成分と機能化された表面の単純な組み合わせで、このプロトコルは細胞の重要な機能、アクチンアセンブリによって駆動される動きを再現します。力生成の生化学的および生物物理学的メカニズムは、成分ミックスと機能化された表面の特性を変えることによって評価することができます。このプロトコルの主な利点は、すべての成分を購入できるため、タンパク質精製の専門知識が不要になることです。
これにより、専門家以外の人がこのシステムを研究のツールとして使用できます。このプロトコルは、学部レベルの教育モジュールを提供し、タンパク質の操作と顕微鏡下での自己準備された生物学的システムの観察を学生に実践的な経験を提供します。システムパラメータを制御および変更できます。
ラングミュア方程式などの物理解析は、軌道上で実行できます。凍結乾燥タンパク質を再懸濁することから始めます。タンパク質粉末を摂氏4度でパルス遠心分離することにより、チューブの底に固体を集めます。
次に、製造元の指示に従って水を加え、氷上で少なくとも15分間インキュベートします。ピペッティングで穏やかに混ぜます。さらに15分間氷の上に置き、もう一度混ぜます。
遠心分離によってチューブの底にある溶液を集める。リミックスし、氷上でアリコートします。凍結乾燥および凍結中に形成されるアクチンオリゴマーを解重合するには、再懸濁したアクチンのアリコートをGバッファーで8倍希釈し、追加のATP、DTT、および10%標識アクチンを添加します。
タンパク質濃度を測定する前に、少なくとも数日から1週間、時折混合しながら氷上で解重合させます。再懸濁タンパク質のタンパク質濃度を測定するには、まずBSA希釈シリーズを調製します。原稿に記載されているように、2ミリリットルと1.5ミリリットルのチューブをラックに入れることから始めます。
15ミリリットルの円錐形のチューブをブラッドフォード試薬で上部まで満たし、氷の上に置きます。200マイクロリットルのブラッドフォード試薬を取り、それを円錐形のチューブに戻し、ピペットチップを濡らします。溶液は粘性があるので、ゆっくりとピペットで溶液が泡を立てずにチップに完全に出入りできるようにします。
次に、プレウェットチップを使用して、200マイクロリットルのブラッドフォード試薬をラック内の1.5ミリリットルのチューブのそれぞれにピペットで入れます。そして、15ミリリットルの円錐管の残りの内容物をボトルに戻します。列1、3、および5の2ミリリットルのチューブに水を計量します。
原稿に記載されているように、校正されたBSAストック溶液を希釈することにより、BSA希釈シリーズを調製します。次に、各溶液900マイクロリットルを次のチューブに移して連続希釈します。ブランク用のブラッドフォード試薬チューブに800マイクロリットルの水を加え、タイマーを開始します。
準備したチューブで、各BSA標準800マイクロリットルをブラッドフォード試薬200マイクロリットルと混合します。使い捨てキュベット中のブラッドフォード試薬または各標準物質と混合してから5分以内に、600ナノメートルの吸光度を読み取ります。得られた吸光度値を既知のBSA濃度の関数としてグラフ化し、R値0.99との線形相関を得る。
2000マイクロリットルの水を含むチューブで、原稿に記載されているように再可溶化タンパク質を穏やかに希釈します。調製したブラッドフォード試薬に直ちに各溶液800マイクロリットルを加えて混合する。5分以内に分光光度計の吸光度を読み取ります。
以前に作成した検量線を使用してタンパク質濃度を計算します。ビーズコーティングの場合は、遠心分離機を摂氏4度に事前に冷却します。50マイクロリットルのXbバッファーを1.5ミリリットルの微量遠心チューブにピペットで入れます。
直径4.5マイクロメートルのビーズ懸濁液をボルテックスで十分に混合し、Xbバッファーを含むチューブに9マイクロリットルの懸濁液を加えます。サンプルを 20, 000 G で摂氏 4 度で 10 分間遠心分離します。ビーズをコーティングするには、ビーズを乱さずに上清を注意深く取り除き、穏やかにピペッティングしてビーズペレットをXbバッファー中の40マイクロリットルの2マイクロモルSpVCAに再懸濁します。
次に、ドライブロック内のビーズを摂氏18度で20分間1000 RPMで攪拌します。次に、コーティングしたビーズを遠心分離により洗浄する。上清を除去し、ビーズを1%BSAを含む50マイクロリットルの冷たいXbに再懸濁した。
ビーズを洗浄した後、コーティングされたビーズペレットを120マイクロリットルの冷Xb、1%BSAに再懸濁する。冷蔵庫または冷蔵室で氷上に保管してください。原稿に記載されているように運動性反応混合物を調製する。
反応をすばやく混合し、タイマーを開始します。運動性反応混合物全体をスライド上に見つけます。18ミリメートル×18ミリメートルのカバーガラスで覆い、小さな絵筆を使用して溶かしたVALAPでカバーガラスを密封します。
ビーズ全体の平均変位速度を得るには、スライド全体をスキャンして、位相差または蛍光静止画を経時的に記録します。彗星の長さを手で測定し、値を記録します。彗星の長さと時間をプロットします。
線形フィットの傾きは平均成長速度です。位相差顕微鏡でタイムラプス動画を選択して、個々のビーズ速度を評価します。ビードの速度と必要な解像度に応じて、1〜10秒ごとにフレームを取ります。
画像処理プログラムのトラッキングツールを使用して、ビーズの速度と軌道を取得します。BSA標準物質とブラッドフォード試薬を混合すると、段階的な青色の色合いの溶液が得られます。吸光度値を標準タンパク質濃度に対してプロットし、線形相関を使用して再懸濁タンパク質濃度を決定します。
SPVCAコード化されたビーズとキャッピングタンパク質を含む運動性培地を混合すると、数分以内にアクチンクラウドが形成されます。雲の偏極は約5分で起こり、彗星の生成は15〜20分で起こります。アクチン彗星は何時間も伸び続けますが、一定の速度は維持されません。
したがって、ビーズの運動性は1時間以内に評価されます。キャッピングタンパク質またはゲルソリンのいずれかとの運動性ミックスは、同様の方法で彗星を与える。アクチン雲は反応の最初の20分で偏光して彗星を形成し、彗星は時間とともに伸びます。
経時的に測定された彗星の長さの評価は、変位速度の計算に使用されます。キャッピング活性がない場合、アクチン雲はビーズの周りに形成されますが、彗星の形成は起こりません。この手順を成功させるには、運動性ミックスを作るときだけでなく、Bradfordアッセイでタンパク質濃度を測定するときにも、タンパク質の慎重な取り扱いとピペッティングが不可欠です。
このプロトコルで得られた彗星の形成とビーズの軌道により、ソフトマターと統計物理学の解析、および力の測定やマイクロマニピュレーションなどの生物物理学的実験を使用して、運動の物理的メカニズムを理解することができます。
