Благодаря простому сочетанию ингредиентов и функционализированных поверхностей этот протокол воссоздает жизненно важную функцию клеток, движение, приводимое в действие актиновой сборкой. Биохимические и биофизические механизмы производства силы могут быть оценены путем изменения смеси ингредиентов и свойств функционализированной поверхности. Основным преимуществом этого протокола является то, что все ингредиенты можно приобрести, поэтому опыт в очистке белка не нужен.
Это позволяет неспециалистам использовать эту систему в качестве инструмента в своих исследованиях. Этот протокол обеспечивает учебный модуль на уровне бакалавриата, предоставляя студентам практический опыт манипулирования белками и наблюдения за самоподготовленной биологической системой под микроскопом. Они могут контролировать и изменять параметры системы.
Физический анализ, такой как уравнение Ленгмюра, может выполняться на траекториях. Начните с повторного использования лиофилизированных белков. Соберите твердое вещество в нижней части трубки путем импульсного центрифугирования белковых порошков при четырех градусах Цельсия.
Затем добавьте воду в соответствии с инструкциями производителя и высиживайте на льду не менее 15 минут. Аккуратно перемешайте путем пипетки. Подержите его на льду еще 15 минут и снова перемешайте.
Соберите раствор в нижней части трубки методом центрифугирования. Ремикс и аликвота на льду. Для деполимеризации актиновых олигомеров, образующихся при лиофилизации и замораживании, разводят аликвоту повторного суспендированного актина в восемь раз в G-буфере с добавлением дополнительных АТФ, ДТТ и 10% меченого актина.
Дайте ему деполимеризоваться на льду со случайным смешиванием в течение, по крайней мере, от нескольких дней до недели, прежде чем измерять концентрацию белка. Чтобы измерить белковые концентрации повторно суспендированных белков, сначала приготовьте серию разбавления BSA. Начните с размещения двух миллилитровых и 1,5-миллилитровых трубок в стойке, как описано в рукописи.
Заполните 15-миллилитровую коническую трубку до верха реагентом Брэдфорда и поместите его на лед. Возьмите 200 микролитров реагента Брэдфорда и выбросьте его обратно в коническую трубку, чтобы намочить наконечник пипетки. Поскольку раствор вязкий, пипетка медленно позволяет раствору входить и выходить из кончика полностью, не образуя пузырьков.
Затем, используя предварительно влажный наконечник, пипетку 200 микролитров реагента Брэдфорда в каждую из 1,5 миллилитровых трубок в стойке. И верните оставшееся содержимое 15-миллилитровой конической трубки в бутылку. Отмерьте воду в двух миллилитровых трубках рядов один, три и пять.
Подготовьте серию разбавления BSA путем разбавления калиброванного раствора BSA, как описано в рукописи. Затем делают последовательные разведения, перекладывая 900 микролитров каждого раствора в следующую пробирку. Добавьте 800 микролитров воды в трубку реагента Брэдфорда для заготовки и запустите таймер.
Смешайте 800 микролитров каждого стандарта BSA с 200 микролитрами реагента Брэдфорда в подготовленных пробирках. В течение пяти минут после смешивания с реагентом Брэдфорда или каждым стандартом в одноразовой кювете затем считывать поглощение на 600 нанометров. Построить график полученных значений поглощения в зависимости от известной концентрации BSA и получить линейную корреляцию со значением R 0,99.
В пробирках, содержащих 2000 микролитров воды, разбавляют резолибилизированные белки осторожно, как описано в рукописи. Сразу же добавьте 800 микролитров каждого раствора к приготовленному реагенту Брэдфорда и перемешайте. Считывание поглощений в спектрофотометре в течение пяти минут.
Рассчитайте концентрации белка, используя ранее построенную стандартную кривую. Для покрытия шариков предварительно охладите центрифугу до четырех градусов Цельсия. Пипетка 50 микролитров буфера Xb в 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку.
Тщательно перемешайте шариковую суспензию диаметром 4,5 микрометра путем вихря и добавьте девять микролитров суспензии в трубку, содержащую буфер Xb. Центрифугируйте образцы при 20 000 G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Чтобы покрыть бусины, аккуратно удалите супернатант, не потревожив бусины, и повторно суспендируйте гранулу бусины в 40 микролитрах двух микромоляльных SpVCA в буфере Xb путем осторожного пипетирования.
Теперь перемешайте бусины в сухом блоке при 1000 об/мин в течение 20 минут при 18 градусах Цельсия. Далее промыть покрытые шарики центрифугированием. Удаление супернатанта и повторное использование шариков в 50 микролитрах холодного Xb с 1% BSA.
После стирки бусин повторно суспендируйте гранулу бусины с покрытием в 120 микролитрах холодного Xb, 1% BSA. Хранить на льду в холодильнике или холодильной камере. Готовят реакционную смесь подвижности, как описано в рукописи.
Быстро перемешайте реакцию и запустите таймер. Нанесите всю реакционную смесь подвижности на слайд. Накройте его крышкой размером 18 на 18 миллиметров и запечатайте крышку расплавленным VALAP с помощью небольшой кисти.
Чтобы получить среднюю скорость смещения для всей популяции бусин, запишите фазовый контраст или флуоресцентные неподвижные изображения с течением времени, сканируя весь слайд. Измеряйте длину кометы вручную и регистрируйте значения. Покажите длину кометы по отношению ко времени.
Наклон линейной посадки представляет собой среднюю скорость роста. Выберите покадровые фильмы в фазово-контрастной микроскопии для оценки скорости отдельных шариков. В зависимости от скорости бусины и требуемого разрешения, делайте кадры каждые 1-10 секунд.
Используйте инструмент отслеживания любой программы обработки изображений для получения скоростей и траекторий бисера. Смешивание стандартов BSA с реагентом Брэдфорда дает раствор с градуированными синими оттенками. Значения абсорбции строятся по сравнению со стандартными концентрациями белка, и линейная корреляция используется для определения концентраций повторного суспендированного белка.
Смешивание шариков, кодированных SPVCA, и подвижной среды, содержащей укупорочный белок, приводит к образованию облаков актина в течение нескольких минут. Поляризация облаков происходит примерно через пять минут, а производство комет — через 15-20 минут. Актиновые кометы продолжают удлиняться в течение многих часов, но постоянная скорость не поддерживается.
Таким образом, подвижность бисера оценивается в течение одного часа. Смесь подвижности с укупорочным белком или гельзолином дает кометам аналогичным образом. Актиновые облака поляризовались, образуя кометы в первые 20 минут реакции, и кометы удлиняются с течением времени.
Оценка длин комет, измеренных с течением времени, используется для расчета скорости перемещения. При отсутствии укупорочной активности вокруг бусин образуются актиновые облака, но образования комет не происходит. Тщательное обращение и пипетирование белков имеет важное значение для успеха этой процедуры не только при составлении смеси подвижности, но и при измерении концентрации белка с помощью анализа Брэдфорда.
Образование комет и траектории шариков, полученные с помощью этого протокола, позволяют понять физический механизм движения с помощью анализа мягкой материи и статистической физики и биофизических экспериментов, включая измерения силы и микроманипуляцию.
