Con un semplice mix di ingredienti e superfici funzionalizzate, questo protocollo ricrea una funzione vitale delle cellule, il movimento alimentato dall'assemblaggio di actina. I meccanismi biochimici e biofisici della produzione di forza possono essere valutati variando il mix di ingredienti e le proprietà della superficie funzionalizzata. Il vantaggio principale di questo protocollo è che tutti gli ingredienti possono essere acquistati, quindi non è necessaria esperienza nella purificazione delle proteine.
Ciò consente ai non specialisti di utilizzare questo sistema come strumento nella loro ricerca. Questo protocollo fornisce un modulo di insegnamento a livello universitario, offrendo agli studenti un'esperienza pratica manipolando le proteine e osservando un sistema biologico auto-preparato al microscopio. Possono controllare e variare i parametri di sistema.
L'analisi fisica, come un'equazione di Langmuir, può essere eseguita su traiettorie. Inizia risospendendo le proteine liofilizzate. Raccogliere il solido sul fondo del tubo centrifugando a impulsi polveri proteiche a quattro gradi Celsius.
Quindi aggiungere acqua secondo le istruzioni del produttore e incubare sul ghiaccio per almeno 15 minuti. Mescolare delicatamente mediante pipettaggio. Tenere sul ghiaccio per altri 15 minuti e mescolare nuovamente.
Raccogliere la soluzione sul fondo del tubo mediante centrifugazione. Remix e aliquota sul ghiaccio. Per depolimerizzare gli oligomeri di actina formati durante la liofilizzazione e il congelamento, diluire un'aliquota di actina risospesa otto volte in G-buffer con ATP, DTT e actina marcata al 10%.
Lasciarlo depolimerizzare sul ghiaccio con una miscelazione occasionale per almeno alcuni giorni o una settimana prima di misurare la concentrazione proteica. Per misurare le concentrazioni proteiche delle proteine risospese, preparare prima una serie di diluizioni BSA. Inizia posizionando due tubi da millilitri e 1,5 millilitri nel rack come descritto nel manoscritto.
Riempire un tubo conico da 15 millilitri verso l'alto con Bradford Reagent e posizionarlo sul ghiaccio. Prelevare 200 microlitri di Bradford Reagent ed espellerlo nuovamente nel tubo conico per bagnare la punta della pipetta. Poiché la soluzione è viscosa, pipettare lentamente per consentire alla soluzione di entrare e uscire completamente dalla punta senza formare bolle.
Quindi, utilizzando la punta pre-bagnata, pipettare 200 microlitri di Bradford Reagent in ciascuno dei tubi da 1,5 millilitri nel rack. E restituire il contenuto rimanente del tubo conico da 15 millilitri alla bottiglia. Misurare l'acqua nei tubi da due millilitri delle file uno, tre e cinque.
Preparare la serie di diluizioni BSA diluendo la soluzione madre BSA calibrata come descritto nel manoscritto. Quindi effettuare diluizioni seriali trasferendo 900 microlitri di ciascuna soluzione nel tubo successivo. Aggiungere 800 microlitri di acqua al tubo del reagente Bradford per il pezzo grezzo e avviare il timer.
Mescolare 800 microlitri di ogni standard BSA con 200 microlitri di Bradford Reagent nelle provette preparate. Entro cinque minuti dopo la miscelazione con il reagente Bradford o ogni standard in una cuvetta usa e getta, leggere l'assorbanza a 600 nanometri. Rappresentare graficamente i valori di assorbanza ottenuti in funzione della concentrazione nota di BSA e ottenere una correlazione lineare con un valore R di 0,99.
Nelle provette contenenti 2000 microlitri di acqua, diluire delicatamente le proteine risolubilizzate come descritto nel manoscritto. Aggiungere immediatamente 800 microlitri di ciascuna soluzione al reagente Bradford preparato e mescolare. Leggere le assorbanze nello spettrofotometro entro cinque minuti.
Calcola le concentrazioni proteiche utilizzando la curva standard precedentemente costruita. Per il rivestimento delle perline, pre-raffreddare la centrifuga a quattro gradi Celsius. Pipettare 50 microlitri di tampone Xb in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri.
Mescolare accuratamente la sospensione del tallone di 4,5 micrometri di diametro mediante vortice e aggiungere nove microlitri della sospensione al tubo contenente tampone Xb. Centrifugare i campioni a 20.000 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Per rivestire le perle, rimuovere con cura il surnatante senza disturbare le perle e risospendere il pellet di perline in 40 microlitri di due micromolari SpVCA in tampone Xb mediante pipettaggio delicato.
Ora agitare le perline nel blocco asciutto a 1000 RPM per 20 minuti a 18 gradi Celsius. Quindi, lavare le perle rivestite centrifugando. Rimuovere il surnatante e risospendere le perle in 50 microlitri di Xb freddo con 1% BSA.
Dopo aver lavato le perle, risospendere il pellet di perline rivestito in 120 microlitri di Xb freddo, 1% BSA. Conservare in frigorifero o in cella frigorifera. Preparare la miscela di reazione alla motilità come descritto nel manoscritto.
Mescolare rapidamente la reazione e avviare il timer. Individua l'intera miscela di reazione alla motilità su un vetrino. Coprirlo con un coprislip di 18 millimetri per 18 millimetri e sigillare il coprislip con VALAP fuso usando un piccolo pennello.
Per ottenere velocità di spostamento medie per un'intera popolazione di perline, registrare il contrasto di fase o le immagini fisse fluorescenti nel tempo scansionando l'intera diapositiva. Misurare la lunghezza della cometa a mano e registrare i valori. Tracciate la lunghezza della cometa rispetto al tempo.
La pendenza dell'adattamento lineare è la velocità di crescita media. Selezionare filmati time lapse al microscopio a contrasto di fase per valutare le singole velocità delle perline. A seconda della velocità del tallone e della risoluzione richiesta, scatta fotogrammi ogni 1-10 secondi.
Utilizza lo strumento di tracciamento di qualsiasi programma di elaborazione delle immagini per ottenere velocità e traiettorie delle perline. La miscelazione degli standard BSA con il reagente Bradford offre una soluzione con tonalità blu graduate. I valori di assorbanza sono tracciati rispetto alle concentrazioni proteiche standard e la correlazione lineare viene utilizzata per determinare le concentrazioni proteiche risospese.
La miscelazione di perline codificate SPVCA e mezzo di motilità contenente proteine di tappatura porta alla formazione di nuvole di actina in pochi minuti. La polarizzazione delle nubi avviene a circa cinque minuti e la produzione di comete a 15-20 minuti. Le comete di actina continuano ad allungarsi per molte ore, ma non viene mantenuta una velocità costante.
Quindi la motilità delle perle viene valutata entro un'ora. La miscela di motilità con proteine di copertura o gelsolina dà comete in modo simile. Le nubi di actina si sono polarizzate per formare comete nei primi 20 minuti di reazione e le comete si allungano nel tempo.
La valutazione delle lunghezze delle comete misurate nel tempo viene utilizzata per calcolare la velocità di spostamento. In assenza di attività di capping, le nubi di actina si formano attorno alle perle, ma la formazione della cometa non si verifica. Un'attenta manipolazione e pipettaggio delle proteine è essenziale per il successo di questa procedura, non solo quando si effettua il mix di motilità, ma anche quando si misurano le concentrazioni proteiche con il test Bradford.
La formazione delle comete e le traiettorie delle perline ottenute con questo protocollo consentono di comprendere il meccanismo fisico del movimento utilizzando l'analisi della materia soffice e la fisica statistica e la sperimentazione biofisica, comprese le misurazioni della forza e la micromanipolazione.
