מידע מבני על האופן שבו אנזימים לתיקון כריתת הבסיס מסירים נגעי DNA בהקשר של כרומטין היה נדיר. דבר זה מהווה פער משמעותי בהבנתנו את המנגנונים המעורבים באטיולוגיה של מחלות אנושיות. היתרון העיקרי של הפרוטוקול שלנו הוא שיש לנו הכנת דגימות אופטימלית באמצעות ציוד מעבדה סטנדרטי.
זה יאפשר לביוכימאים אחרים בתחום להשלים את עבודתם הביוכימית עם מחקרי cryo-EM אפשריים מבחינה טכנית. ניתן להשתמש בפרוטוקול שלנו גם כדי לחקור כיצד גורמים אחרים, כולל גורמי שעתוק חלוציים, מפעילים את הנוקלאוזום. זהו תחום שבו גם המידע המבני הוגבל.
אופטימיזציה של הכנת הדגימה לפני המעבר לתנאי ההקפאה הייתה המפתח לקידום הפרויקט שלנו, וזה נעשה בצורה הטובה ביותר עם בדיקות ביוכימיות סטנדרטיות בתנאי תכנון מצע, קשירה והצלבה. כדי להתחיל, לדגור על NCP ועל גורם תיקון הדנ"א של עניין על קרח במשך 15 דקות באמצעות חיץ אופטימלי עבור קומפלקס ספציפי. לאחר מכן, מוסיפים גלוטראלדהיד לריכוז סופי של 0.005%לאחר ערבוב היטב, דוגרים בטמפרטורת החדר למשך 13 דקות.
יש להרוות עם Tris-CL טוחנת אחת לריכוז סופי של 20 מילימולרית Tris-CL עם pH 7.5. לאחר מכן, רכזים לכ-50 מיקרוליטר והחליפו את החיץ בחיץ הקפאה באמצעות עמודת התפלה. לאחר מכן, לקבוע את הספיגות בצפיפות אופטית 280 ו 260 ננומטר ולהתרכז עוד יותר במידת הצורך כדי להגיע 1.3 עד 3 מיליגרם למיליליטר מבוסס על צפיפות אופטית 280 ננומטר.
לאחר הכנת כפתור הדיאליזה, הניחו את הכפתור המכיל את הדגימה על גבי מצע פוליאתילן גליקול כשהקרום פונה כלפי מטה. כדי לבצע את הטיהור לפי כרומטוגרפיית אי הכללת גודל, יש לשטוף ולאזן עמודת אי הכללת גודל עם 60 מיליליטר מים מזוקקים, ולאחר מכן 80 מיליליטר חיץ הקפאה למשך הלילה בקצב של 0.4 מיליליטר לדקה. לאחר מכן, נתחו מיד את שברי השיא ורכזו את השברים המכילים את חלבון העירוי MBP-PolBeta-APE1 של ההיסטון.
מי שתדגים את ההליכים הבאים תהיה אליזבת ויברט, מתלמדת לאחר הבגרות מליבת cryo-EM כאן ב-NIH. לאחר הפעלת מקפיא המים העמוקים ומילוי מכשיר האדים ב-50 מיליליטר מים מזוקקים, כוונו את טמפרטורת התא ל-22 מעלות צלזיוס ואת הלחות ל-98%, לאחר מכן הניחו את האתאן וכוס החנקן הנוזלי במחזיקי החלל המתאימים. לאחר מכן, כסו את האתאן במתקן מכסה האתאן ושפכו עליה בזהירות חנקן נוזלי תוך מילוי החנקן בחנקן נוזלי.
כאשר רמת החנקן הנוזלי מתייצבת ומגיעה ל -100% והטמפרטורה מגיעה למינוס 180 מעלות צלזיוס, פתחו בזהירות את שסתום האתאן ומלאו את האתאן עד ליצירת בועה על המכסה השקוף. לאחר מכן הסר את מתקן האתאן. הניחו שני ניירות סינון על מכשיר הניקוי והדקו אותם באמצעות טבעת מתכת.
עבור אל ההתקנה והגדר את פרמטרי הכתמים כמתואר בכתב היד, ולאחר מכן בחר A-Plunge ולחץ על אישור. במסך הראשי, לחץ על טען מלקחיים וטען אותם ברשת כאשר צד יישום הפחמן פונה שמאלה. כייל את המלקחיים, כוונן את ציר Z כדי להבטיח כתם מוצק. לחץ על החדר התחתון ולהחיל שלושה מיקרוליטר של המתחם.
לאחר מכן לחץ על Blot A-Plunge, אשר יסובב את הרשת לכתם מהחזית ויצלול להקפיא אותו. לאחר ההעברה, אחסנו את הרשת בתיבת הרשת בתא החנקן הנוזלי. לאחר שכל ארבע הרשתות הוקפאו והונחו בתיבת הרשת, סובבו את המכסה למצב נייטרלי שבו כל הרשתות מכוסות על ידי המכסה והדקו את הבורג.
לפני העמסת הדגימות במיקרוסקופ, הניחו את רשתות הזגוגית על טבעת ואבטחו אותה באמצעות אטב C תחת חנקן נוזלי בחדר מבוקר לחות כדי למנוע זיהום קרח. בעת טעינת המיקרוסקופ, הכנס את הרשתות לקלטת של 12 חריצים. ערבבו את הקלטת לתוך קפסולת ננו-מונית והעמיסו אותה לתוך המעמיס האוטומטי.
לאחר מכן, העבירו את הרשת מהקלטת לשלב המיקרוסקופ. התאימו את הבמה לגובה אאוצנטרי על ידי נדנוד השלב ב-10 מעלות והזזת גובה Z בו זמנית עד להזזה מישורית מינימלית בתמונות. ברגע שמגיעים לגובה האוצנטרי, התחילו בהדמיה על ידי צילום תמונת מונטאז' 3 על 3 של הרשת שבה כל מונטאז' מצולם בהגדלה של פי 62 כדי לקבל את האטלס.
לאחר בחירת שלושה ריבועים בגדלים שונים ולקיחת הגובה האוצנטרי, התמונה בהגדלה של פי 210. לאחר יצירת תמונה של ריבוע, בחרו חור אחד מכל אחד מהשוליים, מהמרכז וביניהם בתוך הריבועים. לאחר מכן, דמיינו כל חור בהגדלה של 2, 600x.
צלם את תמונת ההגדלה הגבוהה ממרכז החור בהגדלה של 36, 000x ובזמן חשיפה של 7.1 שניות, 60 פריימים, גודל של 1.18 פיקסלים ומיקוד של שלושה מיקרומטר. צפו בתמונות מייצגות של ההקרנה. כדי לקבוע את היחס בין NCP ל- MBP-PolBeta-APE1 ליצירת מבחני שינוי ניידות אלקטרופורטיים מורכבים יציבים, שהראו פס מוזז יחיד של NCP עם עודף מולארי פי חמישה של MBP-PolBeta-APE1.
בנפח קטן יותר, הרכבה של קומפלקס NCP-PolBeta-APE1 הראתה כי הדגימה הייתה מוצלבת יתר על המידה והביאה לצברים ללא קומפלקסים בודדים שניתן להבחין בהם. עם זאת, דילול של פי עשרה ב-NCPs הביא לירידה משמעותית בצבירה ולשיפור יציבות החלקיקים. ניתן לשלב את הג'ל המכין ואת שיטות אי הכללת הגודל כאשר ג'ל הכנה משפר את איכות NCPs כאשר הם מכילים כמות משמעותית של אגרגטים בעלי משקל מולקולרי גבוה, ולאחר מכן טיהור של המתחם באמצעות אי הכללת גודל.
התוצאות מראות כי ניתן להשתמש בשתי השיטות באופן עצמאי כדי ליצור קומפלקסים יציבים. יתר על כן, הנתונים שנאספו משתי הרשתות מראים מחלקות דו-ממדיות כמעט זהות ומפות תלת-ממדיות ברזולוציה של כ-3.2 אנגסטרום. יחס אופטימלי של NCP לגורם תיקון DNA צריך להיקבע תחילה, ולאחר מכן cross-linking של המתחם עם glutaraldehyde צריך להתבצע לפחות 10 פעמים יותר מדולל מאשר הריכוז הדרוש להקפאה.
לאחר קבלת מפה תלת-ממדית cryo-EM של המתחם, יהיה צורך בחידוד מבני נוסף כדי לקבוע כיצד נמצא גורם תיקון ה- DNA ולזהות אילו אזורים חשובים לאינטראקציות אלה.
