Bu protokol, senkronize tomurcuklanan maya hücrelerinde S-faz süresinin kesin olarak belirlenmesini sağlar. Hızlı, kolay ve tekrarlanabilir bir yöntemdir. Ek olarak, klasik protokoller tarafından tespit edilmeyen hafif sentez kusurlarını tespit edecek kadar hassastır.
Bu yöntem, tomurcuklanan mayada hücre döngüsü düzenlemesi üzerinde çalışan birçok araştırmacı için yararlı olacaktır. Bu protokolü gösterenler, kıdemli bir araştırmacı olan Nicolas Talalek ve laboratuvarda doktora öğrencisi olan Juan De Dios Barba Tena olacak. Saccharomyces cerevisiae hücrelerini, dakikada 130 rotasyonda orbital ajitasyon ile 30 santigrat derecede bir gece kültürü için düşük hücre konsantrasyonunda 10 mililitre SC ortamında aşılayın.
Ertesi gün, hücreleri 20 mililitre taze SC ortamında, mililitre başına altı hücreye iki ila üç kez 10 oranında son bir konsantrasyonda seyreltin. Mililitre başına bir miligramın 40 mikrolitresinde alfa faktörü suda seyreltilir. Daha sonra hücreleri 30 santigrat derecede kültüre alın, yörüngesel ajitasyon bir saat boyunca dakikada 130 rotasyonda.
Bu adımı bir kez tekrarlayın. G1 tutuklamasını izlemek için hücreleri bir ışık mikroskobu altında görselleştirin. Hücrelerin% 90'ından fazlası bir shmoo görüntülüyorsa ve diğerleri yuvarlanmış butted hücrelerse devam edin.
Numuneleri 1.500 G'de üç dakika boyunca santrifüj yapın.Daha sonra süpernatantı vakum pipeti ile atın ve hücreleri 20 mililitre SC ortamında yeniden askıya alın. Bu adımı bir kez tekrarlayın. Her beş dakikada bir iki kez bir mililitre hücre toplayın ve EDU etiketlemesine geçin.
Serbest bırakıldıktan 30 dakika sonra alfa faktörünün 400 mikrolitresini ekleyin. Hücre kültürünün bir mililitresini, bir mikrolitre 10 milimolar EDU içeren iki mililitrelik bir mikrofüj tüpüne aktarın, ters çevrilerek iyice karıştırılır. EDU pozitif hücrelerini, bir Pi EDU bivaryant olgusundaki EDU negatif hücrelerden ayırt etmek için, bir mikrolitre DMSO içeren iki mililitrelik bir mikrofüj tüpüne bir mililitre hücre kültürü daha aktarın.
Sallanan bir su banyosunda ajitasyon altında 30 santigrat derecede üç ila beş dakika kuluçkaya yatırın. 100 mikrolitre% 100 etanol ekleyerek reaksiyonu durdurun. Hücreleri bir mikrofüjde 10.000 G'de iki dakika boyunca pelet edin.
Süpernatantı vakum pipeti kullanarak çıkarın. Hücre peletini 500 mikrolitre% 70 etanol içinde yeniden askıya alın ve vorteks yaparak iyice karıştırın. Numuneleri, hücrelere nüfuz etmek için değişken hızlı bir rocker üzerinde dakikada 20 eğimde en az bir saat oda sıcaklığında bırakın.
Hücreleri bir mikrosantrifüjde 10.000 G'de iki dakika boyunca pelet edin ve süpernatantı bir vakum pipeti ile atın. Hücreleri iki kez 500 mikrolitre% 10 etanol ve PBS ile yıkayın. Hücreleri bir mikrofüjde 10.000 G'de iki dakika boyunca pelet edin ve süpernatantı bir vakum pipeti ile atın.
Pelet, RNaz A ve Proteinaz K. Kuluçka içeren 200 mikrolitre PBS'de, ara sıra sallanarak 50 santigrat derecede bir ila iki saat arasında veya gece boyunca 37 santigrat derecede yeniden askıya alın. Hücreleri bir mikro santrifüjde 10.000 G'de iki dakika boyunca pelet edin ve süpernatantı bir vakum pipeti ile atın. Hücreleri 500 mikrolitre PBS ile yıkayın.
Daha sonra hücreleri toplayın ve daha önce gösterildiği gibi süpernatantı atın. Hücre peletini %1 BSA ile 200 mikrolitre PBS içinde yeniden askıya alın. Oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
Daha sonra hücreleri pelet edin, daha önce gösterildiği gibi süpernatantı atın ve peleti% 1 BSA içeren 300 mikrolitre PBS'de yeniden askıya alın. Hücreleri iki, 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerine dağıtın. Birincisi, Tıklama reaksiyonu için 200 mikrolitre hücre kültüründen oluşmalı ve ikinci tüp, sytox yeşil boyama için 100 mikrolitre hücre kültürü içermelidir.
Daha sonra, hücreleri toplayın ve daha önce gösterildiği gibi süpernatantı atın. Sitoks yeşili boyama için, hücre peletini 100 mikrolitre PBS'de yeniden askıya alın. Daha sonra hücre konsantrasyonuna bağlı olarak, 10 ila 30 mikrolitreyi, 300 mikrolitre sytox yeşil karışımı içeren bir akış sitometre tüpüne aktarın.
Örnekleri% 40 ila% 50 genlikte iki saniye boyunca iki kez sonikleştirinÖrnekleri bir akış sitometresinde işleyene kadar karanlıkta bırakın. Click reaksiyonu için, hücre peletini 40 mikrolitre taze hazırlanmış Azide boya tamponu ile yeniden askıya alın. Karanlıkta oda sıcaklığında 60 dakika boyunca inkübe edin.
Hücreleri pelet edin ve daha önce gösterildiği gibi süpernatantı atın. Daha sonra hücreleri PBS'de 300 mikrolitre% 10 etanol ile üç kez yıkayın. Daha sonra hücreleri PBS'de mililitre propidium iyodür başına 100 mikrolitre 50 mikrogram içinde yeniden askıya alın ve karanlıkta 10 dakika bekletin.
Hücre konsantrasyonuna bağlı olarak, hücre süspansiyonunun 10 ila 30 mikrolitresini, 300 mikrolitre 50 milimolar Tris HCl, pH 7.5 içeren bir akış sitometre tüpüne aktarın. 40 ila 50 genlikte iki saniye boyunca iki kez sonikleştirin. Örnekleri bir sitometrede işleyene kadar karanlıkta bırakın.
Sitoks yeşili numunelerini 488 nanometrede bir uyarma mavisi lazer ve 530 x 30 bantlı bir geçiş filtresi kullanarak okuyun. Bavyera Pi EDU örneklerini 488 nanometrede bir uyarma mavisi lazer ve Pi X ekseni için 615 x 20 bant geçiş filtresi ve 640 nanometrede kırmızı bir uyarma lazeri, Y ekseni için 660 x 20 bant geçiş filtresi kullanarak bir nokta grafiği üzerinde okuyun. Bivaryant EDU Pi sitometre analizinde üç hücre popülasyonu gözlendi.
25 santigrat derecede, hücre popülasyonunun yaklaşık% 27'si G1 fazında,% 29'u S fazında ve% 44'ü G2 artı M fazındaydı. Senkronize hücrelerde, S fazının süresi, DNA içeriğinin sytox yeşil akış sitometre profilinde bir C'den iki C'ye değiştiği zamana bağlı olarak yaklaşık 25 dakika olabilir. EDU darbe etiketlemesi, S faz süresini doğru bir şekilde belirledi.
Serbest bırakıldıktan 15 dakika sonra, EDU pozitif hücrelerinin bir kısmı tespit edildi ve bu da S fazının başlangıcını gösterdi. S fazındaki ilerleme, Bavaria Pi EDU grafiğinde yukarı ve sağa doğru hareket eden hücre bulutu tarafından görüldü. Son olarak, salınımdan 35 dakika sonra, hücrelerin bir kısmı EDU negatifti, ancak S fazının sona erdiğini ve hücrelerin G2 artı M fazında olduğunu gösteren DNA miktarının iki katıydı.
Gözlemlenen yüksek senkrona rağmen, bazı hücreler S fazını serbest bırakıldıktan 60 dakika sonra bitirdi ve S fazı, salınımdan yaklaşık 65 dakika sonra tüm popülasyon için tamamlandı. Mükemmel bir senkronizasyona sahip olmak ve hücrelerin ikinci S fazına girmesini önlemek çok önemlidir. Hücreler, nükleer DNA replikasyon öngörüsünün izlenebileceği ve ölçülebileceği bir mikroskopla görüntülenebilir.
Bu teknik, hafif S faz kusurlarına ve hücre döngüsü süresi kusurlarına sahip gözden kaçan mutantların belirlenmesine yardımcı olacaktır.
