Bu protokol, temel adipojenik transkripsiyon faktörlerini, olgun adiposit belirteçlerini eksprese eden ve olgun kahverengi adipositlerin termojenik potansiyeline ve morfolojik fenotipine sahip kahverengi adipositlerin verimli ve tekrarlanabilir farklılaşmasına izin verir. Bu, yenidoğan farelerin interskapular kahverengi yağ dokusundan olgun kahverengi adipositlerin özelliklerine sahip hücreler elde etmek için basit ve tekrarlanabilir iki fazlı bir farklılaşma prosedürüdür. Bu protokol, obezite tedavisi için bir hedef olarak kahverengi yağ dokusunun aktivasyon mekanizmalarının incelenmesine izin verir.
Lipodistrofinin patofizyolojisinde yer alan mekanizmaların belirlenmesi için bir model olmuştur. Bu tekniği ilk kez uygulamanın zor olması beklenir. Başarılı sonuçlar elde etmek için ayrıntılı bir protokole sahip olmak ve kritik noktaları vurgulamak çok önemlidir.
Başlamak için, ötenazi yapılmış fareyi yüzüstü pozisyona getirin ve keskin bir makas kullanarak hayvanın sırtının orta seviyesinde bir santimetre uzunluğunda bir cilt kesisi yapın. Cildi dikkatlice çıkarın, iBAT'ı küçük bir makas kullanarak karkastan cerrahi olarak ayırın. Lobları bağımsız olarak çıkarmak için her iki iBAT lobunu da eğri uçlu pense kullanarak hasat edin.
İki lobu oda sıcaklığında 1,5 mililitre steril PBS içeren plastik bir tüpe yerleştirin. iBAT dokularını kollajenaz tip iki sindirim tamponunda 37 derecede 45 dakika boyunca 800 RPM'de sürekli hafifçe çalkalayarak inkübe edin. Bir P1000 mikropipet ve filtre uçları kullanarak yukarı ve aşağı pipetleyerek kollajenaz tip iki sindirim tamponundaki doku süspansiyonunu mekanik olarak bozun.
Her örnek için yeni bir uç kullanın. Ayrılmış dokuları ayrı ayrı 100 mikrometre hücre süzgeçlerinden yeni 1.5 mililitrelik tüplere geçirin. Filtrelenmiş doku örneklerine 500 mikrolitre ACK tamponu ekleyin.
Tüpleri dört ila beş kez ters çevirin ve oda sıcaklığında dört dakika inkübe edin. Daha sonra süspansiyonları 40 mikrometrelik bir hücre süzgecinden geçirerek bir P1000 mikropipet ve filtrelenmiş uçlar kullanarak yeni 1,5 mililitrelik tüplere geçirin. Centrifusion, metin el yazmasında açıklandığı gibi peleti yeniden süspanse eder.
Daha sonra, her bir numuneyi, her bir oyuğa bir mililitre süspansiyon ekleyerek 24 oyuklu bir kültür plakasının altı oyuğuna tohumlayın. Diferansiye olmayan preadipositler çok düşük veya saptanamayan ppar-gama, C/ebp-alfa, perilipin 1 ve CD36 seviyeleri gösterdi. Buna karşılık, bu belirteçler farklılaşmanın yedinci gününde önemli ölçüde daha yüksekti.
Kahverengi preadipositlerde çoklu lipid damlacıklarının birikmesi, daha önce yayınlanan sonuçlarla tutarlıydı. Farklılaşmanın yedinci gününde mitokondriyal kütle markörü TOM 20 ve oksidatif fosforilasyon kompleksi protein seviyelerinde önemli bir artış gözlendi. Bu hücre tipinin iyi niyetli bir belirteci olan UCP1, farklılaşmamış preadipositlerde tespit edilmezken, farklılaşmanın yedinci gününde olgun kahverengi adipositlerde büyük ölçüde eksprese edildi.
Mitokondri, sıfırıncı günde uzun bir boru şeklindeki şeklinden, yedinci günde yuvarlak veya fasulye benzeri bir şekle doğru evrimleşti. Mitokondriyal iç yapı da adipogenez ile modifiye edildi ve bu da paralel paketlenmiş kristalin daha yüksek yoğunluğuna neden oldu. Daha da önemlisi, mitokondriyal, farklılaşmış kahverengi adipositlerdeki lipid damlacıkları ile yakından ilişkiliydi, bu nedenle mitokondrinin dış zarı ile lipid damlacıklarının yüzeyleri arasında, yüksek çözünürlüklü transmisyon elektron mikroskobu ile bile fark edilebilir bir mesafe tespit edilemedi.
İnterskapular yağ dokusunun cerrahi olarak çıkarılması kritiktir. Verimsiz bir doku miktarı, farklılaşacak hücrelerin mevcudiyetini sınırlar. Bu görüntüleme tekniği, in vitro olarak farklılaşmış kahverengi adipositlerin morfolojisini karakterize etmeye yardımcı olur.
Mitokondriyal fonksiyon, beta androjenik aktivasyon ve otofajik inhibisyon için testler yapmak mümkündür.
