulate primary cell cultures from marine invertebrates and to facilitate the functional evaluation of targeted biological materials on cells.

This protocol provides an easy-to-handle method to culture the intestinal cells from sea cucumber Apostichopus japonicus and is compatible with a variety of widely available tissue samples from marine organisms including Echinodermata, Mollusca, and Crustacea.

Deniz Hıyar Bağırsak Hücrelerinin Birincil Kültüründe Apoptosis İndüksiyon uyupve tayini

Primary cultured cells are used in a variety of scientific disciplines as exceptionally important tools for the functional evaluation of biological ...

Organoid-Derived Epithelial Monolayer: A Clinically Relevant In Vitro Model for Intestinal Barrier Function

In the past, intestinal epithelial model systems were limited to transformed cell lines and primary tissue. These model systems have inherent limitations as the former do not faithfully represent original tissue physiology, and the availability of the latter is limited. Hence, their application hampers fundamental and drug development research. Adult stem-cell-based organoids (henceforth referred to as organoids) are miniatures of normal or diseased epithelial tissue from which they are derived. They can be established very efficiently from different gastrointestinal (GI) tract regions, have long-term expandability, and simulate tissue- and patient-specific responses to treatments in vitro. Here, the establishment of intestinal organoid-derived epithelial monolayers has been demonstrated along with methods to measure epithelial barrier integrity, permeability and transport,&#160;antimicrobial protein secretion, as well as histology. Moreover, intestinal organoid-derived monolayers can be enriched with proliferating stem and transit-amplifying cells as well as with key differentiated epithelial cells. Therefore, they represent a model system that can be tailored to study the effects of compounds on target cells and their mode of action. Although organoid cultures are technically more demanding than cell lines, once established, they can reduce failures in the later stages of drug development as they truly represent in vivo epithelium complexity and interpatient heterogeneity.

Here, we describe the preparation of human organoid-derived intestinal epithelial monolayers for studying intestinal barrier function, permeability, and transport. As organoids represent original epithelial tissue response to external stimuli, these models combine the advantages of expandability of cell lines and the relevance and complexity of primary tissue.

Organoid Kaynaklı Epitel Tek Katmanlı: Bağırsak Bariyer Fonksiyonu için Klinik Olarak İlgili Bir In Vitro Model

In the past, intestinal epithelial model systems were limited to transformed cell lines and primary tissue. These model systems have inherent limitations ...

Culture Methods to Study Apical-Specific Interactions using Intestinal Organoid Models

The lining of the gut epithelium is made up of a simple layer of specialized epithelial cells that expose their apical side to the lumen and respond to external cues. Recent optimization of in vitro culture conditions allows for the re-creation of the intestinal stem cell niche and the development of advanced 3-dimensional (3D) culture systems that recapitulate the cell composition and the organization of the epithelium. Intestinal organoids embedded in an extracellular matrix (ECM) can be maintained for long-term and self-organize to generate a well-defined, polarized epithelium that encompasses an internal lumen and an external exposed basal side. This restrictive nature of the intestinal organoids presents challenges in accessing the apical surface of the epithelium in vitro and limits the investigation of biological mechanisms such as nutrient uptake and host-microbiota/host-pathogen interactions. Here, we describe two methods that facilitate access to the apical side of the organoid epithelium and support the differentiation of specific intestinal cell types. First, we show how ECM removal induces an inversion of the epithelial cell polarity and allows for the generation of apical-out 3D organoids. Second, we describe how to generate 2-dimensional (2D) monolayers from single cell suspensions derived from intestinal organoids, comprised of&#160;mature and differentiated cell types. These techniques provide novel tools to study apical-specific interactions of the epithelium with external cues in vitro and promote the use of organoids as a platform to facilitate precision medicine.

Here we present two protocols that allow the modeling of intestinal apical-specific interactions. Organoid-derived intestinal monolayers and Air-Liquid Interface (ALI) cultures facilitate the generation of well-differentiated epithelia accessible from both luminal and basolateral sides, whereas polarity-inverted intestinal organoids expose their apical side and are amenable to high throughput assays.

Bağırsak Organoid Modellerini Kullanarak Apikal Spesifik Etkileşimleri İncelemek için Kültür Yöntemleri

The lining of the gut epithelium is made up of a simple layer of specialized epithelial cells that expose their apical side to the lumen and respond to ...