Bileşenlerin ve işlevselleştirilmiş yüzeylerin basit bir karışımı ile bu protokol, aktin tertibatı tarafından desteklenen hareket olan hücrelerin hayati bir işlevini yeniden yaratır. Kuvvet üretiminin biyokimyasal ve biyofiziksel mekanizmaları, bileşen karışımını ve işlevselleştirilmiş yüzeyin özelliklerini değiştirerek değerlendirilebilir. Bu protokolün temel avantajı, tüm bileşenlerin satın alınabilmesidir, bu nedenle protein saflaştırmada uzmanlık gerekli değildir.
Bu, uzman olmayanların bu sistemi araştırmalarında bir araç olarak kullanmalarını sağlar. Bu protokol, öğrencilere proteinleri manipüle etme ve mikroskop altında kendi hazırladıkları bir biyolojik sistemi gözlemleme konusunda uygulamalı deneyim kazandıran lisans düzeyinde bir öğretim modülü sağlar. Sistem parametrelerini kontrol edebilir ve değiştirebilirler.
Langmuir denklemi gibi fiziksel analiz, yörüngeler üzerinde çalıştırılabilir. Liyofilize proteinleri yeniden askıya alarak başlayın. Tüpün altındaki katı, dört santigrat derecede darbe santrifüjleme protein tozları ile toplayın.
Daha sonra üreticinin talimatlarına göre su ekleyin ve en az 15 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Pipetleme yaparak nazikçe karıştırın. 15 dakika daha buzun üzerinde tutun ve tekrar karıştırın.
Çözeltiyi santrifüjleme ile borunun dibinde toplayın. Remix ve buz üzerinde aliquot. Liyofilizasyon ve donma sırasında oluşan aktin oligomerlerini depolimerize etmek için, ek ATP, DTT ve% 10 etiketli aktin ile çivilenmiş G-tamponunda sekiz kat yeniden askıya alınmış aktin alikotunu seyreltin.
Protein konsantrasyonunu ölçmeden önce en az birkaç gün ila bir hafta boyunca ara sıra karıştırarak buz üzerinde depolimerize olmasına izin verin. Yeniden askıya alınan proteinlerin protein konsantrasyonlarını ölçmek için, önce bir BSA seyreltme serisi hazırlayın. İki mililitre ve 1,5 mililitrelik tüpleri el yazmasında açıklandığı gibi rafa yerleştirerek başlayın.
Üste 15 mililitrelik konik bir tüpü Bradford Reaktifi ile doldurun ve buzun üzerine yerleştirin. 200 mikrolitre Bradford Reaktifi alın ve pipet ucunu ıslatmak için konik tüpe geri atın. Çözelti viskoz olduğundan, çözeltinin kabarcık yapmadan uca tamamen girip çıkmasına izin vermek için yavaşça pipetleyin.
Daha sonra ıslak öncesi ucu kullanarak, raftaki 1,5 mililitrelik tüplerin her birine 200 mikrolitre Bradford Reaktifi pipetin. Ve 15 mililitrelik konik tüpün kalan içeriğini şişeye iade edin. Bir, üç ve beş sıradaki iki mililitrelik tüplere suyu ölçün.
Kalibre edilmiş BSA stok çözeltisini makalede açıklandığı gibi seyrelterek BSA seyreltme serisini hazırlayın. Ardından, her çözeltinin 900 mikrolitresini bir sonraki tüpe aktararak seri seyreltmeler yapın. Boşluk için Bradford Reaktif tüpüne 800 mikrolitre su ekleyin ve zamanlayıcıyı başlatın.
Her BSA standardının 800 mikrolitresini, hazırlanan tüplerde 200 mikrolitre Bradford Reaktifi ile karıştırın. Bradford Reaktifi veya tek kullanımlık bir küvette her standart ile karıştırıldıktan sonra beş dakika içinde emilimi 600 nanometrede okuyun. Elde edilen absorbans değerlerini bilinen BSA konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak grafiklendirin ve 0.99'luk bir R değeri ile doğrusal bir korelasyon elde edin.
2000 mikrolitre su içeren tüplerde, çözünür proteinleri makalede açıklandığı gibi nazikçe seyreltin. Hemen hazırlanan Bradford Reaktifine her çözeltiden 800 mikrolitre ekleyin ve karıştırın. Spektrofotometredeki absorbansları beş dakika içinde okuyun.
Daha önce oluşturulmuş standart eğriyi kullanarak protein konsantrasyonlarını hesaplayın. Boncuk kaplama için, santrifüjü dört santigrat dereceye kadar önceden soğutun. Pipet, 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne 50 mikrolitre Xb tamponu içerir.
4.5 mikrometre çapında boncuk süspansiyonunu vorteks ile iyice karıştırın ve Xb tamponu içeren tüpe dokuz mikrolitre süspansiyon ekleyin. Numuneleri dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 20.000 G'de santrifüj yapın. Boncukları kaplamak için, boncukları rahatsız etmeden süpernatantı dikkatlice çıkarın ve boncuk peletini Xb tamponunda 40 mikrolitre iki mikromolar SpVCA'da hafifçe pipetleyerek yeniden askıya alın.
Şimdi kuru bloktaki boncukları 1000 RPM'de 18 santigrat derecede 20 dakika boyunca çalkalayın. Ardından, kaplanmış boncukları santrifüjleme ile yıkayın. Süpernatantın çıkarılması ve boncukların% 1 BSA ile 50 mikrolitre soğuk Xb'de yeniden askıya alınması.
Boncukları yıkadıktan sonra, kaplanmış boncuk peletini 120 mikrolitre soğuk Xb,% 1 BSA içinde yeniden askıya alın. Bir buzdolabında veya soğuk odada buz üzerinde saklayın. Motilitenin reaksiyon karışımını makalede açıklandığı şekilde hazırlayın.
Reaksiyonu hızla karıştırın ve zamanlayıcıyı başlatın. Tüm hareketlilik reaksiyonu karışımını bir slayt üzerinde tespit edin. 18 milimetreye 18 milimetrelik bir kapak kapağı ile örtün ve küçük bir boya fırçası kullanarak kapak kapağını erimiş VALAP ile kapatın.
Tüm boncuk popülasyonu için ortalama yer değiştirme hızları elde etmek için, tüm slaytı tarayarak faz kontrastı veya floresan hareketsiz görüntüleri zaman içinde kaydedin. Kuyruklu yıldız uzunluğunu elle ölçün ve değerleri günlüğe kaydedin. Kuyruklu yıldız uzunluğunu zamana karşı çizin.
Doğrusal uyumun eğimi ortalama büyüme hızıdır. Tek tek boncuk hızlarını değerlendirmek için faz kontrast mikroskobunda hızlandırılmış filmleri seçin. Boncuk hızına ve gereken çözünürlüğe bağlı olarak, her 1 ila 10 saniyede bir kare çekin.
Boncuk hızlarını ve yörüngelerini elde etmek için herhangi bir görüntü işleme programının izleme aracını kullanın. BSA standartlarını Bradford Reaktifi ile karıştırmak, derecelendirilmiş mavi tonlarına sahip bir çözüm sunar. Absorbans değerleri standart protein konsantrasyonlarına göre çizilir ve doğrusal korelasyon resüspane protein konsantrasyonlarını belirlemek için kullanılır.
SPVCA kodlu boncukların ve kapak proteini içeren hareketlilik ortamının karıştırılması, dakikalar içinde aktin bulutu oluşumuna yol açar. Bulut polarizasyonu yaklaşık beş dakikada ve kuyruklu yıldız üretimi 15 ila 20 dakikada gerçekleşir. Aktin kuyruklu yıldızları saatlerce uzamaya devam eder, ancak tutarlı bir hız korunmaz.
Böylece boncuk hareketliliği bir saat içinde değerlendirilir. Kapak proteini veya jelsolin ile motilite karışımı, kuyruklu yıldızlara benzer şekilde verir. Aktin bulutları, reaksiyonun ilk 20 dakikasında kuyruklu yıldızlar oluşturmak için polarize olur ve kuyruklu yıldızlar zamanla uzar.
Zaman içinde ölçülen kuyruklu yıldız uzunluklarının değerlendirilmesi, yer değiştirme hızını hesaplamak için kullanılır. Kapak aktivitesinin yokluğunda, boncukların etrafında aktin bulutları oluşur, ancak kuyruklu yıldız oluşumu gerçekleşmez. Proteinlerin dikkatli bir şekilde taşınması ve pipetlenmesi, sadece motilitenin karışımını yaparken değil, aynı zamanda Bradford testi ile protein konsantrasyonlarını ölçerken de bu prosedürün başarısı için gereklidir.
Bu protokolle elde edilen kuyruklu yıldız oluşumu ve boncuk yörüngeleri, yumuşak madde ve istatistiksel fizik analizi ve kuvvet ölçümleri ve mikromanipülasyon dahil olmak üzere biyofiziksel deneyler kullanarak hareketin fiziksel mekanizmasını anlamayı sağlar.
