Yazarlar Sitometrisi Core tesiste Massachusetts Üniversitesi Tıp Fakültesi Dr. Richard Konz ve personel tarafından sağlanan danışmanlık ve teknik destek için teşekkür ederiz. Diyabet Endokrinoloji Araştırma Merkezi Hibe DK032520 tarafından desteklenen temel kaynakları da kullanılmıştır. Bu çalışma, Ulusal Ruh Sağlığı Enstitüsü (NIMH), Ulusal Uyuşturucu Enstitüsü&#39;nden (NIDA) ve Ulusal Çocuk Sağlığı ve İnsan Gelişimi Enstitüsü hibe tarafından desteklenmektedir.

Çekirdekler Ekstraksiyon <ol><li> Bir douncer 5 ml Lizis Tampon 1, 250 mg donmuş postmortem beyin dokusu koyun ve buz üzerine yerleştirin. Sıralama FACS sonra yaklaşık 5 milyon çekirdekleri almak için, genellikle örnek başına 1000 mg doku kullanın. </li><li> Doku çözülmüş sonra, buz üzerinde ise 1 dakika için doku Dounce. </li><li> Homojenize doku ve 15 ml açık ultrasantrifüjdeki tüp içine yerleştirin. Buz tüpü koyun. </li><li> 9 Sakkaroz Çözüm 2 mL pipet ile alın açık ultrasantrifüjdeki tüpün dibinde pipet koymak ve Sakkaroz Çözüm 2 üstüne homojenize doku çözümü ile bir konsantrasyon degrade oluşturmak için Sakkaroz Çözüm 2 serbest. </li><li> Ultrasantrifüjdeki içinde dönerken tüm dengeli olacağına emin olmak için ultrasantrifüjdeki tüpler tartılır. Lizis Tampon 1, üst tabaka eklenerek ağırlığı herhangi bir ayarlamaları yapın . </li><li> Tüpler tartılır sonra, rotor kova içine koyun. </li><li> SW28 rotor içine yerleştirin ve tüm kovalar rotor ultrasantrifüjdeki dikkatlice yerleştirin. </li><li> 4 2,5 saat süreyle 107163,6 RCF örnekleri ultrasantrifüjdeki ° C </li><li> Tüpün alt kısmındaki çekirdekleri içeren pelet rahatsız etmemek için dikkatli olmak, santrifüj işlemi tamamlandıktan sonra, bir vakum kullanımı ile, konsantrasyon farkı Bulunan enkaz tabakası ile birlikte, süpernatant kaldırmak. </li><li> 1X PBS 500 mcL her pelet ekleyin ve 20 dakika boyunca buz üzerinde bekletin. Bu pelet, daha sonra mekanik stres miktarını azaltır çekirdekleri deneyimi, yukarı ve aşağı pipetleme çözmek için kendi başına çözmek için biraz izin verir. </li><li> Çekirdekleri, 20 dakika boyunca buz üzerinde inkübe sonra, mekanik 1XPBS içinde çekirdekleri tamamen erimesi için aşağı yukarı pipet ve. </li><li> Çekirdekleri içeren çözüm ultrasantrifüjdeki tüpleri çıkarın ve 2 mL tek mikrosantrifüj tüpe iki tüp içeriğini birleştirmek. Yine, buz örnekleri yer. </li></ol> FACS için immün <ol><li> Bu noktada, birincil ve ikincil antikor oluşan bir immün karışımı yapmak ve Engelleme karıştırın. Her bir numune için 300, 1.2 Neun antikor,% 0.5 BSA ve% 10 Normal Keçi 1XPBS Serum ve Alexa Fluor 488 1 mcL içeren Engelleme Mix, 100 mcL mcL içeren 1XPBS mcL birleştirir. Kontrol örnekleri için, birincil antikor Neun dışlamak yerine, sadece daha fazla 1XPBS eklemek. </li><li> Vorteks immün karışımı 5 dakika karanlıkta, oda sıcaklığında ve kuluçkaya yatmaktadır. </li><li> Boyama karışımı inkübe iken, numuneler için kontrollerini yapmak. Yalnız çekirdekleri içeren bir örnek sıralama FACS için, &quot;lekesiz kontrol&quot; tabi olarak adlandırılan ikinci bir örnek, bir negatif kontrol, birincil antikor Neun de tabi olmadan ikincil antikor Alexa Fluor 488 çekirdekleri içeren. </li><li> 980 uL negatif kontrol 1XPBS içeren başka bir 2 ml tüp içine 1XPBS lekesiz kontrolü için, ve başka bir 20 mcL içeren 2 ml mikrosantrifüj tüpe çözüm içeren çekirdeğinin kısım 20 mcL. Hacmi çekirdekleri içeren 1XPBS 1 ml yedeklemek örnek kaldırın. Tüm numuneler, buz üzerinde geri yerleştirilir. </li><li> Immün karışımı inkübe tamamladı Şimdi uygun numuneler 401 mcL içeriğini ekleyin. Olumsuz örnek içeren karışımın sadece ikincil antikor Alexa Fluor 488 alacaksınız çekirdekleri örnek, hem Neun ve Alexa Fluor 488 içeren karışım alacaksınız. </li><li> 45 dakika boyunca karanlıkta döndürmek için soğuk oda içine örnekleri alın. </li><li> Örnekleri 45 dakika boyunca karanlıkta inkübe sonra, buz koyun ve FACS tesisi getirin. FACS tesisine taşıma sırasında, örnekleri, buz üzerinde ve karanlıkta tutulmalıdır. </li></ol> FACS <ol><li> FACS tesiste, 40 um filtresi aracılığıyla numuneler filtre. Sonra, soğuk tutuluyor sıralamadan önce bazı ön verileri elde etmek için, onları bir kaç dakika aracı ile çalışacak. </li><li> Bu noktada, bu sıralama için gerekli olan uygun kapılarını ayarlamak için gereklidir. Birkaç ayrı ayrı kapılardan tür örnekleri için kullanılır. Ilk kapısı örnek içinde bulunan farklı çekirdeğinin boyutu hakkında bir fikir verir ve gerçek çekirdekleri enkaz separatation sağlar. İkinci kapı bizi tek tek çekirdekleri sıralamak için izin verir. Bu noktada atın herhangi bir agrega atılır. Son olarak, üçüncü kapı bizim sekonder antikoru bulundu florokrom bu eşleşen, belirli bir floresan dalga boyu ayarlanır. Bu kapıdan yerleştirilmesi bize düzenlemenize olanak sağlar ve bu nedenle ayrı Neun + Neun nöronal çekirdeklerin çekirdekleri. </li><li> Bütün kapıları seçilmiştir sonra, çekirdekleri 1XPBS sıralanabilir. </li><li> Sonratüm örnek geçti, aracı ile sıralanmış örnek bir kısım çalışan tür saflık kontrol edin. Örnek floresan yayılmamış değil, tek bir kadran içinde yer emin olun. % 90&#39;ın üzerinde saf örnekleri seçmek için en iyisidir. </li></ol> FACS sonra <ol><li> Örnek çekirdekleri işleme başlayabilirsiniz sıralanır olmuştur. 10 ml sıralaması örnek alın ve Sakkaroz Çözüm 2 uL 1M CaCl 2, 50 ve 30 ul 1m Mg (As) 2 2 mL ekleyin. Bir hatırlatma olarak, her zaman örnek çekirdekleri Sabitlenmemiş beri buz üzerinde tutmak için emin olun. </li><li> Az 10 ml sıralaması örnek varsa, 1XPBS ekleyerek 10 ml sesini yükseltmek, ya da ek maddeler buna göre ayarlamak. </li><li> 15 dakika boyunca örnek birkaç kez buz üzerinde ve yerde tersine çevirin. </li><li> , 4, örnekleri 15 dakika boyunca buz üzerinde inkübe sonra 15 dakika boyunca 1786 RCF bir salıncak kova rotor santrifüj ° C </li><li> Borunun alt kısmında bulunan beyaz pelet bozmadan, bir vakum kullanımı ile süpernatant atın. </li><li> 200 ul geçmeden deneyler için gerekli her türlü çözüm pelet çözülür ve pipet ve aşağı yukarı. </li><li> Çözüm küçük bir tüp içine aktarın ve daha sonra kullanmak kadar -80 ° C derin dondurucu içine yerleştirin. </li></ol>

<ol>
	<li>Siegmund, K. D., Connor, C. M., Campan, M., Long, T. I., Weisenberger, D. J., Biniszkiewicz, D., Jaenisch, R., Laird, P. W., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+in+the+human+cerebral+cortex+is+dynamically+regulated+throughout+the+life+span+and+involves+differentiated+neurons.">DNA methylation in the human cerebral cortex is dynamically regulated throughout the life span and involves differentiated neurons.</a> PLoS ONE. 2, 895-895 (2007).</li><li>Jiang, Y., Matevossian, A., Huang, H. S., Straubhaar, J., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+neuronal+chromatin+from+brain+tissue.">Isolation of neuronal chromatin from brain tissue.</a> BMC Neurosci. 9, 42-42 (2008).</li><li>Spalding, K. L., Bhardwaj, R. D., Buchholz, B. A., Druid, H., Frisen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrospective+birth+dating+of+cells+in+humans.">Retrospective birth dating of cells in humans.</a> Cell. 122, 133-143 (2005).</li><li>Acevedo, L. G., Iniguez, A. L., Holster, H. L., Zhang, X., Green, R., Farnham, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+ChIP-chip+analysis+using+10,000+human+cells.">Genome-scale ChIP-chip analysis using 10,000 human cells.</a> Biotechniques. 43, 791-797 (2007).</li></ol>

Burada sunulan protokol daha genel nöronal kromatin epigenetik değişiklikler ve odaklanmış çalışmaları için özellikle yararlı olacaktır, normal gelişmekte olan ve yaşlanma veya nörolojik veya psikiyatrik bir hastalık sırasında nöronal çekirdeği, moleküler fenotipi. Bu yöntem, potansiyel yaşlanma seyri sırasında nöron glia rasyon vardiya veya hastalık nedeniyle beyin dokusunda hücresel heterojenite bir endişe 1 belli bir avantajdır . Örneğin, bugünkü sıralama protokolü kromatin immunoprecipita...

Reaktifler: <table><tr><th colspan="3" align="left"> 1. Lizis Tampon </th></tr><tr><td> 0.32M </td><td> Sakaroz </td><td> 5,47 g </td></tr><tr><td> 5 mM </td><td> CaCl 2 </td><td> 250 ul </td></tr><tr><td> 3 mM </td><td> Mg (Asetat) 2 </td><td> 150 ul </td></tr><tr><td> 0.1 mM </td><td> EDTA </td><td> 10 ul </td></tr><tr><td> 10mM </td><td> Tris-HCl, pH8 </td><td> 500 ul </td></tr><tr><td> 1 mM </td><td> DTT </td><td> 17 ul </td></tr><tr><td> % 0.1 </td><td> Triton X-100 </td><td> 50 ul </td></tr><tr><td colspan="3" align="center" style="padding:8px 0 16px 0"> Otoklavlı su ile 50 ml hacim ayarlayın </td></tr></table><table><tr><th colspan="3" align="left"> 2. Sakkaroz Çözüm </th></tr><tr><td> 1,8 M </td><td> Sakaroz </td><td> 30,78 g </td></tr><tr><td> 3 mM </td><td> Mg (Asetat) 2 </td><td> 150 ul </td></tr><tr><td> 1 mM </td><td> DTT </td><td> 17 ul </td></tr><tr><td> 10 mM </td><td> Tris-HCl, pH8 </td><td> 500 ul </td></tr><tr><td colspan="3" align="center" style="padding:8px 0 16px 0"> Otoklavlı su ile 50 ml hacim ayarlayın </td></tr></table><table><tr><th colspan="3" align="left"> 3. Tampon Dounce </th></tr><tr><td> 10 mM </td><td> Tris </td><td> 0,242 g </td></tr><tr><td> 4 mM </td><td> MgCl 2 </td><td> 0.163 g </td></tr><tr><td> 1 mM </td><td> CaCl 2 </td><td> 0,03 g </td></tr><tr><td colspan="3" align="center" style="padding:8px 0 16px 0"> Otoklavlı su ile 200 ml pH 7.5 ve hacmi ayarlayın. </td></tr></table>

neuronal nuclei isolation from human postmortem brain tissue

Insan beyninin nöron prenatal gelişimi sırasında büyük ölçüde postmitotic hale gelir, ve böylece tam ömrü boyunca çekirdekleri korumak. Ancak gelişme ve yaşlanma ders sırasında nöronal kromatin ve nükleer organizasyon değişiklikleri veya kronik nöropsikiyatrik hastalık hakkında bilinen çok az. Ancak bugüne kadar, en Kromatin ve DNA tabanlı testlerin (FISH dışında) eksikliği, tek hücreli çözünürlük. Nöronların genellikle çeşitli alt popülasyonlar glia ve diğer non-nöronal hücrelerin farklı türleri ile iç içe, çünkü bu amaçla, beyin dokusu önemli hücresel heterojenite, önemli bir sınırlama teşkil etmektedir. Hücre türüne özgü kültürleri büyümeye olası bir çözüm olurdu, ama nöronlar da dahil olmak üzere en çok merkezi sinir sistemi hücreleri, sadece birkaç hafta için, en azından, sürdürülebilir ex vivo ve böylece potansiyel olarak tam ömrü boyunca faaliyet epigenetik mekanizmalar için eksik bir model sağlayacak . Burada, (sabit asla) dondurulmuş insan postmortem beyin çekirdeklerinin özü ve arındırmak için bir protokol sağlar. Bu yöntem, anti-neun antikor ile Ultrasantrifügasyon ve immunotagging takip Hipotonik lizis tamponu çekirdeklerinin çıkarılması içerir. Etiketli nöronal çekirdeklerinin daha sonra floresan aktive sıralama kullanılarak ayrı toplanır. Bu yöntem, türlerin geniş bir yelpazede herhangi bir beyin bölgesi için geçerli olup, site ve modifikasyon özgü anti-histon antikorlar ve DNA metilasyon ve diğer testleri ile kromatin immunoprecipitation çalışmalar için uygun olmalıdır.

Watch this Scientific Journal Video about Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue at JoVE.com

Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue

Beyin dokusunda hücresel heterojenite testlerin çoğu tek hücreli çözünürlük eksikliği nedeniyle kromatin epigenetik işaretlerin çalışma için önemli bir sınırlama teşkil etmektedir. Nöronlar genellikle glia ve diğer non-nöronal hücreler ile iç içe. Biz özü ve insan beyninin nöron çekirdekleri toplamak için bir protokol sağlar.

İnsan Postmortem Beyin Dokusu Nöronal Çekirdekler İzolasyon

Neurons in the human brain become postmitotic largely during prenatal development, and thus maintain their nuclei throughout the full lifespan. However, ...

neuronal-nuclei-isolation-from-human-postmortem-brain-tissue

Research

JoVE Journal

Biology

22.0K Görüntüleme.  University of Massachusetts Medical School. Beyin dokusunda hücresel heterojenite testlerin çoğu tek hücreli çözünürlük eksikliği nedeniyle kromatin epigenetik işaretlerin çalışma için önemli bir sınırlama teşkil etmektedir. Nöronlar genellikle glia ve diğer non-nöronal hücreler ile iç içe. Biz özü ve insan beyninin nöron çekirdekleri toplamak için bir protokol sağlar.

Video: Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue

A Chromatin Assay for Human Brain Tissue

Chronic neuropsychiatric illnesses such as schizophrenia, bipolar disease and autism are thought to result from a combination of genetic and environmental factors that might result in epigenetic alterations of gene expression and other molecular pathology. Traditionally, however, expression studies in postmortem brain were confined to quantification of mRNA or protein. The limitations encountered in postmortem brain research   such as variabilities in autolysis time and tissue integrities   are also likely to impact any studies of higher order chromatin structures. However, the nucleosomal organization of genomic DNA   including DNA:core histone binding - appears to be largely preserved in representative samples provided by various brain banks. Therefore, it is possible to study the methylation pattern and other covalent modifications of the core histones at defined genomic loci in postmortem brain. Here, we present a simplified native chromatin immunoprecipitation (NChIP) protocol for frozen (never-fixed) human brain specimens. Starting with micrococcal nuclease digestion of brain homogenates, NChIP followed by qPCR can be completed within three days. The methodology presented here should be useful to elucidate epigenetic mechanisms of gene expression in normal and diseased human brain.

Until recently, expression studies on human brain were limited to quantification of RNA or protein. With the chromatin immunoprecipitation techniques described in this paper, it will be possible to map histone methylation and other epigenetic regulators of gene expression in postmortem brain.

İnsan Beyninin Doku Kromatin Testi

Chronic neuropsychiatric illnesses such as schizophrenia, bipolar disease and autism are thought to result from a combination of genetic and environmental ...

Biyoloji

Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression profiles of pyramidal neurons in layer III. It is well known that the cerebral cortex is an exceptionally heterogeneous structure comprising diverse regions, layers and cell types, each of which is characterized by distinct cellular and molecular compositions and therefore differential gene expression profiles. To circumvent the confounding effects of tissue heterogeneity, we used laser-capture microdissection (LCM) in order to isolate our specific cell-type i.e pyramidal neurons.
Approximately 500 pyramidal neurons stained with the Histogene staining solution were captured using the Arcturus XT LCM system. RNA was then isolated from captured cells and underwent two rounds of T7-based linear amplification using Arcturus/Molecular Devices kits. The Experion LabChip (Bio-Rad) gel and electropherogram indicated good quality a(m)RNA, with a transcript length extending past 600nt required for microarrays. The amount of mRNA obtained averaged 51&mu;g, with acceptable mean sample purity as indicated by the A260/280 ratio, of 2.5. Gene expression was profiled using the Human X3P GeneChip probe array from Affymetrix.

We describe a process using laser-capture microdissection to isolate and extract RNA from a homogeneous cell population, pyramidal neurons, in layer III of the superior temporal gyrus in postmortem human brains. We subsequently linearly amplify (T7-based) mRNA, and hybridize the sample to the Affymetrix human X3P microarray.

İnsan Postmortem Beyin Dokusu Tek Hücre Popülasyonlar Yüksek Kalite RNA Alınması

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

The myofibroblast is a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining considerable attention for its critical role in many GI functions. While several myofibroblast cell lines are commercially available to study these cells in vitro, research results from a cell line exposed to experimental cell culture conditions have inherent limitations due to the overly reductionist nature of the work. Use of primary myofibroblasts offers a great advantage in terms of confirming experimental findings identified in a cell line. Isolation of primary myofibroblasts from an animal model allows for the study of myofibroblasts under conditions that more closely mimic the disease state being studied. Isolation of primary myofibroblasts from human colon tissue provides arguably the most relevant experimental data, since the cells come directly from patients with the underlying disease. We describe a well-established technique that can be utilized to isolate primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue. These isolated cells have been characterized to be alpha-smooth muscle actin and vimentin-positive, and desmin-negative, consistent with subepithelial intestinal myofibroblasts. Primary myofibroblast cells can be grown in cell culture and used for experimental purposes over a limited number of passages.

The myofibroblast is an influential stromal cell of the gastrointestinal tract that regulates important physiologic processes in both normal and disease states. We describe a technique that allows for the isolation of primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue, which can be utilized for in vitro experimentation.

Fare ve İnsan Kolon Doku Primer miyofibroblastlar İzolasyonu

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Nuclei Isolation from Whole Tissue using a Detergent and Enzyme-Free Method

High-throughput transcriptome and epigenome profiling requires preparation of a single cell or single nuclei suspension. Preparation of the suspension with&#160;intact cell or nuclei involves dissociation and permeabilization, steps that can introduce unwanted noise and undesirable damage. Particularly, certain cell-types such as neurons are challenging to dissociate into individual cells. Additionally, permeabilization of the cellular membrane to release nuclei requires optimization by trial-and-error, which can be time consuming, labor intensive and financially nonviable. To enhance the robustness and reproducibility of sample preparation for high-throughput sequencing, we describe a rapid enzyme and detergent-free column-based nuclei isolation method. The protocol enables efficient isolation of nuclei from the entire zebrafish brain within 20 minutes. The isolated nuclei display intact nuclear morphology and low propensity to aggregate. Further, flow cytometry allows nuclei enrichment and clearance of cellular debris for downstream application. The protocol, which should work on soft tissues and cultured cells, provides a simple and accessible method for sample preparation that can be utilized for high-throughput profiling, simplifying the steps required for successful single-nuclei RNA-seq and ATAC-seq experiments.

Single nuclei isolation relies on dissociation and detergent-based permeabilization of the cell membrane, steps that need optimization and are prone to introducing technical artifacts. We demonstrate a detergent and enzyme-free protocol for rapid isolation of intact nuclei directly from whole tissue, yielding nuclei suitable for single-nucleus RNA-seq (snRNA-Seq) or ATAC-seq.

Deterjan ve Enzimsiz YöntemLe Tüm Dokudan Çekirdek İzolasyon

High-throughput transcriptome and epigenome profiling requires preparation of a single cell or single nuclei suspension. Preparation of the suspension ...

Nuclei Isolation from Adult Mouse Kidney for Single-Nucleus RNA-Sequencing

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are executed by multiple cell types arranged in a complex architecture across the corticomedullary axis of the organ. Recent advances in single-cell transcriptomics have accelerated the understanding of cell type-specific gene expression in renal physiology and disease. However, enzyme-based tissue dissociation protocols, which are frequently utilized for single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq), require mostly fresh (non-archived) tissue, introduce transcriptional stress responses, and favor the selection of abundant cell types of the kidney cortex resulting in an underrepresentation of cells of the medulla.
Here, we present a protocol that avoids these problems. The protocol is based on nuclei isolation at 4 &#176;C from frozen kidney tissue. Nuclei are isolated from a central piece of the mouse kidney comprised of the cortex, outer medulla, and inner medulla. This reduces the overrepresentation of cortical cells typical for whole-kidney samples for the benefit of medullary cells such that data will represent the entire corticomedullary axis at sufficient abundance. The protocol is simple, rapid, and adaptable and provides a step towards the standardization of single-nuclei transcriptomics in kidney research.

Here, we present a protocol to isolate high-quality nuclei from frozen mouse kidneys that improve the representation of medullary kidney cell types and avoids the gene expression artifacts from enzymatic tissue dissociation.

Tek Çekirdekli RNA Dizilimi için Yetişkin Fare Böbreğinden Çekirdek İzolasyonu

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are ...

Isolation, Characterization, and Therapeutic Application of Extracellular Vesicles from Cultured Human Mesenchymal Stem Cells

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membrane nanoparticles released by most cell types, and they are increasingly recognized as physiological regulators of organismal homeostasis and important indicators of pathologies; in the meantime, their immense potential to establish accessible and controllable disease therapeutics is emerging. Mesenchymal stem cells (MSCs) can release large amounts of EVs in culture, which have shown promise to jumpstart effective tissue regeneration and facilitate extensive therapeutic applications with good scalability and reproducibility. There is a growing demand for simple and effective protocols for collecting and applying MSC-EVs. Here, a detailed protocol is provided based on differential centrifugation to isolate and characterize representative EVs from cultured human MSCs, exosomes, and microvesicles for further applications. The adaptability of this method is shown for a series of downstream approaches, such as labeling, local transplantation, and systemic injection. The implementation of this procedure will address the need for simple and reliable MSC-EVs collection and application in translational research.

The present protocol describes the differential centrifugation for isolating and characterizing representative EVs (exosomes and microvesicles) from cultured human MSCs. Further applications of these EVs are also explained in this article.

Kültürlenmiş İnsan Mezenkimal Kök Hücrelerinden Hücre Dışı Veziküllerin İzolasyonu, Karakterizasyonu ve Terapötik Uygulaması

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membrane nanoparticles released by most cell types, and they are increasingly recognized as physiological ...

Isolation of Nuclei from Flash-Frozen Liver Tissue for Single-Cell Multiomics

The liver is a complex and heterogenous tissue responsible for carrying out many critical physiological functions, such as the maintenance of energy homeostasis and the metabolism of xenobiotics, among others. These tasks are performed through tight coordination between hepatic parenchymal and non-parenchymal cells. Additionally, various metabolic activities are confined to specific areas of the hepatic lobule-a phenomenon called liver zonation. Recent advances in single-cell sequencing technologies have empowered researchers to investigate tissue heterogeneity at a single-cell resolution. In many complex tissues, including the liver, harsh enzymatic and/or mechanical dissociation protocols can negatively affect the viability or the quality of the single-cell suspensions needed to comprehensively characterize this organ in health and disease.
This paper describes a robust and reproducible protocol for isolating nuclei from frozen, archived liver tissues. This method yields high-quality nuclei that are compatible with downstream, single-cell omics approaches, including single-nucleus RNA-seq, assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq), as well as multimodal omics (joint RNA-seq and ATAC-seq). This method has been successfully used for the isolation of nuclei from healthy and diseased human, mouse, and non-human primate frozen liver samples. This approach allows the unbiased isolation of all the major cell types in the liver and, therefore, offers a robust methodology for studying the liver at the single-cell resolution.

Here, we present a protocol for isolating nuclei from flash-frozen, archived liver tissues for single-nucleus RNA-seq, ATAC-seq, and joint multiomics (RNA-seq and ATAC-seq).

Tek Hücreli Multiomikler için Flaş Dondurulmuş Karaciğer Dokusundan Çekirdeklerin İzolasyonu

The liver is a complex and heterogenous tissue responsible for carrying out many critical physiological functions, such as the maintenance of energy ...

Donmuş Memeli Dokularından Tek Çekirdeklerin İzolasyonu ve Profillenmesi

A Simple, Quick, and Partially Automated Protocol for the Isolation of Single Nuclei from Frozen Mammalian Tissues for Single Nucleus Sequencing

Single-cell and single-nucleus RNA sequencing have become common laboratory applications due to the wealth of transcriptomic information that they provide. Single nucleus RNA sequencing, particularly, is useful for investigating gene expression in difficult-to-dissociate tissues. Furthermore, this approach is also compatible with frozen (archival) material. Here, we describe a protocol to isolate high-quality single nuclei from frozen mammalian tissues for downstream single nucleus RNA sequencing in a partially-automated manner using commercially available instruments and reagents. Specifically, a robotic dissociator is used to automate and standardize tissue homogenization, followed by an optimized chemical gradient to filter the nuclei. Lastly, we accurately and automatically count the nuclei using an automated fluorescent cell counter. The performance of this protocol is demonstrated on mouse brain, rat kidney, and cynomolgus liver and spleen tissue. This protocol is straightforward, rapid, and readily adaptable to various mammalian tissues without requiring extensive optimization and provides good quality nuclei for downstream single nuclei RNA sequencing.

Yazar Spotlight: İlaç Keşfinin Geliştirilmesi - Donmuş Dokulardan Çekirdek Ekstraksiyonu için Otomatik, Standartlaştırılmış Protokollerin Geliştirilmesi 

The study describes a simple, quick, and partially automated protocol to isolate high-quality nuclei from frozen mammalian tissues for downstream single nuclei RNA sequencing.