Bu protokol, nötrofil hücre dışı tuzakların bileşimi, yapısı ve morfolojisindeki heterojenliği, sağlıklı bireylerden gelen insan nötrofillerinde karşılaştırılabilir in vitro koşullar altında uyaranlarına bağlı olarak göstermektedir. Yüksek nötrofil saflığı ve canlılığı elde edilir. Bu, nötrofil hücre dışı tuzaklar tarafından salınan DNA, LL-37 ve miyeloperoksidaz, elastaz ve kathepsin G'nin enzim aktivitesinin konsantrasyonunu karşılaştırmaya izin verir.
Bu protokol, çözünür faktörlerin veya hücresel temasın veya otoimmün hastalıkta NET'lerin üretimi üzerindeki olası tedavilerin veya mekanizmaların etkisini analiz etmeyi sağlamıştır. Bu yöntemler otoimmün hastalığın araştırılmasında yardımcı olabilir. NET'lerin kontrolsüz hücre üremesi ve hastalığın biyobelirteçleri olarak kabul edilen bileşenlerinin hizalanma süresi nedeniyle.
Floresan mikroskopisi, DNA'nın dağılımını gösteren NET'lerin görüntüsünü, nasıl göründüklerini anlamaya yardımcı olan mikroorganizmalarla birlikte lokalize olan LL37 gibi proteinlerle ilişkili olarak yakalamaya izin verir. Başlamak için, antikoagülan olarak dipotasyum EDTA içeren tüplerde 10 mililitre periferik kan toplamak için vena ponksiyonu yapın. Ardından, numunenin kalitesini sağlamak için enfeksiyon veya inflamasyonu dışlamak için standart kan biyometrisi ve C-reaktif protein testi yapın.
Trombositten zengin plazmayı çıkarmak için periferik kan örneğini santrifüj edin, ardından ikinci bir santrifüjleme yapın ve kalan plazmayı atın. Elde edilen eritrosit ve lökosit paketini bire bir hacim oranında bir 1X DPBS ile seyreltin. Daha sonra, steril bir 10 mililitrelik cam tüpte, önce mililitre yoğunluk çözeltisi başına bir mililitre 1.08 gram, ardından mililitre yoğunluk çözeltisi başına bir mililitre 1.079 gram biriktirin.
Daha sonra, seyreltilmiş eritrosit ve lökosit paketinin dört mililitresini duvarların üzerine dökerek ekleyin. Gradyanı rahatsız etmemek için hızlanma veya yavaşlama olmadan santrifüj. Granülositlere karşılık gelen fazı aspire edin ve başka bir steril 10 mililitrelik cam tüpe aktarın.
Dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 300 G'de dört mililitre 1X DPBS ile yıkayın ve süpernatanı atın. Kalan eritrositleri çıkarmak için, dört mililitre% 0.2 tuzlu su çözeltisi ekleyerek hücreleri ozmotik şokla tedavi edin. Dört santigrat derecede iki dakika inkübe edin ve santrifüjleyin.
Süpernatantı atın ve dört mililitre% 0.65 tuzlu su çözeltisi ekleyin. Membran bütünlüğünü geri kazanmak ve santrifüjlemeyi tekrarlamak için dört santigrat derecede beş dakika boyunca inkübe edin. Süpernatantı çıkarın ve hücresel kalıntıları gidermek için hücreleri dört mililitre 1X DPBS'de yeniden askıya alın.
Yine, hücre peletini iki mililitre soğuk HBSS tamponunda santrifüj edin ve yeniden askıya alın. Bir tripan mavisi dışlama testi yapmak için, hücre süspansiyonunun beş mikrolitresini% 0.4 tripan mavisi 20 mikrolitrede seyreltin. Yeni bir bower odasındaki hücreleri sayın ve bir dışlama testi kullanarak hücre canlılığını belirleyin.
Ardından, hücre süspansiyonunun 5 mikrolitresini bir slayta monte edin ve Wright'ın lekesiyle 15 saniye boyunca lekeleyin. Numuneyi hemen sabitleyin, damıtılmış suyla yıkayın ve morfolojiyi optik mikroskop altında gözlemleyin. Daha sonra, sitometri tüplerini akıtmak için beşinci hücrelere bir kez 10 kez ekleyin ve karanlıkta dört santigrat derecede 15 dakika boyunca 100 mikrolitre FACS tamponunda bir mikrolitre 7AAD ile lekeleyin.
300 G'de 500 mikrolitre FACS tamponu ile 10 dakika boyunca yıkayın. Hücreleri 500 mikrolitre% 2 paraformaldehit ile sabitleyin ve akış sitometrisi analizine kadar dört santigrat derecede saklayın. Ölü hücre kontrolü için, hücreleri 30 dakika boyunca 200 mikrolitre% 4 paraformaldehit ile sabitleyin ve dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 300 G'de 500 mikrolitre 1XPBS ile yıkayın.
Süpernatantı atın ve% 0.1 Triton X-100'ün 200 mikrolitresini ekleyin. Dört santigrat derecede bir saat boyunca kuluçkaya yatırın. 500 mikrolitre 1X PBS ile yıkayın ve 7AAD ile lekeleyin.
Yakalanan verileri akış sitometresi yazılımında analiz edin. Dosyaları yükleyin ve lekesiz nötrofil dosyasına çift tıklayın. Nötrofillere karşılık gelen hücre popülasyonunu görüntülemek için X ekseninde ileri saçılım veya FSC ve Y ekseninde yan saçılma veya SSC seçin.
Ardından, hücrelerin otofloresansını sınırlamak için X ekseninde B3-A:PerCP vio 700-A kanalını seçin ve Y ekseninde histogramı seçin. Ardından, lekeli nötrofil dosyasını açın. Nötrofillere karşılık gelen hücre popülasyonunu görüntülemek için X ekseninde FSC'yi ve Y ekseninde SSC'yi seçin.
Yine, 7AAD boyası için pozitif nötrofil popülasyonunu sınırlamak üzere B3-A:PerCP vio 700-A kanalını seçin. Pencereye sağ tıklayıp düzen düzenleyicisine kopyala'yı seçerek son histogramı oluşturun. 1.5 mililitrelik mikro tüplere bakteriyel veya fungal psödohipha ekleyin.
200 mikrolitre ekleyin, böylece 1X PBS'de beş mikromolar CFSC. Karanlıkta 10 dakika boyunca 37 santigrat derecede karıştırın ve kuluçkaya yatırın. 500 mikrolitre dekompleman plazma ve santrifüj ekleyerek reaksiyonu durdurun.
Süpernatantı atın ve peleti santrifüjleme ile bir mililitre 1XPBS ile yıkayın. Daha sonra mikroorganizmaları 250 mikrolitre 1X PBS'de tekrar askıya alın. NET indüksiyonu için 1.5 mililitrelik mikrotüplerde iki kez 10 ila yedinci bakteri veya iki kez 10 ila beşinci psödohifler ile 50 mikrolitre alikot hazırlayın.
10 x 10 milimetre steril cam kapak kaymalarını 24 delikli bir plakaya yerleştirin. Oda sıcaklığında bir saat boyunca 10 mikrolitre% 0.001poli l-lizin ile örtün ve 100 mikrolitre 1X PBS ile iki kez yıkayın. Hava kurutun ve 15 dakika boyunca UV ışığı ile ışınlayın.
Daha sonra, daha önce hazırlanan nötrofil süspansiyonunun HBSS çözeltisini,% 10 ısı ile dekompleman otolog plazma ile desteklenmiş RPMI 1640 ortamı ile değiştirin. Bu hücre süspansiyonunun 350 mikrolitresini, kuyu başına iki kez 10 ila beşinci nötrofillerin son konsantrasyonu için 24 delikli plakaya ekleyin. Hücrelerin kuyucukların dibine yapışmasını sağlamak için% 5 karbondioksit ile plakayı 37 santigrat derecede 20 dakika boyunca inkübe edin.
Net oluşumunu indüklemek için, MOI100 bakteri uyaranlarını ve MOI1'de psödohifaları ekleyin. Ayrıca biyokimyasal uyaranları ekleyin ve 50 mikrolitre HBSS ekleyerek uyaran olmadan bir kontrol hazırlayın. Kuyu başına 400 mikrolitrelik son bir hacim elde edin ve 140 RPM'de bir plaka çalkalayıcıda 30 saniye boyunca karıştırın.
Daha sonra 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte dört saat kuluçkaya yatırın. Net indüksiyondan sonra, süpernatantı dikkatlice pipetleyerek kuyucuklardan çıkarın ve hücreleri 30 dakika boyunca 300 mikrolitre% 4 paraformaldehit ile sabitleyin. Hücreleri santrifüj yapmadan 200 mikrolitre 1X PBS ile yıkayın ve 30 dakika boyunca 200 mikrolitre bloke edici tampon ekleyin.
LL37 boyası için, hücreleri 10 dakika boyunca 1X PBS'de 200 mikrolitre% 0.2Triton X-100 ile geçirgenleştirin ve 1X PBS ile iki kez yıkayın. Kapak fişlerini cam slaytlara monte edin. DNA, hücreleri iki mikrolitre DAPI ile boyar ve konfokal floresan mikroskobu ile analiz edilene kadar eksi 20 santigrat derecede depolar.
Dinamik hücresel fazlar çift yoğunluklu gradyan saflaştırmadan sonra görselleştirildi. Tipik nötrofil morfolojisi sağ boyama ile doğrulandı. Hücreler ayrıca membran bozulması olmadan tripan mavisi dışlaması ile gözlenen optimal canlılık gösterdi.
SSC'ye karşı FSC'nin akış sitometrisi ile analizi, yüksek hücre saflığına sahip PMN'ye karşılık gelen bir popülasyonu doğruladı. 7AAD leke hücrelerine karşı boyanmamış hücreler için PMN nokta grafikleri ve bunların ilgili histogramları, geçirgenleştirilmiş kontrol hücrelerine kıyasla yeni izole edilmiş nötrofillerde yüksek hücre canlılığını göstermiştir. Nötrofiller kimyasal ve mikrobiyal uyarıcılarla uyarıldıktan sonra, NET'ler DNA DPI ve anti-LL37 kullanılarak floresan mikroskopi ile görselleştirildi.
Mikroorganizmalar CFSE ile önceden boyandı. PMA'ya bağlı intihar ağı oluşumu LL37 ile birlikte lokalizasyon ile gösterilir. HOCI ile oluşturulan NET'ler, hayati NET oluşumuna karşılık gelen hücre dışı alanda küçük DNA dispersiyonu gösterdi.
Fungal psödohifaların neden olduğu NET, hayati NET oluşumunun karakteristik filamentli yapıları ile hücre dışı boşluğa salınan düşük DNA konsantrasyonları gösterdi. S.aureus vital NET oluşumu gösterirken, P.aeruginosa, intihar NET oluşumunu gösteren LL37 ile birlikte lokalize olan bulutlu bir morfoloji ile büyük konsantrasyonlarda DNA salınımını indükledi. Çift yoğunluklu gradyan metodolojisi gerçekleştirmek, nötrofillerin yüksek saflığını ve yaşayabilirliğini elde etmemizi sağlar.
Ve yıkamaları yükseltiriz, yapılarına zarar vermekten kaçınırız. Bu yöntemi takiben, NET üretimindeki maddelerin veya hücrelerin etkisini, ayrıca bazı mekanizmalarda yer alıp almadıklarını veya otoimmün hastalıkta tedavi olarak kullanılıp kullanılmadıklarını analiz edebiliriz.
