Genetiği değiştirilmiş fareler üretmek ve fenotiplerini analiz etmek, spesifik gen fonksiyonlarını in vivo olarak ayrıntılı olarak anlamamızı sağlar. Genle modifiye edilmiş hayvan modelleri kullanılarak çok sayıda önemli bulgu ortaya çıkarılmıştır. Burada tarif ettiğimiz yöntem, uzun DNA'nın kök hücreleri ilaç seçimi olmadan kabul edilebilir verimlilikle implante etmesini sağlar.
Teknik sadece temel yaşam bilimleri için faydalı değil, aynı zamanda bulgular tıp bilimi ve hayvan bilimi gibi uygulamalı bilimlerde de uygulanacaktır. Prosedürü gösteren, yardımcı doçent Dr. Chihiro Emri ve laboratuvarımdan doçent olan Dr. Manabu Ozawa olacak. Fare embriyonik fibroblastını hazırladıktan sonra, jelatin kaplı hücre kültürü kabını el yazmasında açıklandığı gibi hazırlayın ve nemli bir inkübatörde iki saat boyunca inkübe edin.
Jelatin çözeltisini çıkarın, bulaşığı PBS ile iki kez yıkayın ve kullanana kadar oda sıcaklığında saklayın. Bir dakika boyunca 37 santigrat derecede temperlenmiş bir su banyosu kullanarak mitotik olarak inaktive edilmiş dondurulmuş MEF stokunu çözün. ESC tohumlamadan bir gün önce, MEF'i jelatin kaplı 60 milimetrelik bir kaba yerleştirin.
Dondurulmuş bir ESC stok tüpünü daha önce gösterildiği gibi çözün ve önceden tohumlanmış MEF içeren 60 milimetrelik bir kaba bir kez 10 ila beşinci ESC'leri yerleştirin. Daha sonra, dört mililitre ESC kültür ortamı ekleyin ve ESC% 50 ila% 70 akıcılığa ulaşana kadar çanağı inkübe edin. Kültürlenmiş ESC'yi dört mililitre PBS ile yıkadıktan sonra, 37 santigrat derecede beş dakika boyunca 800 mikrolitre% 0.25 tripsin EDTA çözeltisi ile sindirin.
Tripsin bir mililitre ESCM ile inaktive edildikten sonra, hücrelere bir mililitre taze ESCM ekleyin, ortamı bir tüpe aktarın ve hücreleri beş dakika boyunca 280 G'de santrifüjleme ile pelet edin. Hücreleri bir mililitre taze ESCM'de yeniden askıya aldıktan sonra, tripan mavisi boyamalı bir hücre sayacı kullanarak hücre konsantrasyonunu sayın. Beşinci ESC'lere bir kez 10 ila 1,5 mililitrelik yeni bir tüpe aktardıktan ve santrifüjleme yoluyla PBS ile üç kez yıkadıktan sonra, ESC peletini 12 mikrolitre Cas9 RNP DNA karışımında yeniden askıya alın ve köpürmeyi önlemek için nazik pipetleme ile iyice karıştırın.
Ardından, elektroporasyon için askıya alınmış ESC'yi servis edin. Daha sonra, elektroporated ESC'leri mitotik olarak inaktive edilmiş MEF ile dört mililitre ECSM içeren 60 milimetrelik bir kapta kültürleyin ve ortamı günlük olarak değiştirmeye devam edin. Elektroporasyondan üç ila beş gün sonra, ESC'leri dört mililitre PBS ile yıkayın, ardından nemli bir inkübatörde 800 mikrolitre% 0.25 tripsin EDTA ve kültür ile sindirin.
Daha sonra, tripsin sindirimini durdurmak için iki mililitre ESCM ekleyin. Hücre karışımı peletlendikten sonra, peleti bir mililitre taze ESCM'de yeniden askıya alın ve tripan mavisi boyamalı bir hücre sayacı kullanarak hücre konsantrasyonunu sayın. ESC'leri, ESCM ve besleyici MEF içeren 60 milimetrelik çanak başına bir kez 10 ila üçüncü hücrelere geçirin.
Koloni toplanana kadar ortamı değiştirdiğinizden emin olun. İlk geçişten beş ila yedi gün sonra, ESCM ESC kültür kabından aspire edildikten sonra, dört mililitre PBS ekleyin. 20 mikrolitrelik bir pipet kullanarak, bir stereomikroskop altında beş mikrolitre PBS içeren tek ESC kolonilerini toplayın.
Bireysel kolonileri, 15 mikrolitre% 0.25 tripsin EDTA çözeltisi içeren yuvarlak tabanlı 96 delikli bir plakanın kuyucuğuna yerleştirin. 96 delikli plakayı inkübe ettikten sonra, 80 mikrolitre ESCM ekleyerek tripsin sindirimini durdurun ve ESC kolonilerini pipetleme yoluyla tek hücrelere ayırın. PCR genotiplemesi için, 40 mikrolitre ESC süspansiyonunu, kuyu başına 50 mikrolitre ESCM içeren jelatin kaplı, besleyici içermeyen, 96 delikli bir plakaya aktarın.
Dondurulmuş ESC stoğunu yapmak için, kalan 60 mikrolitre ESC süspansiyonunu, 500 mikrolitre ESCM ve besleyici MEF içeren jelatin kaplı 24 delikli bir plakanın kuyucuğuna aktarın. 24 delikli plakada kültürlenmiş bireysel ESC klonlarını% 60 ila% 80 akıcılığa ulaşana kadar stoklayın ve daha önce gösterildiği gibi tripsinizasyon yoluyla bireysel ESC klonlarını kurtarın. Hücre peletini santrifüjleme ile elde ettikten sonra, hücreleri eksi 80 santigrat derecede dondurmak için 500 mikrolitre hücre dondurma ortamını yeniden askıya alın.
PCR genotiplemesi için, kültür ESC klonları daha önce gösterildiği gibi ve ESCM'yi iki kez 100 mikrolitre PBS ile yıkamadan önce aspirasyon yoluyla her bir kuyucuktan uzaklaştırır. PBS'yi aspire ettikten sonra, proteinaz K içeren 100 mikrolitre lizis tamponu ekleyin ve iyice karıştırın. Şimdi ESC lizatını yeni bir 1.5 mililitrelik tüpe aktarın ve en az bir saat boyunca 65 santigrat derecede bir ısı odasında tutun.
Genomik DNA 20 mikrolitre DNaz içermeyen suda çözündükten sonra, bir spektrofotometre kullanarak DNA'nın saflığını ve konsantrasyonunu belirleyin. Hedef bölgeyi yükseltmek için lokusa özgü primer setleri kullanarak genomik PCR gerçekleştirdikten sonra, diziyi kontrol edin ve istenen knock-in dizilerine sahip ESC klonlarını seçin. Hormonla tedavi edilen kadınları ICR erkekleriyle çiftleştirdikten ve yumurta kanalını topladıktan sonra, toplanan yumurta kanallarını FHM damlalarına yerleştirin ve infundibuluma yerleştirilmiş bir yıkama iğnesi kullanarak yumurtalık kanalını FHM ile yıkayarak iki hücreli veya dört hücreli aşama embriyolarını geri kazanın.
Toplanan embriyoları bir ağız pipeti kullanarak birkaç taze FHM damlasına taşıyarak yıkayın. 50 mikrolitre KSOM'daki embriyoları, sekiz hücreli veya morula aşamasına ulaşılana kadar bir gün boyunca daha önce gösterildiği gibi mineral yağ ile kaplı 35 milimetrelik bir hücre kültürü kabına düşürür. Embriyoları tutmak için cam pipetler hazırlayın ve bir çektirme ve mikroforge kullanarak ESC enjeksiyonu yapın.
FHM içeren bir tutma pipeti, bir mikroenjektöre bağlı kılcal tutucuya entegre ettikten sonra, mikromanipülatörün sol tarafına yerleştirin. Bir enjeksiyon pipetini başka bir mikro enjektöre bağlayın ve sağ tarafa yerleştirin. İki pipeti doğrudan mikroskopun görüş alanına hizalayın.
60 milimetrelik bir kabın aynı kapağına yan yana% 12 polivinil pirolidon ve beş mikrolitre FHM damlası beş mikrolitrelik damla damla yapın. Damlaları mineral yağ ile örtün. Embriyoları beş mikrolitre FHM damlasına aktarın ve embriyo içeren FHM damlasına bir ila beş mikrolitre ESC süspansiyonu ekleyin.
Enjeksiyon pipeti polivinil pirolidon ile yıkandıktan sonra, enjeksiyon pipetini embriyoları ve ESC'leri içeren damlaya hareket ettirin. Enjeksiyon pipetinde hücre bölünmesini yeni bitirmiş üç ayrı ESC çifti seçin. Tutma pipetini kullanarak, aspirasyonla sıkıştırmayı tamamlamış sekiz hücreli veya morula evreli bir embriyoyu tutun ve piezoelektrik bir darbe ile zona pellucida'da bir delik açın.
Altı hücreli ESC'yi zona pellucida'nın içine atın ve pipeti embriyolardan çekin. ESC enjekte edilen embriyoları bir ağız pipeti kullanarak birkaç KSOM damlası ile hafifçe yıkayın ve embriyolar blastosist aşamasına gelene kadar daha önce gösterildiği gibi mineral yağ ile kaplı yeni bir 50 mikrolitrelik KSOM damlasında inkübe edin. Knock-in hedefine özgü boyutta bir PCR amplikonu elde edildi ve 22 klondan 9'u knock-in'e özgü bir bant gösterdi.
Bu sonuçlar, herhangi bir ilaç seçimi olmadan gen knock-in için etkili ve tekrarlanabilir. ESC kolonilerinin optimal boyutunu toplamak bu prosedür için oldukça önemlidir. Çok büyük veya çok küçük kolonileri seçmekten kaçının.
Bir zigot kullanarak CRISPR Cas9 aracılı doğrudan genom düzenlemesi, basit gen nakavt fareleri yapmak için geçerli olacaktır. Bu CRISPR Cas9 aracılı ESC gen hedefleme protokolü, yaşam bilimlerinde gelecekteki analizler için genetiği değiştirilmiş çeşitli farelerin üretimini kolaylaştırır.
