Baz eksizyon onarım enzimlerinin kromatin bağlamında DNA lezyonlarını nasıl çıkardığına dair yapısal bilgiler azdır. Bu, insan hastalıklarının etiyolojisinde rol oynayan mekanizmaları anlamamızda önemli bir boşluk oluşturmaktadır. Protokolümüzün temel avantajı, standart laboratuvar ekipmanlarını kullanarak numune hazırlamayı optimize etmiş olmamızdır.
Bu, alandaki diğer biyokimyacıların biyokimyasal çalışmalarını teknik olarak uygulanabilir kriyo-EM çalışmaları ile tamamlamalarını sağlayacaktır. Protokolümüz, öncü transkripsiyon faktörleri de dahil olmak üzere diğer faktörlerin nükleozomu nasıl etkilediğini araştırmak için de kullanılabilir. Bu, yapısal bilginin de sınırlı olduğu bir alandır.
Dondurma koşullarına geçmeden önce numune hazırlamayı optimize etmek, projemizi ileriye taşımanın anahtarıydı ve bu en iyi şekilde substrat tasarımı, bağlama ve çapraz bağlama koşullarında standart biyokimyasal analizlerle yapılır. Başlamak için, NCP'yi ve ilgilenilen DNA onarım faktörünü, spesifik kompleks için en uygun tamponu kullanarak 15 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Daha sonra,% 0.005'lik bir son konsantrasyona glutaraldehit ekleyinİyice karıştırdıktan sonra, oda sıcaklığında 13 dakika boyunca inkübe edin.
Bir molar Tris-CL ile pH 7.5 ile 20 milimolar Tris-CL'nin son konsantrasyonuna kadar söndürün. Daha sonra, yaklaşık 50 mikrolitreye konsantre edin ve tamponu bir tuzdan arındırma sütunu kullanarak dondurma tamponu ile değiştirin. Daha sonra, optik yoğunluk 280 ve 260 nanometredeki absorbansları belirleyin ve optik yoğunluk 280 nanometreye dayanarak mililitre başına 1.3 ila 3 miligrama ulaşmak için gerekirse daha fazla konsantre olun.
Diyaliz düğmesini hazırladıktan sonra, numuneyi içeren düğmeyi, membran aşağı bakacak şekilde bir polietilen glikol yatağının üzerine yerleştirin. Boyut dışlama kromatografisi ile saflaştırmayı gerçekleştirmek için, bir boyut dışlama sütununu 60 mililitre damıtılmış su ile yıkayın ve dengeleyin, ardından dakikada 0,4 mililitre oranında gece boyunca 80 mililitre dondurma tamponu izleyin. Ardından, tepe fraksiyonlarını hemen analiz edin ve histonun infüzyon proteini MBP-PolBeta-APE1'i içeren fraksiyonları konsantre edin.
Aşağıdaki prosedürleri gösteren, NIH'deki cryo-EM çekirdeğinden bir bakalorya sonrası stajyer olan Elizabeth Viverette olacaktır. Daldırma dondurucuyu açtıktan ve nemlendiriciyi 50 mililitre damıtılmış suyla doldurduktan sonra, oda sıcaklığını 22 santigrat dereceye ve nemi% 98'e ayarlayınDaha sonra etan kabını ve sıvı azot kabını ilgili alan tutuculara yerleştirin. Daha sonra, etan kabını etan kapağı dağıtıcısı ile örtün ve azot kabını sıvı azotla doldururken üzerine dikkatlice sıvı azot dökün.
Sıvı azot seviyesi stabilize edildiğinde ve% 100'e ulaştığında ve sıcaklık eksi 180 santigrat dereceye ulaştığında, etan valfini dikkatlice açın ve etan kabını şeffaf kapakta bir kabarcık oluşturana kadar doldurun. Ardından etan dağıtıcısını çıkarın. Kurutma cihazına iki filtre kağıdı yerleştirin ve bunları metal bir halka ile sabitleyin.
Kuruluma gidin ve makalede açıklandığı gibi lekeleme parametrelerini ayarlayın, ardından A-Plunge'u seçin ve Tamam'a tıklayın. Ana ekranda, Forseps Yükle'ye tıklayın ve karbon uygulama tarafı sola bakacak şekilde bir ızgara ile yükleyin. Forsepsleri kalibre edin, katı bir leke sağlamak için Z eksenini ayarlayın. Alt Oda'ya tıklayın ve kompleksin üç mikrolitresini uygulayın.
Ardından, ızgarayı önden lekelemek için döndürecek ve daldırıp donduracak olan Blot A-Plunge'a tıklayın. Aktardıktan sonra, ızgarayı sıvı azot odasındaki ızgara kutusunda saklayın. Dört ızgaranın tümü dondurulduğunda ve ızgara kutusuna yerleştirildiğinde, kapağı tüm ızgaraların kapakla kaplandığı nötr konuma döndürün ve vidayı sıkın.
Numuneleri mikroskopa yüklemeden önce, vitrifiye ızgaraları bir halka üzerine yerleştirin ve buz kontaminasyonunu önlemek için nem kontrollü bir odada sıvı azot altında bir C-klipsi kullanarak sabitleyin. Mikroskopu yüklerken, ızgaraları 12 yuvalı bir kasete yerleştirin. Kaseti bir nanocab kapsülüne karıştırın ve otomatik yükleyiciye yükleyin.
Ardından, ızgarayı kasetten mikroskop aşamasına aktarın. Sahneyi 10 derece sallayarak ve aynı anda görüntülerde minimum düzlemsel kayma gözlenene kadar Z yüksekliğini hareket ettirerek sahneyi ösentrik yüksekliğe ayarlayın. Ösentrik yüksekliğe ulaşıldığında, atlası elde etmek için her montajın 62x büyütmede çekildiği ızgaranın 3'e 3 montaj görüntüsünü alarak görüntülemeye başlayın.
Farklı boyutlarda üç kare seçtikten ve ösantrik yüksekliği aldıktan sonra, 210x büyütmede görüntü. Bir kare görüntülendikten sonra, karelerin kenarından, ortasından ve aralarından birer delik seçin. Ardından, her deliği 2.600x büyütmede görüntüleyin.
Yüksek büyütmeli görüntüyü deliğin ortasından 36.000x büyütmede ve 7,1 saniye pozlama süresinde, 60 karede, 1,18 piksel boyutunda ve üç mikrometre bulanıklaştırmada çekin. Gösterimin temsili görüntülerine bakın. NCP'nin MBP-PolBeta-APE1'e oranını kararlı kompleks oluşturmak için belirlemek için, beş kat MBP-PolBeta-APE1 azı dişi fazlalığı ile NCP'nin tek tek kaydırılmış bir bandını gösteren elektroforetik hareketlilik kayma testleri yapıldı.
Daha küçük hacimde, NCP-PolBeta-APE1 kompleksinin montajı, numunenin aşırı çapraz bağlı olduğunu ve fark edilebilir bireysel kompleksleri olmayan agregalarla sonuçlandığını göstermiştir. Bununla birlikte, NCP'lerde on kat seyreltme, agregasyonun önemli ölçüde azalmasına ve parçacık stabilitesinin iyileştirilmesine neden olmuştur. Hazırlayıcı jel ve boyut dışlama yöntemleri, preparatif jelin önemli miktarda yüksek moleküler ağırlıklı agrega içerdiklerinde NCP'lerin kalitesini arttırdığı ve ardından kompleksin boyut dışlama yoluyla saflaştırılması ile birleştirilebilir.
Sonuçlar, her iki yöntemin de kararlı kompleksler oluşturmak için bağımsız olarak kullanılabileceğini göstermektedir. Ayrıca, her iki ızgaradan toplanan veriler, yaklaşık 3.2-angstrom çözünürlükte neredeyse aynı iki boyutlu sınıfları ve üç boyutlu haritaları göstermektedir. Önce NCP'nin DNA onarım faktörüne optimal bir oranı belirlenmeli, daha sonra kompleksin glutaraldehit ile çapraz bağlanması, donma için gereken konsantrasyondan en az 10 kat daha seyreltik yapılmalıdır.
Kompleksin bir kriyo-EM 3D haritası elde edildikten sonra, DNA onarım faktörünün nasıl bulunduğunu belirlemek ve bu etkileşimler için hangi bölgelerin önemli olduğunu belirlemek için daha fazla yapısal iyileştirmeye ihtiyaç duyulacaktır.
