1. Insan kanı PMN İzolasyon Antikoagülan olarak EDTA veya heparin (10 U / ml) ile 24 ml insan kanı hakkında kullanın. <ol><li> 6 ml, 15 ml Falcon tüp Histopaque 1119 ekleyin ve dikkatle üst katmanı 5 ila 7 ml tam kan. </li><li> Frenleme olmadan 20 dakika boyunca 800 xg&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Sarımsı ve açık üst katman aspire edin ve atın ve taze Falcon tüpler içine granülositler içeren alt kırmızımsı faz transfer. </li><li> 300 x g. 10 dakika PBS ve santrifüj Falcon tüpleri dolum hücreleri yıkayın </li><li> Bu arada% 100 Percoll, 2 ml 10x PBS, 18 ml Percoll karıştırılarak bir solüsyon hazırlanır. 1x PBS,% 85,% 80,% 75,% 70 ve% Percoll 65 4 ml çözümler hazırlıyoruz. </li><li> Katmanlama 2 ml azalan birbirlerinin üstüne her yüzde bir Percoll degrade ile 2 Falcon tüpleri hazırlayın. </li><li> Santrifüj süpernatantı kaldırdıktan sonra, 4 ml PBS pelet ve tekrar süspansiyon tortulaşmış hücreleri birleştirir. </li><li> Her degradelerin üzerine tabanda dikkatli katman 2 ml. </li><li> Frenleme olmadan 20 dakika boyunca 800 xg&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Santrifüj üst katmanı kaldırmak ve% 65 katmanlı en PBMC&#39;ler ile,% 85 katmanlı kadar yeni Falcon tüpler içine beyaz kalan interphases toplamak sonra. </li><li> 300 x g. 10 dakika PBS ve santrifüj ile Falcon tüpleri dolum hücreleri yıkayın </li><li> PBS 2ml supernatant ve tekrar süspansiyon tortulaşmış hücreleri (genellikle&gt;% 95 PMN.) Çıkarın. </li><li> Hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. </li></ol> 2. Aktive PMN <ol><li> Steril bir 13 mm yuvarlak cam kapak kayma (1,5) her bir kuyunun içine koyarak 24-iyi bir hücre kültürü tabak hazırlayın </li><li> Tohum 2 x 10 500μl RPMI 5 hücreleri de başına (% 2 insan serum albümin içeren) ve 37 CO 2 inkübatör 1s inkübe ° C. </li><li> Bu arada RPMI 600 nM PMA çözüm hazırlamak ve 100μl de ortalama hücreleri ekleyin. CO 2 inkübatör 4 saat 15 dakika inkübe 37 ° ° C. </li><li> % 4 (son konsantrasyon) PBS içinde çözünmüş paraformaldehid hücreleri saptamak. </li></ol> PMA bir pozitif kontrol olarak hizmet veren ve bugüne kadar NET oluşumunu uyarmak için en güçlü bir ajandır. Alternatif olarak, patojenlerin diğer uyaranlara veya co-ekimi NET indüksiyonu için kullanılabilir. Zaman kursu devam ederken ek paralel olarak hazırladığı numuneler NET oluşumu ilgili durumu kontrol edilebilir. Sabit olmayan hücrelere Sytox Yeşil (Invitrogen) gibi olmayan bir permeant DNA boya eklenirse, sadece ekstraselüler DNA tespit edilecektir. Yeni NET&#39;ler oluşumu şekilde her zaman noktası için, Sytox varlığı bozulmuş olduğundan bir paralel örnek kullanılmalıdır. 3. NET immunolabeling tarafından tespit NET&#39;ler fiksasyon sonra bile çok kırılgan olduğu ve büyük bir dikkatle manipüle edilebilir aksi takdirde çoğunluğu hazırlanması sırasında kaybolan alacak. <ol><li> 24 kuyu kültür plaka takılı hücreleri ile cam kapak fişleri kavisli bir iğne ile kenarında yukarı kaldırarak dikkatlice çıkarın ve ince bir forseps ile ele geçirmek. PBS bir damla ters kapak kayma koyun. Bu bir test tüpü standı kapsayan bir Parafilm kağıda yapılabilir. 3 kez 5 dakika boyunca bu gibi yıkayın. </li><li> Triton X-100 RT az 1 dakika hücreleri permeabilize için% 0.5 &#39;lik bir düşüş aynı şekilde kapak fişleri inkübe edin. 1 dakika için 3 kez PBS içinde yıkayın. </li><li> Parafilm ve ıslak mendil ile nemli bir oda hazırlayın. Lay kapağı engelleme tampon (% 5 eşek serum) bir damla baş aşağı kayar ve 37 ° 30 dakika inkübe ° C. </li><li> Tampon engelleme primer antikorlar, örneğin ms anti Histon ve rb anti nötrofil elastaz, sulandırınız. </li><li> Primer antikor bir damla üzerine tampon engelleme doğrudan nemli odasında fişleri kapağı ve 37 az 1 saat süreyle inkübe transfer ° C </li><li> PBS ile 3 kez 5 dakika yıkayınız. </li><li> Ikincil antikorlar, örneğin dk anti ms Cy2 ve tampon engelleme dk anti-rb Cy3 sulandırınız. </li><li> Sekonder antikoru bir damla üzerine nemli odasına fişleri kapağı ve 1 saat boyunca inkübe 37 aktarma ° C. </li><li> PBS ile 3 kez 5 dakika yıkayınız. Leke DNA UV eksitasyon veya Draq5 kadar kırmızı uyarma için ihtiyaç ve dist ile iki kez yıkamak Hoechst 33.342 (1 mcg / ml) ile 5 dakika ya, floresan mikroskopi seçenekleri bağlı. su. </li><li> Bir cam slayt üzerine Mowiol 20μl damla ayarlayın ve hücreleri ile kapak fişleri ters monte. Hücreleri kapak kayma ve slayt arasında olmak zorunda. Mowiol, açılan kapağı açılan kayma yerleştirilmiş homojen kalınlıkta ince bir tabaka oluşturacak. Normalde, örnek basın gerek yoktur. Olmayan daldırma lens kullanmak istiyorsanız, numunenin incelenmesi için hazır.Daldırma lensler ile mikroskobik inceleme için, Mowiol örnek kenarında katılaşmış kadar yaklaşık 1 saat için örnek kuru sağlar. </li></ol> 4. Hazırlanması NET&#39;ler Taramalı Elektron Mikroskobu (SEM) <ol><li> Hücreleri,% 2,5 glutaraldehid ile 24 plaka cam kapak bordroları düzeltmek Mesaj. </li><li> 24 kuyu kültür plaka hücreleri içeren cam kapak fişleri çıkartın ve bir damla su baş aşağı koymak. 3 kez 5 dakika boyunca bu gibi yıkayın. </li><li> 30 dakika süreyle% 0,5 OsO4 ve inkübe içeren 24-kuyu hücre kültürü plakası kapak fişleri geri aktarın. </li><li> 24 kuyu kültür plaka hücreleri içeren cam kapak fişleri çıkartın ve bir damla su baş aşağı koymak. 3 kez 5 dakika boyunca bu gibi yıkayın. </li><li> 30 dakika süreyle% 1 tannik asit ve inkübe içeren 24-kuyu hücre kültürü plakası kapak fişleri geri aktarın. </li><li> Adımları tekrarlayın 4,2-4,4 </li><li> Aşağıdaki rejimi (5 dk her) aracılığıyla dehydrate: <ul><li> % 30 etanol </li><li> % 50 etanol </li><li> % 70 etanol </li><li> % 80 etanol </li><li> % 90 etanol </li><li> % 100 etanol </li><li> % 100 etanol </li><li> % 100 etanol </li></ul></li><li> Kritik nokta kurutma makinesi ve kuru örnekler sığar kapağı aktarın. </li><li> Coat yüzey ince bir tabaka evaporatör kullanılarak 5nm platin / karbon tabaka ile örnek </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar: Izolasyon yöntem genellikle,% 95 daha yüksek bir saflığa sahip unstimulated yaşayabilir nötrofil verir. Stimülasyon sonrasında farklı zaman noktalarında sabit, NETosis düzleşme hücre, nükleer lobülleri kaybı, granül kaybı ve nükleer (yani histon) ve granül (yani artan bir örtüşme yol açar çekirdeği bütünlüğünü sırasında morfolojik değişiklikler immün protokol sırasını gösterir nötrofil elastaz) boyama. Bu protokol, nötrofil ile patojenlerin özel etkileşimlerini analiz etmek için bir başlangıç ​​noktası olarak hizmet verebilir. Bu etkileşim, Taramalı Elektron Mikroskobu için hazırlık protokolü kullanılarak daha ayrıntılı olarak disseke edilebilir. NET Floresans NET bileşenleri (mavi = DNA, kırmızı = histon, yeşil = nötrofil elastaz) lekeli uyarılan nötrofillerin örnek. NET lokalizasyonu, nükleer DNA ve histon yerelleştirme ve nötrofil elastaz için granül desen görüntüleri yanı sıra, göstermektedir. SEM PMA stimülasyon Olmayan uyarılır ve PMA-uyarılan nötrofillerin gösteren tarama elektron mikrografı. Stimülasyon sonra, nötrofil düzleştirmek ve NET&#39;ler üretmek. SEM NET&#39;ler ve Shigella NET&#39;ler sıkışıp Shigella bakterileri Yüksek çözünürlüklü SEM görüntü.

<ol>
	<li>Brinkmann, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303, 1532-1535 .</li><li>Urban, C. F., Reichard, U., Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+capture+and+kill+Candida+albicans+yeast+and+hyphal+forms.">Neutrophil extracellular traps capture and kill Candida albicans yeast and hyphal forms.</a> Cell Microbiol. 8, 668-676 (2006).</li><li>M, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leishmania+amazonensis+promastigotes+induce+and+are+killed+by+neutrophil+extracellular+traps.">Leishmania amazonensis promastigotes induce and are killed by neutrophil extracellular traps.</a> PNAS. 106, 6748-6753 (2009).</li><li>Buchanan, J. T., Simpson, A. J., Aziz, R. K., Liu, G. Y., Kristian, S. A., Kotb, M., Feramisco, J., Nizet, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNase+expression+allows+the+pathogen+group+A+Streptococcus+to+escape+killing+in+neutrophil+extracellular+traps.">DNase expression allows the pathogen group A Streptococcus to escape killing in neutrophil extracellular traps.</a> Curr Biol. 14, 396-400 (2006).</li><li>Fuchs, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+cell+death+program+leads+to+neutrophil+extracellular+traps.">Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps.</a> J Cell Biol. 176, 231-241 (2007).</li><li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beneficial+suicide:+why+neutrophils+die+to+make+NETs.">Beneficial suicide: why neutrophils die to make NETs.</a> Nat Rev Microbiol. 5, 577-582 (2007).</li><li>Aga, E., Katschinski, D. M., van Zandbergen, G., Laufs, H., Hansen, B., Muller, K., Solbach, W., Laskay, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+the+spontaneous+apoptosis+of+neutrophil+granulocytes+by+the+intracellular+parasite+Leishmania+major.">Inhibition of the spontaneous apoptosis of neutrophil granulocytes by the intracellular parasite Leishmania major.</a> J Immunol. , 169-898 (2002).</li></ol>

Sağlanan protokolü önemli saflık olmayan uyarılan nötrofillerin izolasyon, indüksiyon NET oluşumu ve NETosis sırasında morfolojik değişiklikleri analiz sağlayacaktır. Itina ile örneklerin tutarken, yani en gevşek bağlı NET&#39;ler kaybına neden olacak ağır yıkama koşullarına kaçınarak, farklı stimülasyon koşullar altında NET formasyonu (süresi, uyaran) miktarı mukayese edilebilir. Nötrofil / patojen etkileşimleri, uyaranlara dizisi, diğer bağışıklık hücreleri ile etkileşim: Bu bağlamda, verilen protokoller daha sofistike senaryolar analiz yöntemleri kurmak için bir başlangıç ​​noktası olarak hizmet verebilir.

neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them

Periferik kan lökosit nötrofil granülositler en bol bulunan bir grup. Profesyonel fagositler olarak, yutma bakteri ve hücre onları öldürmek phagosome ile antimikrobiyal granül sigorta. Biz nötrofil mikroorganizmaları öldüren ek bir yolu olduğunu bulundu: Etkinleştirme üzerine, birlikte ekstrasellüler lifler oluştururlar granül proteinleri ve kromatin serbest bağlama patojenler. Bu yeni yapılar, veya nötrofil Ekstrasellüler Tuzaklar (NET), virülans faktörleri aşağılamak ve bakteri 1, 2 ve parazitler 3 mantar öldürmek. NET&#39;ler yapısal omurga DNA ve DNases varlığı hızla bozulmuş. Böylece, DNases ifade bakteri 4 daha öldürücü. TEM, SEM, immünofloresan ve canlı hücre görüntüleme teknikleri birleştirerek bağıntılı mikroskopi kullanılarak stimülasyon üzerine, nötrofil çekirdekleri şekillerini kaybeder ve ab-ve heterokromatin homojenize gösterebilirim. Daha sonra, nükleer zarf ve granül membranlar NET bileşenleri karıştırma izin parçalanır. Son olarak, NET&#39;ler hücre zarı kesmeleri olarak yayımlanır. Bu hücre ölüm programı (NETosis) apoptoz ve nekroz farklıdır ve NADPH oksidaz 5 Reaktif Oksijen Türleri nesil bağlıdır. Nötrofil ekstrasellüler tuzakları akut inflamasyon bölgelerinde bol miktarda bulunmaktadır. NET&#39;ler bağlama mikroorganizmaların ki, yayılmasını önlemek ve virülans faktörleri düşürebilir ve böylece nötrofil hatta ömrü ötesinde antimikrobiyal fonksiyonu yerine getirmek için izin patojenleri öldürmek için yüksek antimikrobiyal ajanların yerel yoğunlaşmasını sağlamak, doğuştan gelen bağışıklık yanıtının bir formu olarak görünür. Kanıtlar artmaktadır, ancak bu NET&#39;ler olan hastalıklar da katılıyor oto-immün sendromlar kısırlık 6 aralığı. Biz, insan periferik kan 7 ila nötrofil Granülositler izole ve NET&#39;ler oluşturmak için onları teşvik etmek için yöntemleri açıklanmaktadır . Ayrıca ışık ve elektron mikroskobu NET&#39;ler görselleştirmek için protokolleri içerir.

Watch this Scientific Journal Video about Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them at JoVE.com

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

Nötrofil Ekstrasellüler Tuzaklar (NET), patojen bakteriler, mantarlar ve parazitler mücadele için önemli bir doğuştan gelen bağışıklık mekanizması. Burada insan kan nötrofil granülositler izole etmek ve NET&#39;ler oluşturmak için bunları etkinleştirmek yöntemleri açıklanmaktadır. Biz ışık ve elektron mikroskobu NET&#39;ler görselleştirmek için hazırlama teknikleri mevcut.

Nötrofil Ekstrasellüler Tuzaklar: Onları nasıl oluşturun ve görselleştirin için

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

neutrophil-extracellular-traps-how-to-generate-and-visualize-them

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

86.0K Görüntüleme.  Max Planck Institute for Infection Biology. Nötrofil Ekstrasellüler Tuzaklar (NET), patojen bakteriler, mantarlar ve parazitler mücadele için önemli bir doğuştan gelen bağışıklık mekanizması. Burada insan kan nötrofil granülositler izole etmek ve NET'ler oluşturmak için bunları etkinleştirmek yöntemleri açıklanmaktadır. Biz ışık ve elektron mikroskobu NET'ler görselleştirmek için hazırlama teknikleri mevcut.

Video: Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role in fighting infections, recent research has demonstrated that they may be involved in many other disease processes, including cancer progression. Isolating purified NETs is a crucial element to allow the study of these functions.
In this video, we demonstrate a simplified method of cell free NET isolation from human whole blood using readily available reagents. Isolated NETs can then be used for immunofluorescence staining, blotting or various functional assays. This enables an assessment of their biologic properties in the absence of the potential confounding effects of neutrophils themselves.
A density gradient separation technique is employed to isolate neutrophils from healthy donor whole blood. Isolated neutrophils are then stimulated by phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) to induce NETosis. Activated neutrophils are then discarded, and a cell-free NET stock is obtained.
We then demonstrate how isolated NETs can be used in an adhesion assay with A549 human lung cancer cells. The NET stock is used to coat the wells of a 96 well cell culture plate O/N, and after ensuring an adequate NET monolayer formation on the bottom of the wells, CFSE labeled A549 cells are added. Adherent cells are quantified using a Nikon TE300 fluorescent microscope. In some wells, 1000U DNAse1 is added 10 min before counting to degrade NETs

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps NETs Isolation and Handling

In the following protocol, we describe a very simple way to isolate Neutrophil Extracellular traps (NETs) from human whole blood using readily available reagents. We then demonstrate how the isolated NETs can be used in an in vitro adhesion assay with cancer cells.

Basitleştirilmiş İnsan Nötrofil Ekstrasellüler Tuzaklar (NET) İzolasyon ve Taşıma

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of lipids. The function of lipids (e.g., in host-pathogen interactions or host entry) has been reported to play a crucial role in cellular processes. Here, we show a method to determine lipid composition, with a focus on the cholesterol level of primary blood-derived neutrophils, by HPTLC in comparison to high performance liquid chromatography (HPLC). The aim was to investigate the role of lipid/cholesterol alterations in the formation of neutrophil extracellular traps (NETs). NET release is known as a host defense mechanism to prevent pathogens from spreading within the host. Therefore, blood-derived human neutrophils were treated with methyl-&#946;-cyclodextrin (M&#946;CD) to induce lipid alterations in the cells. Using HPTLC and HPLC, we have shown that M&#946;CD treatment of the cells leads to lipid alterations associated with a significant reduction in the cholesterol content of the cell. At the same time, M&#946;CD treatment of the neutrophils led to the formation of NETs, as shown by immunofluorescence microscopy. In summary, here we present a detailed method to study lipid alterations in neutrophils and the formation of NETs.

Lipids are known to play an important role in cellular functions. Here, we describe a method to determine the lipid composition of neutrophils, with emphasis on the cholesterol level, by using both HPTLC and HPLC to gain a better understanding of the underlying mechanisms of neutrophil extracellular trap formation.

Yöntemler lipid Nötrofiller değişiklikler ve Nötrofil Ekstrasellüler Tuzaklar sonraki oluşumunu incelemek

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal microscopy methods to visualize macrophage extracellular traps (METs). These extracellular traps are defined by the presence of extracellular chromatin with co-expression of other components such as granule proteases, citrullinated histones, and peptidyl arginase deiminase (PAD). The expression of METs is generally measured after exposure to a stimulus and compared to un-stimulated samples. Samples are also included for background and isotype control. Cells are analyzed using well-defined image analysis software. Confocal microscopy may be used to define the presence of METs both in vitro and in vivo in lung tissue.

Macrophage extracellular traps are a newly described entity. This article will concentrate on confocal microscopy methods and how they are visualized in vitro and in vivo from lung samples.

Makrofaj hücre dışı tuzaklar Confocal mikroskobu kullanılarak görüntülenmesi

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. Immunofluorescence microscopy and image-based quantification methods remain important tools to quantitate neutrophil extracellular trap formation. However, there are key limitations to the immunofluorescence-based methods that are currently available for quantifying NETs. Manual methods of image-based NET quantification are often subjective, prone to error and tedious for users, especially non-experienced users. Also, presently available software options for quantification are either semi-automatic or require training prior to operation. Here, we demonstrate the implementation of an automated immunofluorescence-based image quantification method to evaluate NET formation called NETQUANT. The software is easy to use and has a user-friendly graphical user interface (GUI). It considers biologically relevant parameters such as an increase in the surface area and DNA:NET marker protein ratio, and nuclear deformation to define NET formation. Furthermore, this tool is built as a freely available app, and allows for single-cell resolution quantification and analysis.

Here, we present a protocol for generating neutrophil extracellular traps (NETs) and operating NETQUANT, a fully automatic software option for quantification of NETs in immunofluorescence images.

NETQUANT Kullanarak Nötrofil Ekstrasellüler Tuzakların Otomatik Görüntü Tabanlı Niceliği

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. ...

A High-throughput Assay to Assess and Quantify Neutrophil Extracellular Trap Formation

Neutrophil extracellular traps (NETs) are immunogenic extracellular DNA structures that can be released by neutrophils upon a wide variety of triggers. NETs have been demonstrated to serve as an important host defense mechanism that traps and kills microorganisms. On the other hand, they have been implicated in diverse systemic autoimmune diseases. NETs are immunogenic and toxic structures that contain a pool of relevant autoantigens including anti-neutrophil cytoplasmic antibodies (ANCA)-associated vasculitis (AAV) and systemic lupus erythematosus (SLE). Different forms of NETs can be induced depending on the stimulus. The amount of NETs can be quantified using different techniques including measuring DNA release in supernatants, measuring DNA-complexed with NET-molecules like myeloperoxidase (MPO) or neutrophil elastase (NE), measuring the presence of citrullinated histones by fluorescence microscopy, or flow cytometric detection of NET-components which all have different features regarding their specificity, sensitivity, objectivity, and quantity. Here is a protocol to quantify ex vivo NET formation in a highly-sensitive, high-throughput manner by using three-dimensional immunofluorescence confocal microscopy. This protocol can be applied to address various research questions about NET formation and degradation in health and disease.

This protocol describes a highly sensitive and high throughput neutrophil extracellular trap (NET) assay for the semi-automated quantification of ex vivo NET formation by immunofluorescence three-dimensional confocal microscopy. This protocol can be used to evaluate NET formation and degradation after different stimuli and can be used to study potential NET-targeted therapies.

Nötrofil hücre dışı tuzak oluşumu ölçmek ve değerlendirmek için bir yüksek-den geçerek tahlil

Neutrophil extracellular traps (NETs) are immunogenic extracellular DNA structures that can be released by neutrophils upon a wide variety of triggers. ...

Identification of Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescence Microscopy

Neutrophil extracellular traps (NETs), composed of cell-free DNA (cfDNA) and proteins like histones and neutrophil elastase (NE), are released by neutrophils in response to systemic inflammation or pathogens. Although NETs have previously been shown to augment clot formation and inhibit fibrinolysis in humans and dogs, the role of NETs in cats with cardiogenic arterial thromboembolism (CATE), a life-threatening complication secondary to hypertrophic cardiomyopathy, is unknown. A standardized method to identify and quantify NETs in cardiogenic arterial thrombi in cats will advance our understanding of their pathological role in CATE. Here, we describe a technique to identify NETs in formaldehyde-fixed and paraffin-embedded thrombi within the aortic bifurcation, extracted during necropsy. Following deparaffinization with xylene, aortic sections underwent indirect heat-induced antigen retrieval. Sections were then blocked, permeabilized, and ex vivo NETs were identified by colocalization of cell-free DNA (cfDNA), citrullinated histone H3 (citH3), and neutrophil elastase (NE) using immunofluorescence microscopy. To optimize the immunodetection of NETs in thrombi, autofluorescence of tissue elements was limited by using an autofluorescence quenching process prior to microscopy. This technique could be a useful tool to study NETs and thrombosis in other species and offers new insights into the pathophysiology of this complex condition.

We describe a method to identify neutrophil extracellular traps (NETs) in formaldehyde-fixed and paraffin-embedded feline cardiogenic arterial thrombi using heat-induced antigen retrieval and a double immunolabeling protocol.

İmmünofluoresans Mikroskobu kullanılarak Parafin Gömülü Kedi Arteriyel Trombisinde Nötrofil Ekstrasellüler Tuzakların Belirlenmesi

Neutrophil extracellular traps (NETs), composed of cell-free DNA (cfDNA) and proteins like histones and neutrophil elastase (NE), are released by ...

Morphological and Compositional Analysis of Neutrophil Extracellular Traps Induced by Microbial and Chemical Stimuli

Neutrophils function as the first line of cellular defense in an innate immune response by employing diverse mechanisms, such as the formation of neutrophil extracellular traps (NETs). This study analyzes the morphological and compositional changes in NETs induced by microbial and chemical stimuli using standardized in vitro methodologies for NET induction and characterization with human cells. The procedures described here allow the analysis of NET morphology (lytic or non-lytic) and composition (DNA-protein structures and enzymatic activity), and the effect of soluble factors or cellular contact on such characteristics. Additionally, the techniques described here could be modified to evaluate the effect of exogenous soluble factors or cellular contact on NET composition.
The applied techniques include the purification of polymorphonuclear cells from human peripheral blood using a double density gradient (1.079-1.098 g/mL), guaranteeing optimal purity and viability (&#8805; 95%) as demonstrated by Wright's staining, trypan blue exclusion, and flow cytometry, including FSC versus SSC analysis and 7AAD staining. NET formation is induced with microbial (Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, and Candida albicans) and chemical (phorbol myristate acetate, HOCl) stimuli, and the NETs are characterized by DNA-DAPI staining, immunostaining for the antimicrobial peptide cathelicidin (LL37), and quantification of enzymatic activity (neutrophil elastase, cathepsin G, and myeloperoxidase). The images are acquired through fluorescence microscopy and analyzed with ImageJ.

Presented here is a protocol for the induction and analysis of in vitro neutrophil extracellular traps (NETs). Quantification of DNA, cathelicidin (LL37), and enzyme activity yielded data that show the variability in the composition and morphology of NETs induced by microbial and chemical stimuli under similar controlled conditions.

Mikrobiyal ve Kimyasal Uyaranlar Tarafından İndüklenen Nötrofil Hücre Dışı Tuzakların Morfolojik ve Bileşimsel Analizi

Neutrophils function as the first line of cellular defense in an innate immune response by employing diverse mechanisms, such as the formation of ...

Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA

Certain stimuli, such as microorganisms, cause neutrophils to release neutrophil extracellular traps (NETs), which are basically web-like structures composed of DNA with granule proteins, such as myeloperoxidase (MPO) and neutrophil elastase (NE), and cytoplasmic and cytoskeletal proteins. Although interest in NETs has increased recently, no sensitive, reliable assay method is available for measuring NETs in clinical settings. This article describes a modified sandwich enzyme-linked immunosorbent assay to quantitatively measure two components of circulating NETs, MPO-DNA and NE-DNA complexes, which are specific components of NETs and are released into the extracellular space as breakdown products of NETs. The assay uses specific monoclonal antibodies for MPO or NE as the capture antibodies and a DNA-specific detection antibody. MPO or NE binds to one site of the capture antibody during the initial incubation of samples containing MPO-DNA or NE-DNA complexes. This assay shows good linearity and high inter-assay and intra-assay precision. We used it in 16 patients with COVID-19 with accompanying acute respiratory distress syndrome and found that the plasma concentrations of MPO-DNA and NE-DNA were significantly higher than in the plasma obtained from healthy controls. This detection assay is a reliable, highly sensitive, and useful method for investigating the characteristics of NETs in human plasma and culture supernatants.

We present a protocol for a modified sandwich enzyme-linked immunosorbent assay technique to quantitatively measure two components of neutrophil extracellular trap remnants, myeloperoxidase conjugated-DNA and neutrophil elastase conjugated-DNA complexes,derived from activated neutrophils.

Nötrofil Hücre Dışı Tuzaklardan Miyeloperoksidaz-DNA ve Nötrofil Elastaz-DNA Komplekslerinin Modifiye Sandviç ELISA Kullanılarak Miktarının Belirlenmesi

Certain stimuli, such as microorganisms, cause neutrophils to release neutrophil extracellular traps (NETs), which are basically web-like structures ...

Nötrofil hücre dışı tuzakları görselleştirmek için boyama ve görüntüleme

Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in autoimmune diseases and sterile inflammation. They are web-like structures composed of double-stranded DNA filaments, histones, and antimicrobial proteins. Once released, NETs can trap and kill extracellular pathogens in blood and tissue. Furthermore, NETs participate in homeostatic regulation by stimulating platelet adhesion and coagulation. However, the dysregulated production of NETs has also been associated with various diseases, including sepsis or autoimmune disorders, which makes them a promising target for therapeutic intervention. Apart from electron microscopy, visualizing NETs using immunofluorescence imaging is currently one of the only known methods to demonstrate NET interactions in tissue. Therefore, various staining methods to visualize NETs have been utilized. In the literature, different staining protocols are described, and we identified four key components showing high variability between protocols: (1) the types of antibodies used, (2) the usage of autofluorescence-reducing agents, (3) antigen retrieval methods, and (4) permeabilization. Therefore, in vitro immunofluorescence staining protocols were systemically adapted and improved in this work to make them applicable for different species (mouse, human) and tissues (skin, intestine, lung, liver, heart, spinal disc). After fixation and paraffin-embedding, 3 &#181;m thick sections were mounted onto slides. These samples were stained with primary antibodies for myeloperoxidase (MPO), citrullinated histone H3 (H3cit), and neutrophil elastase (NE) according to a modified staining protocol. The slides were stained with secondary antibodies and examined using a widefield fluorescence microscope. The results were analyzed according to an evaluation sheet, and differences were recorded semi-quantitatively.
Here, we present an optimized NET staining protocol suitable for different tissues. We used a novel primary antibody to stain for H3cit and reduced non-specific staining with an autofluorescence-reducing agent. Furthermore, we demonstrated that NET staining requires a constant high temperature and careful handling of samples.

Yazar Spotlight: İnsan ve Fare Dokularında Nötrofil Hücre Dışı Tuzaklar Görüntüleme 

Neutrophil extracellular traps (NETs) are associated with various diseases, and immunofluorescence is often used for their visualization. However, there are various staining protocols, and, in many cases, only one type of tissue is examined. Here, we establish a generally applicable protocol for staining NETs in mouse and human tissue.

İnsan ve Fare Dokularında Nötrofil Hücre Dışı Tuzakların İmmünofloresan Görüntülemesi

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in ...