Com uma mistura simples de ingredientes e superfícies funcionalizadas, este protocolo recria uma função vital das células, o movimento alimentado pela montagem de actina. Os mecanismos bioquímicos e biofísicos de produção de força podem ser avaliados variando a mistura de ingredientes e as propriedades da superfície funcionalizada. A principal vantagem deste protocolo é que todos os ingredientes podem ser comprados, portanto, a experiência em purificação de proteínas não é necessária.
Isso permite que não-especialistas usem esse sistema como uma ferramenta em suas pesquisas. Este protocolo fornece um módulo de ensino de nível de graduação, dando aos alunos experiência prática manipulando proteínas e observando um sistema biológico auto-preparado sob o microscópio. Eles podem controlar e variar os parâmetros do sistema.
A análise física, como uma equação de Langmuir, pode ser executada em trajetórias. Comece ressuspendendo as proteínas liofilizadas. Reúna o sólido no fundo do tubo por pós de proteína de centrifugação de pulso a quatro graus Celsius.
Em seguida, adicione água de acordo com as instruções do fabricante e incube no gelo por pelo menos 15 minutos. Misture suavemente por pipetagem. Mantenha-o no gelo por mais 15 minutos e misture novamente.
Recolher a solução no fundo do tubo por centrifugação. Remix, e alíquota no gelo. Para despolimerizar os oligômeros de actina formados durante a liofilização e congelamento, diluir uma alíquota de actina ressuspensa oito vezes em tampão G cravado com ATP, TDT adicional e actina marcada com 10%.
Deixe despolimerizar no gelo com mistura ocasional por pelo menos alguns dias a uma semana antes de medir a concentração de proteínas. Para medir as concentrações proteicas de proteínas ressuspensas, primeiro prepare uma série de diluição da BSA. Comece colocando tubos de dois mililitros e 1,5 mililitro no rack, conforme descrito no manuscrito.
Encha um tubo cônico de 15 mililitros até o topo com o Bradford Reagent e coloque-o no gelo. Pegue 200 microlitros de reagente Bradford e ejete-o de volta para o tubo cônico para molhar a ponta da pipeta. Como a solução é viscosa, pipete lentamente para permitir que a solução entre e deixe a ponta completamente sem fazer bolhas.
Em seguida, usando a ponta pré-molhada, pipete 200 microlitros de Bradford Reagente em cada um dos tubos de 1,5 mililitro no rack. E devolva o conteúdo restante do tubo cônico de 15 mililitros para a garrafa. Meça a água nos tubos de dois mililitros das fileiras um, três e cinco.
Preparar a série de diluição da BSA diluindo a solução-mãe calibrada da BSA, conforme descrito no manuscrito. Em seguida, faça diluições em série transferindo 900 microlitros de cada solução para o próximo tubo. Adicione 800 microlitros de água ao tubo de reagente Bradford para o espaço em branco e ligue o temporizador.
Misture 800 microlitros de cada padrão BSA com 200 microlitros de reagente Bradford nos tubos preparados. Dentro de cinco minutos após a mistura com o reagente Bradford ou cada padrão em uma cubeta descartável, em seguida, leia a absorvância a 600 nanômetros. Representar graficamente os valores de absorbância obtidos em função da concentração conhecida de BSA e obter uma correlação linear com um valor de R de 0,99.
Nos tubos contendo 2000 microlitros de água, diluir suavemente as proteínas resolubilizadas conforme descrito no manuscrito. Adicione imediatamente 800 microlitros de cada solução ao reagente Bradford preparado e misture. Leia as absorvâncias no espectrofotômetro dentro de cinco minutos.
Calcule as concentrações de proteína usando a curva padrão previamente construída. Para o revestimento de contas, pré-resfrie a centrífuga a quatro graus Celsius. Pipeta 50 microlitros de tampão Xb em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.
Misture bem a suspensão do talão de 4,5 micrômetros de diâmetro por vórtice e adicione nove microlitros da suspensão ao tubo contendo tampão Xb. Centrifugar as amostras a 20 000 G durante 10 minutos a quatro graus Celsius. Para revestir as contas, remova cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar as contas e ressuspenda o pellet de contas em 40 microlitros de duas SpVCA micromolares em buffer Xb por pipetagem suave.
Agora agite as contas no bloco seco a 1000 RPM por 20 minutos a 18 graus Celsius. Em seguida, lave as contas revestidas por centrifugação. Removendo o sobrenadante e ressuspendendo as contas em 50 microlitros de Xb frio com 1%BSA.
Após a lavagem das contas, ressuspenda o pellet de grânulo revestido em 120 microlitros de Xb frio, 1%BSA. Armazenar no gelo em uma geladeira ou câmara fria. Prepare a mistura de reação de motilidade conforme descrito no manuscrito.
Misture rapidamente a reação e inicie o temporizador. Observe toda a mistura de reação de motilidade em uma lâmina. Cubra-o com uma folha de cobertura de 18 milímetros por 18 milímetros e sele a folha de cobertura com VALAP derretido usando um pequeno pincel.
Para obter velocidades médias de deslocamento para toda uma população de contas, registre o contraste de fase ou imagens estáticas fluorescentes ao longo do tempo, digitalizando todo o slide. Meça o comprimento do cometa manualmente e registre os valores. Plote o comprimento do cometa versus o tempo.
A inclinação do ajuste linear é a velocidade média de crescimento. Selecione filmes de lapso de tempo em microscopia de contraste de fase para avaliar as velocidades individuais do talão. Dependendo da velocidade do talão e da resolução necessária, leve quadros a cada 1 a 10 segundos.
Use a ferramenta de rastreamento de qualquer programa de processamento de imagem para obter velocidades e trajetórias de contas. A mistura de padrões BSA com o Bradford Reagent fornece uma solução com tons azuis graduados. Os valores de absorbância são plotados versus as concentrações de proteína padrão e a correlação linear é usada para determinar as concentrações de proteína ressuspensas.
A mistura de contas codificadas por SPVCA e meio de motilidade contendo proteína de tamponamento leva à formação de nuvens de actina em poucos minutos. A polarização das nuvens ocorre em aproximadamente cinco minutos e a produção de cometas em 15 a 20 minutos. Os cometas de actina continuam a se alongar por muitas horas, mas uma velocidade consistente não é mantida.
Assim, a motilidade do talão é avaliada dentro de uma hora. A mistura de motilidade com proteína de encapsulamento ou gelsolina dá cometas de maneira semelhante. Nuvens de actina polarizadas para formar cometas nos primeiros 20 minutos de reação e cometas se alongam ao longo do tempo.
A avaliação dos comprimentos dos cometas medidos ao longo do tempo é usada para calcular a velocidade de deslocamento. Na ausência de atividade de cobertura, as nuvens de actina se formam em torno de contas, mas a formação de cometas não ocorre. O manuseio cuidadoso e a pipetagem das proteínas são essenciais para o sucesso deste procedimento, não apenas ao fazer a mistura de motilidade, mas também ao medir as concentrações de proteínas com o ensaio de Bradford.
A formação de cometas e as trajetórias de contas obtidas com este protocolo permitem a compreensão do mecanismo físico de movimento usando matéria mole e análise física estatística e experimentação biofísica, incluindo medições de força e micromanipulação.
