Bu araştırma NIH 4R00HL094708-03 tarafından desteklenen, AİG&#39;nin Araştırma İşler Komitesi Yeni Fakülte Ödülü, ve Wisconsin Medical College (RLG) de Kern vakıf (başlangıç ​​fonları); Hong Kong Tema tabanlı Araştırma Şema T13-706 / 11 (KRB) Araştırma Hibeler Konseyi; U01 HL099776, CIRM TR3-05556, CIRM DR2A-05394, ve AHA Araştırmacı Ödülü (JCW) Kuruldu; AHA Doktora Sonrası Araştırma Bursu 12POST12050254 (PWB). Biz veri toplama ve yazının dikkatli inceleme ile yardım için Wisconsin Kan Araştırma Enstitüsü Sitometrisi Çekirdeği Umut Campbell teşekkür ederim.

1. Çözüm ve Medya Hazırlık <ol><li> HESC Nitelikli Matrix Kaplama Stok Çözüm <ol><li> Yavaşça bir gece boyunca 4 ° C&#39;de HESC buz üzerinde nitelikli matrisi (5 mi) eritin. 1.5 ml steril, önceden soğutulmuş mikrosantrifüj tüpler içine hacimde dağıtın ve hemen -20 ° C&#39;de saklayın. Not: tüm bölenin hacmi çok dayanmaktadır ve tipik haliyle 270-350 ul aralığında değişir. İmalatçı Adım 2.1 &#39;de tarif edildiği gibi 25 ml seyrelmesi üzerine 1x konsantrasyon elde etmek için gerekli olan tüm bölenin hacmi ile ilgili bilgi sağlar. </li></ol></li><li> hPSC Medya Hazır Çözümler <ol><li> Aksi belirtilmedikçe, bir seyreltici olarak ultra saf su kullanın. 0.22 mikron filtre kullanılarak tüm bileşenleri sterilize. 4 ° C&#39;de toplu çözeltiler gibi, aşağıdaki muhafaza edin: sodyum bikarbonat (75 mg / ml); sitrik asit (10 mM, pH = 3). </li><li> 0.2 mikron şırınga filtre kullanarak tüm bileşenleri sterilize ve -20 ° C&#39;de hacimde olarak her saklamak: Rho kinaz (ROCK) inhibitörü Y-27632 (10DPBS mM, 100 ul tümbölen); L-askorbik asit 2-fosfat (64 mg / ml 500 ul tümbölen); sodyum selenit (70 ug / ml, 100 ul tümbölen); transferin (50 mg / ml 107 ul tümbölen); fibroblast büyüme faktörü 2 (FGF2 200 ng / DPBS ul, 250 ul tümbölen); büyüme faktörü beta 1 transforme (soğuk 10 mM sitrik asit içinde TGFβ1, 100 ng / ml, 10 ul tümbölen). </li></ol></li><li> hPSC Medya E8 Çözüm Kompozisyon <ol><li> , L-askorbik asit 2-fosfat (500 ul; nihai; (: 500 ml L-glutamin ve HEPES), sodyum bikarbonat (543 mg / ml 3.62 ml nihai), DMEM / F12: Aşama 1.2 &#39;de elde alikot ile ortam hazırlayın : 64 ug / ml), sodyum selenit (100 ul, nihai 140 ng / ml), transferin (107 ul; nihai: 10.7 ug / ml), insülin (1 mi; son 20 ug / ml), FGF2 (250 ul, nihai 100 ng / ml), TGFβ1 (10 ul, nihai: 2 ng / ml). </li><li> Kadar 2 hafta boyunca 4 ° C&#39;de tüm bileşenleri, filtre sterilize ve mağaza birleştirin. </li></ol></li><li> KAYA inhibitörü ile hPSC Ortam E8 <ol><li> Yukarıda anlatıldığı gibi hazırlanmış E8 ortam, 12 ml, 15 ul ROCK inhibitörü ekleyin ve iyice karıştırın. Nihai konsantrasyon adım 3.7 / ortam hücreleri ilave edildikten sonra 10 uM olduğundan emin olun. </li></ol></li><li> Wnt Modülatörlü stok Çözümleri <ol><li> -20 ° C&#39;de aşağıdaki alikotları saklayın. CHIR 99021 (6-[[2-[[4-(2,4-Dichlorophenyl)-5-(5​-methyl-1 H -imidazol-2-yl)-2-pyrimidinyl]amino]ethy​l]amino]-3-pyridinecarbonitrile; DMSO içinde 10 mM, 15 ul tümbölen). IWR-1 (4-(1,3,3a, 4,7,7a-Heksahidro-1,3-diokso-4,7-metano-2H-izoindol-2-il)-N-8-kinolinil-benzamid; DMSO içinde 10 mM 6 ul tümbölen). </li></ol></li><li> Farklılaşma Medya <ol><li> % 2 B27 eksi insülin takviyesi ile (L-glutamin ile) RPMI 1640 farklılaşma medya # 1 hazırlayın. </li><li> % 2 B27 artı insülin takviyesi ve% 2 FBS ile (L-glutamin ile) RPMI 1640 ortamı ile farklılaşma 2. hazırlayın. </li></ol></li><li> Hücre Yıkama Çözeltisi fveya Hücre Kültürü <ol><li> Kalsiyum ve magnezyum içermeyen Dulbecco fosfat tamponlu salin (DPBS) içinde kullanın. </li></ol></li><li> Akış Sitometrinin Hücre Yıkama Çözeltisi <ol><li> % 1 FBS (kalsiyum ve magnezyum içermeyen PBS) fosfat tamponlu tuzlu su kullanın. 4 ° C&#39;de saklayın. </li></ol></li><li> Akış Sitometrinin Hücre Bakım Çözüm <ol><li> % 5 FBS (kalsiyum ve magnezyum içermeyen HBSS) Hank Dengeli Tuz Çözeltisi kullanın. 4 ° C&#39;de saklayın. </li></ol></li><li> Akış Sitometrinin için tespit Çözümler <ol><li> TNNI3 ve Irx4 antikorlar için sabitleme çözeltisi olarak Cytofix tampon kullanabilir. </li><li> TNNT2 ve MLC2a antikorlar için sabitleme çözeltisi olarak 1 x PBS içinde% 4 paraformaldehid (taze olun) kullanınız. </li><li> MLC2v antikor için sabitleme çözeltisi olarak% 70 metanol /% 30 aseton kullanılabilir. </li><li> 4 ° C&#39;de tüm çözümleri saklayın. </li></ol></li><li> Akış Sitometrinin için Permeabilizasyon Çözümler <ol><li> Geçirgenleştirme çözeltisi f olarak Phosflow Perm Tampon KULLANILMASIveya TNNI3 ve Irx4 antikorlar yer alır. Oda sıcaklığında (25 ° C) saklayınız. </li><li> TNNT2, MLC2v ve MLC2a antikorlar için özellikle geçirgenleştirme çözeltisi olarak 1 x PBS içinde% 0.2 Triton X-100 kullanarak. 4 ° C&#39;de saklayın. </li></ol></li><li> Bloklama çözeltisini <ol><li> 1x PBS içinde% 10 keçi serumu kullanın. Taze yapmak ve kullanılıncaya kadar 4 ° C&#39;de saklayın. </li></ol></li></ol> 2. Plakası Kaplama <ol><li> Yavaşça, 30 dakika boyunca 4 ° C&#39;de HESC kalifiye matris 1 kısım Çözülme soğutulmuş DMEM / F12, 25 ml eklenir ve hemen 6 oyuklu tabaklar önce steril doku kültürü kaputu iyice karıştırın. </li><li> Steril doku kültürü başlık altında 6-çukurlu levha başına 1 ml ilave edilir (HESC kalifiye matrisin 1 kısım kat dört 6-yuvalı plakalar için yeterlidir). </li><li> HESC kalifiye matris başlık altında oda sıcaklığında 30 dakika boyunca ayarlamak için olanak sağlar. Aşırı HESC nitelikli matrisi aspire ve her iyi ROCK inhibitörü ile E8 medyanın 2 ml ekleyin. Kullanım plakaları hemen varsa veya desIRED, 4 ° C&#39;de saklama hemen sonra en fazla 1 hafta kaplama ve kullanılmadan önce 30 dakika süre ile oda sıcaklığına kadar dengeye C. </li></ol> 3. Pasajlanması ve Tek tabakalı Kültür ayrım hPSCs Bakım <ol><li> 6-yuvalı plakalar içinde tek tabakalı bir kültür olarak muhafaza hPSCs ve steril doku kültürü başlık altında tüm adımları gerçekleştirmek. </li><li> HPSC iyi kurulmuş hatları (&gt; p20) kullanın ve bir sinir, epithelial- veya fibroblast-benzeri morfolojisi olan hücrelerin varlığı olmadan homojen bir morfoloji. Kuyu başına 0,75 x 10 6 tohumlandıklarında hücreleri% 75 izdiham her üç gün sağlam çoğalırlar ve ortalama, geçit üzerinde emin olun. </li><li> Tek hücre düzeyinde ayrışma ile Passage hPSCs en az 5x önce maksimum farklılaşma verimliliği sağlamak için farklılaşma başlatın. Geçit hPSCs için, aspirat E8 ortam ve 1x DPBS (oda sıcaklığına kadar önceden ısıtılmış) 4 ml ile iki kez yıkama hücreleri. Hücre kopmakta 1 ml ekleyinment her bir oyuğa çözeltisi (oda sıcaklığına kadar önceden ısıtılmış) ve hücre sınırları boyunca-up başlayana kadar, 3-7 dakika için de rahatsız bırakın. </li><li> Hücreleri çıkarmak ve DMEM / F12 ortam 1 ml içeren 15 ml&#39;lik konik bir tüp içine transfer etmek için bir ampul ile pamuk takılı cam pipet kullanın (ki bu hücre ayırma çözeltisi inaktive etmek için). </li><li> Hücre çözeltisi, 10 ul bir kısım çıkarın ve bir mikrosantrifüj tüpü içinde, tripan mavisi 10 ul ile karıştırılır. Hücrelerin geri kalanı, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 130 x g&#39;de santrifüj ile toplanır sırasında hücreler (örneğin, otomatik ya da elle hemositometre) sayılır. Bu protokolü kullanarak,% 70-80 canlılığı otomatik Hemasitometre kullanarak ve toplam hücre sayımı baz tüm cep numaraları, ileriye bekliyoruz. </li><li> Ortam aspire 500 ul, 0.75 x 10 6 hücre nihai bir konsantrasyona kadar DMEM / F12 hücre pelletini ve. </li><li> 6 oyuklu plakanın her bir oyuğuna, hücre süspansiyonu 500 ul her bir göze burada contaiROCK inhibitörü ile ns 2 ml E8 medya, adım 2.3 hazırladı. Tezgahı üzerinde plaka bırakarak, yavaşça arasında genel bir önden arkaya ve yandan yana bir hareket homojen bir şekilde dağılmalıdır hücre hareket eder. % 5 CO 2, 37 ° C&#39;ye kadar inkübatör hücreleri dönün. </li><li> Pasajlayarak 24 saat sonra başlayan, günlük ROCK inhibitörü olmadan 2 ml / da E8 kullanarak ortamı değiştirin. Farklılaşma başlatmak için önce% 100 izdiham ulaşmak için ekim yoğunluğunu optimize eder. 0.75 x 10 6 hücre Tohum / de dört gün farklılaşma başlar, ama gerektiğinde her hücre hattı için optimize önce. </li></ol> Wnt yola¤ Seçici Modülasyon tarafından hPSCs 4. kardiyomiyosit İndüksiyon <ol><li> Gün 0-7 süresince günlük (2 ml / da) medya Refresh, ve 8. günde sonra her gün. </li><li> Gün 0, farklılaşma medya # 1 ile E8 medya değiştirerek farklılaşma süreci başlar. Her iyi 1.2 ul CHIR (6 mcM final) ekleyin. 1. günde tekrarlayın. </li><li> Günlerde 2-3, taze ayırıcı ile değiştirinbarındırdığı medya # 1. </li><li> 4. günde, taze farklılaşma medya # 1 ile değiştirin. Her bir oyuğa, 1 ul IWR-1 (nihai 5 uM) eklenir. Günde 5 tekrarlayın. </li><li> Günlerde 6-7, taze farklılaşma medya # 1 ile değiştirin. </li><li> 8. günde, taze ortam farklılaşma # 2 ile değiştirin. </li><li> Farklılaşma medya # 2 kültürünün arzu edilen süre boyunca her gün değiştirin devam edin. </li><li> İstenirse, 3,3-3,6 özetlenen adımları izleyerek, ama farklılaşma medya # 2 ile medyayı ikame hücre dekolmanı çözüm kullanarak geçit kardiyomiyositler. Pasajlayarak sırasında, ~ 3-10 hücrelerin küçük kümeler halinde kardiyomiyositlerin ayırmak. Iyi kullanarak HESC nitelikli matris kaplı çukurlara ve farklılaşma medya # 2 başına ~ 6 x 10 5 hücre Tohum. </li></ol> Akış Sitometrinin için Hücrelerin 5. Koleksiyonu <ol><li> Laboratuar tezgahının (steril değildir) 5-9 adımları kalan tüm yönlerini gerçekleştirir. </li><li> Aspire büyüme ortamı ve 1x PBS ile iki kez hücreleri yıkayın.Hücre sınırları boyunca-up başlayana kadar (oda sıcaklığına kadar önceden ısıtılmış), her bir hücre ayırma çözeltisi 1 ml de ilave edin ve 3-7 dakika boyunca rahatsız edilmeden bırakın. Hücreleri çıkarmak ve buz üzerinde bir 15 ml konik tüp içine aktarmak için ampul ile bir pamuk takılı borosilikat cam atılabilir 9 &quot;pipet kullanın. </li><li> Protokol kalanı boyunca buz üzerinde hücreleri korumak ve 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 200 x g&#39;de santrüfüj yapar. </li><li> Santrifüj ve aspirasyon çözeltisi hücreler toplanır. Hücre kümeleri sağlamak için tekrar tekrar toz haline getirilir ve 10 ml&#39;lik bir pipet kullanılarak serolojik 10 ml hücre yıkama çözeltisi içinde süspanse hücreler tek hücreler içine dağıtılır. Hücreler santrifüjleme ile toplanmış geri kalan ise adım 3.5 olarak hücre sayımı. </li><li> Hücre yıkama çözeltisi özen göstererek yeniden süspanse hücreler tamamen hücre pelet ve kısım yuvarlak dipli tüp başına 1 x 10 6 hücre parçalamak için. Santrifüj ve aspirasyon çözeltisi hücreler toplanır. </li></ol> 6. Tespit veHücre içi antijen boyanması için Hücrelerin geçirgenliği <ol><li> Hücre pelletine 100 ul sabitleme çözeltisi ekleyin. Çözeltisi damla damla sürekli Yumuşak bir girdaplamadan ile ve daha sonra 15 dakika boyunca buz üzerinde bekletilir ekleyin. </li><li> 3 ml hücre yıkama solüsyonu ekleyin. Santrifüj ve aspirasyon çözeltisi hücreler toplanır. </li><li> Hücre pelletine 100 ul permeabilizasyon solüsyonu ekleyin. Çözeltisi damla damla, daha sonra 30 dakika boyunca buz üzerinde bekletilir sürekli Yumuşak bir girdaplamadan ile ekleyin. Tablo 1 &#39;de her bir antikor için belirtildiği gibi tespit ve geçirgenliği arttıran koşullar kullanın. </li><li> 3 ml hücre yıkama solüsyonu ekleyin. Santrifüj ve aspirasyon çözeltisi hücreler toplanır. Geçirgenleştirmeden sonra iki yıkama arasında bir toplam için tekrarlayın. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td rowspan="2"> Birincil antikoru (klon) </td><td rowspan="2"> İmmunogen / Epitop Tanınan </td><td rowspan="2"> Kontrol Istotype </td><td colspan= &quot;2&quot;&gt; 100 ul içinde 1 x 10 6 hücre başına birincil antikor miktarı </td><td rowspan="2"> Sabitleme Çözüm </td><td rowspan="2"> Geçirgenliği arttıran çözeltiyi </td><td rowspan="2"> İkincil antikor </td><td rowspan="2"> 100 ul ikincil antikor miktarı / 1 x 10 6 hücre </td></tr><tr><td> Pozitif yüzde ölçümleri için </td><td> Antijen kantitasyonu için </td></tr><tr><td> TNNI3 (284 (19C7) </td><td> ISASRKLQL (insan) </td><td> Fare IgG2b </td><td> 1,0 mikrogram </td><td> 3.0 ug </td><td> BD Cytofix </td><td> BD Phosflow perma III </td><td> Keçi anti-fare IgG2b-Alexa488 </td><td> 600 ng </td></tr><tr><td> TNNT2 (1C11) </td><td> Tam boy saflaştırılmış doğal insan troponin T proteini. </td><td> Fare IgG1 </td><td> 1,0 mikrogram </td><td> 2.0 ug </td><td> % 4 PFA% 1 PBS </td><td> % 1 PBS içinde% 0.2 Triton X-100 </td><td> Keçi anti-fare IgG1 - Alexa 488 </td><td> 600 ng </td></tr><tr><td> MLC2v (330G5) </td><td> FDPEGKG </td><td> Fare IgG2a </td><td> 2.0 ug </td><td> 3.0 ug </td><td> % 70 metanol /% 30 aseton </td><td> % 1 PBS içinde% 0.2 Triton X-100 </td><td> Keçi anti-fare IgG2a - Alexa 647 </td><td> 600 ng </td></tr><tr><td> MLC2a (4E7) </td><td> E. üretilmiş, insana ait MYL7 tam uzunlukta insan yeniden birleştirici proteinin coli </td><td> Fare IgG1 </td><td> 0.5 ug </td><td> 3.0 ug </td><td> % 1 PBS içinde% 4 PFA </td><td> % 1 PBS içinde% 0.2 Triton X-100 </td><td> Keçi anti-fare IgG1 - Alexa 488 </td><td> 600 ng </td></tr><tr><td> Irx4 </td><td> LQEHRKNP YPTKGEKI MLAIITKM TLTQVST </td><td> Tavşan IgG </td><td> 0.5 ug </td><td> 0.5 ug </td><td> BD Cytofix </td><td> BD Phosflow perma III </td><td> Keçi anti-raIgG PE BBIT </td><td> 600 ng </td></tr></tbody></table> Her birincil ve ikincil antikor için optimize konsantrasyonları ve fiksasyon ve permeabilizasyon koşulları akışı için kullanılan (monoklonal varsa) Table 1. Antikor konsantrasyonlar. Listelenen birincil antikor olan, klon sitometri analizleri. Antikor stok konsantrasyonları aynı klonun sağlayıcıları arasında değişebilir olarak, son sabit bir tahlil hacmi içinde 1 x 10 6 hücre başına her antikor konsantrasyonu, seyreltme yerine sağlanmıştır. İmmünojen, antikorun üretilmesi için kullanılan, ya da imalatçı tarafından temin edildiği gibi epitop, antikor tarafından tanınan, listede ancak deneysel burada doğrulanmadı. 7. Antikor Boyama <ol><li> Her deney için, bir sabitleme / permeabilizasyon durumuna göre kontrol ve boyanmamış kullanılan her bir primer antikor için uygun izotip kontrolü içerir. (Negatif kontroller gibi non-kardiyomyosit hücre türlerini içerirörneğin, pluripotent kök hücreleri ya da fibroblastları). Primer antikor tekabül eden aynı konsantrasyonda izotip kontrolleri kullanarak (Tablo 1 e bakınız). </li><li> Hücreleri parçalamak için P200 pipet kullanarak çözümü engelleme 100 ul süspanse hücreler. Hafif sallama ile 25 dakika boyunca buz üzerinde bekletilir örnekleri. </li><li> Engelleme çözümü çıkarmadan,. Birincil antikor veya Tablo 1&#39;de kurallarımıza göre izotop kontrolü eklemek hafif hafif sallanarak buz üzerinde 45 dakika inkübe edin. </li><li> 3 ml hücre yıkama solüsyonu ekleyin. Santrifüj ve aspirasyon çözeltisi hücreler toplanır. Primer Antikor etiketleme işleminden sonra, iki yıkama toplam tekrarlayın. </li><li> Bir florofor ile konjüge edilmiş birincil antikor kullanıldığında, 8.1 &#39;e geçin. Bir konjüge edilmemiş birincil antikor (örneğin, burada tarif edilen tüm belirteçleri için olduğu gibi) kullanıldığında, aşağıdaki gibi bir florofor konjuge edilmiş ikincil antikor ile etiketlenmesi. </li><li> DISA bir P200 pipet kullanarak çözümü engelleme 100 ul süspanse hücrelerggregate hücreleri. </li><li> . Tablo 1&#39;de ilkelerine uygun olarak, ikincil antikor ekleyin hafif sallama ile buz üzerinde 30 dakika inkübe edin. </li><li> 3 ml hücre yıkama solüsyonu ekleyin. Santrifüj ve aspirasyon çözeltisi hücreler toplanır. İkincil antikor etiketleme sonra iki yıkama arasında bir toplam için tekrarlayın. </li></ol> Akış Sitometrinin için Hücrelerin 8. hazırlanması <ol><li> Hücreleri parçalamak için P1000 pipet kullanarak 400 ul hücre bakım çözeltisi içinde süspanse hücreler. </li><li> 50 ul hücre bakım çözeltisi ile ön-ıslatma ile bir yuvarlak tabanlı tüp üzerindeki bir hücre süzgecinden kapağı hazırlayın. Buz üzerinde tüp ayarlayın. Sitometresi akışını tıkamasını hücre agrega önlemek için hücre süzgecinden kapağı kullanın. </li><li> Süzgeç kapağı hücre ve hücre süspansiyon yerçekimi boşalmasını sağlamak için hücre çözümü aktarın. Hücreler tüp içine toplandı ve mümkün olduğunca hızlı bir şekilde tekrar buz üzerinde bekletilir, böylece gerekli tezgah üstüne hafifçe tüpün alt dokunun. 250 ul hücre bakım böylece ile durulayın süzgeçdökülmesinden hücrelerinin maksimal iyileşme sağlamak için. </li><li> Hücreleri buz üzerinde muhafaza etmek ve akış sitometrisi ile analiz edilene kadar ışıktan koruyunuz. </li></ol> 9. Sitometrisi Analizi Ayrıntılı kazanım ayarlarını araçların arasında değişmektedir. Optimal veri toplama dikkate temel parametreler aşağıda açıklanmıştır. <ol><li> Optimal akışı istikrar için, meme boyutu, hücrenin çapı analiz edilen 5-6x aşmasını sağlamak. NOT: Bu aletler arasında değişir ama analizörleri ve hücre sıralama için uygun meme boyutunu seçerek hem önemli bir husustur olabilir. Gün 10 kardiyomiyositlerin ortalama çapı (8-14 mikron arasında değişen) 11 mikron olduğu; Bu şekilde, bir analiz standart bir 150 um numune enjeksiyon borusu iyi çalışır. </li><li> Hemen önce veri analizi için, kısa bir süre için her bir tüp vorteks hücre agregatlarının dağıtılması. </li><li> Ileri Optimize ve her hücre tipi için yan dağılım gerilim ayarları dayalıilgilenilen popülasyonları ölçektedir ve (Şekil 2A) merkez şekilde Deneyde kullanılan her bir sabitleme / permeabilizasyon durumu için boyanmadan kontrolü. <ol><li> Anlamlı kaymalar sitometresiyle akış veya numune hazırlama ile olası sorunlara işaret edebilir gibi, tek bir deney boyunca bu ayarları korumak ve aynı cihaz üzerinde deney yapmak deneyden tutarlı olması. </li></ol></li><li> Her fluorofor için izotip kontrolü analiz etmek ve tepe sol ve sağ kenarları görüntüleyen bir fluoresans histogramının elde etmek için gerekli en düşük yoğunluğunu belirlemek için uygun bir lazer gerilimini ayarlamak. Antikor lekeli örnekleri gelen verileri satın alırken her bir izotop kontrol için lazer ayarları koruyun. NOT: Sinyal sık sık kayması aynı cihazda zamanla oluşur. Bu uygun bir izotip kontrolü ile ilgili olarak, her bir deneyin başlangıcında lazer ayarları için çok önemlidir. </li><li> En az toplayın10.000 olaylar. 50.000 olaylar tercih edilir. </li><li> İstatistiksel analizler için, kapı canlı hücre popülasyonu enkaz (Şekil 2A) dışlamak için. Şekil 2B&#39;de, C&#39;de gösterildiği gibi, ikinci bir izotip kontrolü ≤2% katkı sağlar işaretleyici yerleşimine göre kapı nüfus içinde yüzde pozitif hücrelerin belirlenmesi. </li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Farklılaşma protokolün başarısına için kritik farklılaşma başlamadan önce en az beş geçişler için tek hücre düzeyinde pasajlanmışlardır edilmiştir hPSCs kaliteli kültürlerinin kullanılmasıdır. Bunlar hücre hattı bağımsız farklılaşma başlangıcında% 100 konfluent, eğer benzer farklılaşma verimleri bilinen muhtelif hPSC hatlar arasında görülmektedir. Farklılaşma başlangıcında hücre kaynaşması ≤95 veya%&gt;% 100 ise, optimumun altında verimliliği görülmektedir. Bu yüz...

HESC ve hiPSC dahil hPSCs, ikinci kardiyomiyositlerde oluşmasından mekanik çalışmalar için başka şekilde erişilemez aşamalarında fikir veren çok erken insan kardiak gelişimsel süreçlerinin bir in vitro model olarak işlev görebilir. Bu model sistem kalp soy bağlılığı ve hücre kaderinin şartname kontrol moleküler yolları incelemek için eşsiz fırsatlar sunmaktadır. Son yıllarda, etkili hPSCs ikinci cardiomyogenic hücreleri üretmek için yeteneği büyük ölçüde 1-15 iyileşmiştir. Bununla birlikte, protokolleri arasında hücreler oda özgü belirteçleri (örneğin, ventrikül ve kulakçıklar) ifade eden hücreler de cardiomyogenic ve zamanlama üreten verimliliğine göre hücre çizgisi farklılıklar vardır. İdeal olarak, bu model sisteminin gelecek uygulamalar için, fonksiyonel olarak tanımlanmış hücrelerin daha homojen popülasyonları arzu edilir. Önceki yöntemlerin tersine, kardiyomiyosit farklılaşma protokolü ce gerektirmez, burada açıklananII toplanmasını ya da sağlam bir aktivin veya Kemik morfogenetik protein 4 (BMP4) ve ekleme gün TNNI3, TNNT2, Irx4, MLC2v ve MLC2a için kültürlerinden pozitif bugüne kadar test edilen bütün HESC ve hiPSC hatları üzerinden 10 hücreleri oluşturur. Bu strateji, özellikle üç boyutlu kültürler, kitle kültürü veya vücut embriyoit bazlı stratejilerin 4-9 ile karşılaştırıldığında, uygulamaya teknik olarak basittir ve son hPSCs seçici toksisite ile küçük bir molekülü tarif etmektedir bir çalışmada (Boheler ve ark tanımlandı. ) 65. Bu protokolün özellikleri, küçük molekülleri kullanarak tam olarak tanımlanmış bir ortam (fakat farklı 1,2,7,13, benzer bir şekilde,), Wnt sinyal modüle etmek üzere bir yetkili HESC matrisi (Matrigel) oluşan tek bir tabaka kullanılarak tek katmanlı kültürü içinde hPSCs farklılaşmasını içermektedir ve farklılaşma verimlilik ve hücre kimliğinin değerlendirilmesi için boyama yöntemleri sitometri optimize edilmiş akış. Önceki raporlar maliyet-etkiliğin dahil Özetle, bu protokolün avantajları karşılaştırıldıeness, tekrarlanabilirlik ve HESC ve hiPSC hatları dahil olmak üzere birden hPSC hatları arasında yer kardiyomiyositlerin üretmek için yüksek verimlilik. Flow sitometri kültür hücrelerin kalitesini değerlendirmek ve subpopülasyonu homojenlik belirlenmesi için güçlü bir analitik araçtır, ve uygun deneysel tasarım, kantitatif ölçümler sağlayabilir. Tüm antikor bazlı stratejiler gibi, deneysel sonuçların doğru yorumlanması alt-optimal koşulları belirgin antikor verimini etkileyen gibi antikor konsantrasyonunun ve tespit ve permeabilizasyon koşulları (hücre içi antijenler hedefleme dahil) tahlil tasarım unsurları dikkatle her antikor için test gerektirir , sonuçların yorumlanması bağlanması ve bu nedenle. Niceleme gerekli ise, poliklonal antikorlar, çok epitopu tanıyan ve partiden partiye değişkenlik eğilimli gibi Önemli olarak, monoklonal antikorlar, gereklidir. Şu anda, çeşitli antikorlar, (POlyclonal ve monoklonal) ve boyama protokolleri zor protokoller arasında 1,2,9,11 cardiomyogenesis verimliliğini karşılaştırmak çok in vitro farklılaşma değerlendirilmesi için tarif edilmiştir. Tüm akış sitometresi analizleri için kullanılabilir Bu nedenle monoklonal antikorlar kullanılır. İleriye, daha iyi farklılaşma stratejileri arasında karşılaştırma izin vermelidir, özellikle kantitatif getirmedi, bu boyama protokollerin standartlaştırılması bekleniyor. In vitro olarak cardiomyogenesis saflığını değerlendirmek için kullanılan belirteçler seçimi ve bunlara karşılık gelen antikorlar, raporlar arasında değişir. TNNT2 cardiomyogenic kaderine işlenen hücrelerin bir göstergesi olarak kabul edilmiş ve rutin olarak kalp farklılaşma protokolleri etkinliğini değerlendirmek için kullanılır. Bununla birlikte, aynı zamanda, erken TNNT2 piliç ve sıçan gelişim 16,17 sırasında iskelet kası olarak ifade edilir ve insan düz kas 18 içinde mevcut olmaktadır </sup&gt;. Böylece, TNNT2 zorunlu in vitro olarak insan cardiomyogenesis özel bir molekül değildir. MLC2v ve MLC2a rutin olarak, sırasıyla, ventriküler ve atriyal alt tiplerinin temsili gösterge olarak kullanılır. Bununla birlikte in vitro farklılaşma bağlamında kardiyomiyosit alt-tipini belirlemek ve MLC2v MLC2a güvenerek zorluklar bu gen ürünleri, yetişkin yoluyla kalp tüp, kalp gelişimi boyunca belirli bir bölmeye sınırlı olmayabilir gerçeğinden kaynaklanmaktadır. Kemirgen kalp döngüye yılında MLC2a mRNA atriyal / içeakımın alanda baskın ve MLC2v mRNA ventrikül / çıkış yolu bölgelerde yaygındır. Ilmekli kalbinde, MLC2a ve MLC2v mRNA&#39;larının birlikte ifadesi giriş yolu, atriyoventriküler kanal ve çıkış yoluna 19,20 görülmektedir. Doğumdan sonra 3 gün boyunca, MLC2v mRNA ventriküle sınırlıdır ve doğumdan sonra 10 gün, MLC2a neonatal sıçan kalbinde kulakçıklar 19 ile sınırlandırılmıştır. Bu nedenle, yorumlamacardiomyogenesis etkinlik ve alt-tipi kimlik sadece referans markeri seviyelerinin varlığını ve miktarını dikkate gerekir, ancak incelendiğinde farklılaşma edilen zaman noktalarından karşılık gelişimsel aşama (lar) dikkate almalıdır ilişkin verilerin. Bu hPSCs in vitro farklılaşma tarafından üretilen cardiomyogenic hücrelerin olgunlaşma aşaması en yakın, embriyonik / fetal gelişim 21-25 benzer olanlar göz önüne alındığında özellikle önemlidir. Bu nedenle, doğum sonrası kalp bir işaretin mekansal ifade dayanarak, en azından bazı durumlarda hPSC türetilen hücrelerin değerlendirilmesi için uygun olmayabilir. In vitro kardiyomyosit kimliklerini tanımlamak için daha spesifik kriterler geliştirilmesini kolaylaştırmak için bir çaba, TNNI3 o civciv ve Zebra balığı 15,20 embriyogenezis boyunca kalp kasının sınırlı olarak in vitro cardiomyogenesis değerlendirmek için değerli bir belirteç olarak kabul edilirve insan fetusu iskelet kası 26 yoktur. TNNI1 insan cenin kalbi mevcut iken, TNNI3 normal yetişkin kalp 27,28 tek TNNI izoformu mevcuttur. Kardiyomyosit alt tip kimliğine ilişkin, Irx4 29-31 ventriküler kaderi ile hücrelerin bilgilendirici bir belirtecidir. Protein düzeyinde, Irx4 son fare 32, neonatal aşamalardan doğrusal kalp tüpten ventriküle sınırlı olduğu gösterilmiştir. Bu duruma göre, akış sitometrisi ile analiz TNNI3 ve Irx4 için optimize boyama protokolleri açıklanmıştır. Bildiğimiz kadarıyla, bu akış sitometrisi ile etkin bir biçimde antikor bazlı boyama ve insan kardiyomiyositlerde Irx4 seviyesini ölçmek için bir yöntem, ilk tanımlamasıdır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="922">
	<tbody>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:431px;">Name of Reagent / Equipment</td>
			<td style="width:152px;">Company</td>
			<td style="width:111px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:231px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:431px;">Cell Culture</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">BD Matrigel, hESC-qualified matrix</td>
			<td style="width:152px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:111px;">354277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Accutase cell detachment solution</td>
			<td style="width:152px;">Stem Cell Technologies</td>
			<td style="width:111px;">7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:431px;">Dubelcco&#39;s phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO, Hybri-Max, sterile-filtered)</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">53817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Citric acid</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">C2404-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Y-27632 dihydrochloride selective p160ROCK inhibitor</td>
			<td style="width:152px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:111px;">1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">L-ascorbic acid-2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">A8960-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Sodium selenite</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">S5261-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Transferrin (Optiferrin &#8211; Defined, Animal-free, Recombinant Human)</td>
			<td style="width:152px;">Invitria</td>
			<td style="width:111px;">777TRF029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Fibroblast growth factor 2 (FGF2)</td>
			<td style="width:152px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:111px;">4144-TC-01M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Transforming growth factor beta 1 (TGF&#946;1)</td>
			<td style="width:152px;">Peprotech</td>
			<td style="width:111px;">100-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">DMEM/F12 with L-Glutamine and 15 mM HEPES</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Insulin</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">I9278-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">CHIR-99021 HCl</td>
			<td style="width:152px;">Sellekchem</td>
			<td style="width:111px;">S2924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">IWR-1</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">I0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">RPMI 1640 with L-Glutamine</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">B-27 Supplement Minus Insulin</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">A1895601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">B-27 Supplement (with Insulin)</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">10437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:431px;">Flow cytometry reagents</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Phosphate buffered saline (10X)</td>
			<td style="width:152px;">Quality Biological Inc.</td>
			<td style="width:111px;">119-069-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:431px;">Hank&#39;s balanced salt solution without Ca2+ and Mg2+</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">14175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">BD Cytofix</td>
			<td style="width:152px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:111px;">554655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">BD Phosflow perm buffer III</td>
			<td style="width:152px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:111px;">558050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">16% Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:152px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:111px;">28906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Methanol</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">179957-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Acetone</td>
			<td style="width:152px;">Mallenckrodt Chemicals&#160;</td>
			<td style="width:111px;">2440-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:152px;">Amresco</td>
			<td style="width:111px;">M236-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Goat serum</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">16210-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Trypan blue solution, 0.4%</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:431px;">Materials</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">5 ml round bottom polystyrene tube (without cap)</td>
			<td style="width:152px;">Corning</td>
			<td style="width:111px;">352008</td>
			<td>for preparation of cells for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">5 ml round bottom polystyrene tube (with 35 &#181;M cell strainer snap cap)</td>
			<td style="width:152px;">Corning</td>
			<td style="width:111px;">352235</td>
			<td>for preparation of cells for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">2 ml rubber bulbs</td>
			<td style="width:152px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:111px;">03-448-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">9&#34; borosilicate unplugged glass Pasteur pipets</td>
			<td style="width:152px;">BioExpress</td>
			<td style="width:111px;">P-2904-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">0.65 mL microcentrifuge tubes, graduated, green</td>
			<td style="width:152px;">GeneMate</td>
			<td style="width:111px;">C-3259-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">1.5 mL microcentrifuge tubes, graduated, red</td>
			<td style="width:152px;">GeneMate</td>
			<td style="width:111px;">C-3260-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">TC20 automated cell counter</td>
			<td style="width:152px;">BioRad</td>
			<td>145-0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Counting slides for TC20</td>
			<td style="width:152px;">BioRad</td>
			<td style="width:111px;">145-0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">6 well flat bottom tissue-culture treated plate</td>
			<td style="width:152px;">Corning</td>
			<td style="width:111px;">353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">20 mL syringes</td>
			<td style="width:152px;">BD Plastipak</td>
			<td style="width:111px;">300613</td>
			<td>For filter sterilization of aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Sterile syringe filters, 0.2 &#181;m polyethersulfone</td>
			<td style="width:152px;">VWR</td>
			<td style="width:111px;">28145-501</td>
			<td>For filter sterilization of aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">250 mL filter system, 0.22 &#181;m polyethersulfone, sterilizing, low binding&#160;</td>
			<td style="width:152px;">Corning</td>
			<td style="width:111px;">431096</td>
			<td>For filter sterilization of bulk media&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">500 mL filter system, 0.22 &#181;m polyethersulfone, sterilizing, low binding&#160;</td>
			<td style="width:152px;">Corning</td>
			<td style="width:111px;">431097</td>
			<td>For filter sterilization of bulk media&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:431px;">Antibodies and Isotype Controls</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Anti-TNNI3 (clone: 284 (19C7))</td>
			<td style="width:152px;">Abcam</td>
			<td>ab19615</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Anti-TNNT2 (clone: 1C11)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>MA1-16687</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Anti-MYL2 (MLC2v, clone: 330G5)</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>310111</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Anti-MYL7 (MLC2a, clone: 4E7)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB131661</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Anti-IRX4&#160;&#160;</td>
			<td>Bioss</td>
			<td>BS-9464R</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG1&#160;</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td>A21121</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Alexa Fluor 647 Goat anti-mouse IgG2a</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td>A21241</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG2b</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td>A21141</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Phycoerythrin(PE) Goat anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:152px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:111px;">F0110</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Mouse IgG1</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557273</td>
			<td>Isotype Control</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Mouse IgG2a</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>16-4724-81</td>
			<td>Isotype Control</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Rabbit IgG-PE</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>IC105P</td>
			<td>Isotype Control</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:431px;">TaqMan Probesets for qRT-PCR</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">ACTB</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs01060665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Brachyury T</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00610080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">CASQ2</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00154286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">IRX4</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs01100809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">ISL1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00158126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">MESP1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs01001283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">MYH11 (SMMHC)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00224610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">MYH6</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs01101425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">MYL2 (MLC2v)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00166405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">MYL7 (MLC2a)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs01085598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">MYOG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs01072232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">NKX2.5</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00231763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">NPPA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs01081097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">POU5F1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs04260367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">SOX17</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>HS00751752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">TNNI1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00913333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">TNNI2</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00268536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">TNNI3</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>HS00165957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">TNNT2</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00165960</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry

, Hasarlı kalp tamir kalp üzerinde toksik etkileri yoktur yeni tedavi ilaçlar keşfetmek ve doğru kalp hastalığı modellemek için stratejiler geliştirmek için yaklaşımlar geliştirmek için acil bir ihtiyaç vardır. Bu uygulamalar için &quot;bir tabak içinde&quot; kalp kası oluşturmak amacıyla insan uyarılmış pluripotent kök hücre (hiPSC) teknolojisini istismar potansiyeli yüksek coşku oluşturmak için devam ediyor. Son yıllarda, verimli insan pluripotent kök hücreleri (hPSCs) den cardiomyogenic hücreleri üretmek için yeteneği büyük ölçüde aksi erişilebilir değil, insan kardiyak gelişiminin çok erken aşamalarında modellemek için bize yeni fırsatlar sunan geliştirdi. Birçok önceki yöntemlerin tersine, kardiyomiyosit farklılaşma protokolü hücresi toplanmasını ya da A ya da aktivin BMP4 eklenmesini gerektirmeyen, burada açıklanan ve güçlü bir kardiyak troponin için yüksek seviyede pozitif olan hücre kültürleri üretir I ve T (TNNI3, TNNT2), iroquois- sınıf Homeodomain proteiniIRX-4 (Irx4), miyozin düzenleyici hafif zincir 2, ventriküler / kalp kası izoformu (MLC2v) ve miyozin düzenleyici hafif zincir 2, tüm insan embriyonik kök hücre (HESC) ve hiPSC hatları üzerinden 10 günde atriyal izoformu (MLC2a) için test tarihi. Hücreler geçirildi ve kültür içinde en fazla 90 gün muhafaza edilebilir. Strateji teknik uygulamak için basit ve maliyet-etkin. Pluripotent hücreler türetilen kardiyomiyositlerin karakterizasyonu genellikle mRNA ve protein seviyesinde, her ikisi de referans işaretlerinin analizini içermektedir. Protein analizi için, akış sitometrisi, kültürdeki hücre kalitesinin ve alt popülasyonu homojenliğinin saptanması için güçlü bir analitik araç olduğunu. Ancak, numune hazırlama teknik varyasyon anlamlı veri akış sitometri kalitesini etkileyebilir. Böylece, boyama protokolleri standardizasyon çeşitli farklılaşma stratejileri arasında karşılaştırmalar kolaylaştırmalıdır. Bu duruma göre, Irx4, MLC2v, MLC2a, TNNI3 ve TNN analizi için boyama protokolleri optimizeAkış sitometri T2 açıklanmıştır.

0. günde, hücreler, kompakt morfolojisi ve hücre döküntüleri en az% 100 birleşik bulunmaktadır. Günlerde 1-2, anlamlı hücre ölümünü (% 40-50) gözlemlemek için ortak, ancak ekli hücreleri kompakt morfoloji (Şekil 1A) muhafaza edecektir. Bu süre boyunca, medya portakal ve bulanıktır. Pembe ortam aşırı hücre ölümünü göstermektedir ve bu durumda, tripan mavisi ile teyit Hücre ölümü ve% 70 aşarsa bırakmaktadır. Hücreler gün 3-4 esnasında kurtarmak ve yoğunluk artacak...

Watch this Scientific Journal Video about High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry at JoVE.com

High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry

Makale verimli seçici referans belirteçlerinin analizi nüfusun homojenliği ve kimliğini değerlendirmek için flow sitometri ile takip Wnt yolu, modüle göre kardiyomiyositlere insan pluripotent kök hücreleri ayırt etmek için ayrıntılı yöntem anlatılmaktadır.

Sitometrisi ile Yüksek Verim kardiyomiyositlerde İnsan pluripotent kök hücrelerin Farklılaşma ve Karakterizasyonu

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the ...

high-efficiency-differentiation-human-pluripotent-stem-cells-to

Research

JoVE Journal

Biology

30.0K Görüntüleme.  Medical College of Wisconsin.  Makale verimli seçici referans belirteçlerinin analizi nüfusun homojenliği ve kimliğini değerlendirmek için flow sitometri ile takip Wnt yolu, modüle göre kardiyomiyositlere insan pluripotent kök hücreleri ayırt etmek için ayrıntılı yöntem anlatılmaktadır. 

Video: High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant interest in deriving a pure population of lineage-committed oligodendrocyte precursor cells (OPCs) for transplantation. OPCs are characterized by the activity of the transcription factor Olig2 and surface expression of a proteoglycan NG2. Using the GFP-Olig2 (G-Olig2) mouse embryonic stem cell (mESC) reporter line, we optimized conditions for the differentiation of mESCs into GFP+Olig2+NG2+ OPCs. In our protocol, we first describe the generation of embryoid bodies (EBs) from mESCs. Second, we describe treatment of mESC-derived EBs with small molecules: (1) retinoic acid (RA) and (2) a sonic hedgehog (Shh) agonist purmorphamine (Pur) under defined culture conditions to direct EB differentiation into the oligodendroglial lineage. By this approach, OPCs can be obtained with high efficiency (&gt;80%) in a time period of 30 days. Cells derived from mESCs in this protocol are phenotypically similar to OPCs derived from primary tissue culture. The mESC-derived OPCs do not show the spiking property described for a subpopulation of brain OPCs in situ. To study this electrophysiological property, we describe the generation of spiking mESC-derived OPCs by ectopically expressing NaV1.2 subunit. The spiking and nonspiking cells obtained from this protocol will help advance functional studies on the two subpopulations of OPCs.

We describe a small molecule-based protocol for differentiation of mouse embryonic stem cells into oligodendrocyte precursor cells (OPCs). This protocol generates Olig2+NG2+ OPCs with high efficiency by 30 days of differentiation. We also describe a method to generate "spiking" OPCs that can fire action potentials.

Embriyonik Kök Hücreler farklılaşma oligodendrosit Öncüleri

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Biyoloji

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

Fare Mayotik Hücreler Sitometrisi Arıtma

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human embryonic stem cells (HESCs)1. While improvements in several gene delivery methods have been described2-9, transfection remains a capricious process for HESCs, and has not yet been reported in human induced pluripotent stem cells (iPSCs). In this video, we demonstrate how our lab routinely transfects and nucleofects human iPSCs using plasmid with an enhanced green fluorescence protein (eGFP) reporter. Human iPSCs are adapted and maintained as feeder-free cultures to eliminate the possibility of feeder cell transfection and to allow efficient selection of stable transgenic iPSC clones following transfection. For nucleofection, human iPSCs are pre-treated with ROCK inhibitor11, trypsinized into small clumps of cells, nucleofected and replated on feeders in feeder cell-conditioned medium to enhance cell recovery. Transgene-expressing human iPSCs can be obtained after 6 hours. Antibiotic selection is applied after 24 hours and stable transgenic lines appear within 1 week. Our protocol is robust and reproducible for human iPSC lines without altering pluripotency of these cells.

Despite recent advancements in genetic modification, transfection of human embryonic stem cells (HESCs) remains a capricious process. To our knowledge, systematic and efficient methods to transfect human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have not been reported. Here, we describe robust protocols to efficiently transfect and nucleofect human iPSCs.

İnsan İsteyerek Pluripotent Kök Hücreler transfekte ve Nucleofecting

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based transplantation or by cardiac tissue engineering1-3. Cardiomyocytes become terminally-differentiated soon after birth and lose their ability to proliferate. There is no evidence that stem/progenitor cells derived from other sources, such as the bone marrow or the cord blood, are able to give rise to the contractile heart muscle cells following transplantation into the heart1-3. The need to regenerate or repair the damaged heart muscle has not been met by adult stem cell therapy, either endogenous or via cell delivery1-3. The genetically stable human embryonic stem cells (hESCs) have unlimited expansion ability and unrestricted plasticity, proffering a pluripotent reservoir for in vitro derivation of large supplies of human somatic cells that are restricted to the lineage in need of repair and regeneration4,5. Due to the prevalence of cardiovascular disease worldwide and acute shortage of donor organs, there is intense interest in developing hESC-based therapies as an alternative approach. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity6-8 (see a schematic in Fig. 1A). In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic9-11. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules12 (see a schematic in Fig. 1B). After screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered nicotinamide (NAM) sufficient to induce the specification of cardiomesoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to cardioblasts that generated human beating cardiomyocytes with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of cardioblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human cardiac cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of cardioblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human cardiac progenitors and functional cardiomyocytes for cardiovascular repair.

Küçük Molekül İndüksiyon Pluripotent İnsan Embriyonik Kök Hücreleri İnsan Kardiyak Öncüleri ve kardiyomiyositlerde Verimli türetilmesi

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is essential first to generate functional human cardiomyocytes (CMs). The use of these cells in drug discovery and toxicology studies would also be highly beneficial, allowing new pharmacological molecules for the treatment of cardiac disorders to be validated pre-clinically on cells of human origin. Of the possible sources of CMs, induced pluripotent stem (iPS) cells are among the most promising, as they can be derived directly from readily accessible patient tissue and possess an intrinsic capacity to give rise to all cell types of the body 1. Several methods have been proposed for differentiating iPS cells into CMs, ranging from the classical embryoid bodies (EBs) aggregation approach to chemically defined protocols 2,3. In this article we propose an EBs-based protocol and show how this method can be employed to efficiently generate functional CM-like cells from feeder-free iPS cells.

Pluripotent stem cells, either embryonic or induced pluripotent stem (iPS) cells, constitute a valuable source of human differentiated cells, including cardiomyocytes. Here, we will focus on cardiac induction of iPS cells, showing how to use them to obtain functional human cardiomyocytes through an embryoid bodies-based protocol.

İnsan kardiyomiyositleri Üretimi: Besleyici-ücretsiz İnsan Bağlı Pluripotent Kök Hücre A Farklılaşma Protokolü

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to the analysis of a few fluorochromes, currently there are dozens of different fluorescent dyes, and up to 14-18 different dyes can be combined at a time. However, several limitations still impair the analytical capabilities. Because of the multiplicity of fluorescent probes, data analysis has become increasingly complex due to the need of large, multi-parametric compensation matrices. Moreover, mutant mouse models carrying fluorescent proteins to detect and trace specific cell types in different tissues have become available, so the analysis (by flow cytometry) of auto-fluorescent cell suspensions obtained from solid organs is required. Spectral flow cytometry, which distinguishes the shapes of emission spectra along a wide range of continuous wavelengths, addresses some of these problems. The data is analyzed with an algorithm that replaces compensation matrices and treats auto-fluorescence as an independent parameter. Thus, spectral flow cytometry should be capable of discriminating fluorochromes with similar emission peaks and can provide a multi-parametric analysis without compensation requirements.
This protocol describes the spectral flow cytometry analysis, allowing for a 21-parameter (19 fluorescent probes) characterization and the management of an auto-fluorescent signal, providing high resolution in minor population detection. The results presented here show that spectral flow cytometry presents advantages in the analysis of cell populations from tissues difficult to characterize in conventional flow cytometry, such as the heart and the intestine. Spectral flow cytometry thus demonstrates the multi-parametric analytical capacity of high-performing conventional flow cytometry without the requirement for compensation and enables auto-fluorescence management.

This article describes spectral cytometry, a new approach in flow cytometry that uses the shapes of emission spectra to distinguish fluorochromes. An algorithm replaces compensations and can treat auto-fluorescence as an independent parameter. This new approach allows for the proper analysis of cells isolated from solid organs.

Spektral Sitometrisi ile Katı Dokular İzole Hücre Cezalar Analizi

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

Measurement of Mitochondrial Mass and Membrane Potential in Hematopoietic Stem Cells and T-cells by Flow Cytometry

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production of all mature blood cells. In recent years cellular metabolism has emerged as a crucial regulator of HSC function and fate. We have previously demonstrated that modulation of mitochondrial metabolism influences HSC fate. Specifically, by chemically uncoupling the electron transport chain we were able to maintain HSC function in culture conditions that normally induce rapid differentiation. However, limiting HSC numbers often precludes the use of standard assays to measure HSC metabolism and therefore predict their function. Here, we report a simple flow cytometry assay that allows reliable measurement of mitochondrial membrane potential and mitochondrial mass in scarce cells such as HSCs. We discuss the isolation of HSCs from mouse bone marrow and measurement of mitochondrial mass and membrane potential post ex vivo culture. As an example, we show the modulation of these parameters in HSCs via treatment with a metabolic modulator. Moreover, we extend the application of this methodology on human peripheral blood-derived T cells and human tumor infiltrating lymphocytes (TILs), showing dramatic differences in their mitochondrial profiles, possibly reflecting different T cell functionality. We believe this assay can be employed in screenings to identify modulators of mitochondrial metabolism in various cell types in different contexts.

Here we describe a reliable method to measure mitochondrial mass and membrane potential in ex vivo cultured hematopoietic stem cells and T cells.

Hematopoetik Kök Hücrelerde ve T-Hücrelerinde Mitokondriyal Kitle ve Membran Potansiyelinin Akış Sitometrisi ile Ölçülmesi

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production ...

Single Extracellular Vesicle Transmembrane Protein Characterization by Nano-Flow Cytometry

Single particle characterization has become increasingly relevant for research into extracellular vesicles, progressing from bulk analysis techniques and first-generation particle analysis to comprehensive multi-parameter measurements such as nano-flow cytometry (nFCM). nFCM is a form of flow cytometry that utilizes instrumentation specifically designed for nano-particle analysis, allowing for thousands of EVs to be characterized per minute both with and without the use of staining techniques. High resolution side scatter (SS) detection allows for size and concentration to be determined for all biological particles larger than 45 nm, while simultaneous fluorescence (FL) detection identifies the presence of labeled markers and targets of interest. Labeled subpopulations can then be described in quantitative units of particles/mL or as a percentage of the total particles identified by side scatter.
Here, EVs derived from conditioned cell culture media (CCM) are labeled with both a lipid dye, to identify particles with a membrane, and antibodies specific for CD9, CD63, and CD81 as common EV markers. Measurements of comparison material, a concentration standard and a size standard of silica nanospheres, as well as labeled sample material are analyzed in a 1-minute analysis. The software is then used to measure the concentration and size distribution profile of all particles, independent of labeling, before determining the particles that are positive for each of the labels.
Simultaneous SS and FL detection can be utilized flexibly with many different EV sources and labeling targets, both external and internal, describing EV samples in a comprehensive and quantitative manner.

The latest generation of EV characterization tools are capable of single EV analysis across multiple parameters simultaneously. Nano-flow cytometry measures all biological particles larger than 45 nm without labeling and identifies specific characteristics of subpopulations by a variety of fluorescent labeling techniques.

Nano-Flow Sitometri ile Tek Hücre Dışı Vezikül Transmembran Protein Karakterizasyonu

Single particle characterization has become increasingly relevant for research into extracellular vesicles, progressing from bulk analysis techniques and ...

hiPSC-CM'lerde Kalsiyum ve Kontraktilite Parametrelerinin Gerçek Zamanlı Ölçümleri

Real-Time Measurements of Calcium and Contractility Parameters in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) represent a powerful tool for studying mutation-mediated changes in cardiomyocyte function and defining the effects of stressors and drug interventions. In this study, it is demonstrated that this optics-based system is a powerful tool to assess the functional parameters of hiPSC-CMs in 2D. By using this platform, it is possible to perform paired measurements in a well-preserved temperature environment on different plate layouts. Moreover, this system provides researchers with instant data analysis.
This paper describes a method for measuring the contractility of unmodified hiPSC-CMs. Contraction kinetics are measured at 37 &#176;C based on pixel correlation changes relative to a reference frame taken at relaxation at a 250 Hz sampling frequency. Additionally, simultaneous measurements of intracellular calcium transients can be acquired by loading the cell with a calcium-sensitive fluorophore, such as Fura-2. Using a hyperswitch, ratiometric calcium measurements can be performed on a 50 &#181;m diameter illumination spot, corresponding to the area of the contractility measurements.

Yazar Spotlight: İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Kardiyomiyositlerde Kalsiyum ve Kontraktilite Parametrelerinin Gerçek Zamanlı Ölçümleri  

Here, an established method is described to perform contractility and calcium measurements in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes using an optics-based platform. This platform enables researchers to study the effect of mutations and the response to various stimuli in a rapid and reproducible manner.

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositlerde kalsiyum ve kontraktilite parametrelerinin gerçek zamanlı ölçümleri

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) represent a powerful tool for studying mutation-mediated changes in cardiomyocyte ...