Yazarların gibi yazının redaksiyon için veri ve Dr. B. Grötsch hazırlamak için Dr. J. Luther ve K. Ubieta teşekkür ederim. Bu çalışma, Deutsche Forschungsgemeinschaft (BO3811 / 1-1-Emmy Noether) tarafından desteklenmiştir.

<ol>
	<li>Gong, Z., Muzumdar, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+function,+type+2+diabetes,+and+metabolism+in+aging.">Pancreatic function, type 2 diabetes, and metabolism in aging.</a> Int J Endocrinol. , 320482 (2012).</li><li>Deng, Y., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipokines+as+novel+biomarkers+and+regulators+of+the+metabolic+syndrome.">Adipokines as novel biomarkers and regulators of the metabolic syndrome.</a> Ann N Y Acad Sci. 1212, 1-19 (2010).</li><li>Rezaee, F., Dashty, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Adipose+Tissue+in+Metabolic+System+Disorders+Adipose+Tissue+is+the+Initiator+of+Metabolic+Diseases.">Role of Adipose Tissue in Metabolic System Disorders Adipose Tissue is the Initiator of Metabolic Diseases.</a> J Diabetes Metab. , 008 (2013).</li><li>Rutkowski, J. M., Stern, J. H., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+fat+expansion.">The cell biology of fat expansion.</a> J Cell Biol. 208, 501-512 (2015).</li><li>Ma, X., Lee, P., Chisholm, D. J., James, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+adipocyte+differentiation+in+different+fat+depots;+implications+for+pathophysiology+or+therapy.">Control of adipocyte differentiation in different fat depots; implications for pathophysiology or therapy.</a> Front Endocrinol (Lausanne). 6, 1 (2015).</li><li>Farmer, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+control+of+adipocyte+formation.">Transcriptional control of adipocyte formation.</a> Cell Metab. 4, 263-273 (2006).</li><li>Luther, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+Fra-1+expression+causes+severe+lipodystrophy.">Elevated Fra-1 expression causes severe lipodystrophy.</a> J Cell Sci. 124, 1465-1476 (2011).</li><li>Luther, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fra-2/AP-1+controls+adipocyte+differentiation+and+survival+by+regulating+PPARgamma+and+hypoxia.">Fra-2/AP-1 controls adipocyte differentiation and survival by regulating PPARgamma and hypoxia.</a> Cell Death Differ. , (2014).</li><li>Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+mammalian+O2+homeostasis+by+hypoxia-inducible+factor+1.">Regulation of mammalian O2 homeostasis by hypoxia-inducible factor 1.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 15, 551-578 (1999).</li><li>Kim, W., Kaelin, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+von+Hippel-Lindau+tumor+suppressor+protein:+new+insights+into+oxygen+sensing+and+cancer.">The von Hippel-Lindau tumor suppressor protein: new insights into oxygen sensing and cancer.</a> Curr Opin Genet Dev. 13, 55-60 (2003).</li><li>Aragones, J., Fraisl, P., Baes, M., Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+sensors+at+the+crossroad+of+metabolism.">Oxygen sensors at the crossroad of metabolism.</a> Cell Metab. 9, 11-22 (2009).</li><li>Sun, K., Halberg, N., Khan, M., Magalang, U. J., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+inhibition+of+hypoxia-inducible+factor+1alpha+ameliorates+adipose+tissue+dysfunction.">Selective inhibition of hypoxia-inducible factor 1alpha ameliorates adipose tissue dysfunction.</a> Mol Cell Biol. 33, 904-917 (2013).</li><li>Imai, T., Jiang, M., Chambon, P., Metzger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+adipogenesis+and+lipolysis+in+the+mouse+upon+selective+ablation+of+the+retinoid+X+receptor+alpha+mediated+by+a+tamoxifen-inducible+chimeric+Cre+recombinase+(Cre-ERT2)+in+adipocytes.">Impaired adipogenesis and lipolysis in the mouse upon selective ablation of the retinoid X receptor alpha mediated by a tamoxifen-inducible chimeric Cre recombinase (Cre-ERT2) in adipocytes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 224-228 (2001).</li><li>Clegg, D. J., Brown, L. M., Woods, S. C., Benoit, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gonadal+hormones+determine+sensitivity+to+central+leptin+and+insulin.">Gonadal hormones determine sensitivity to central leptin and insulin.</a> Diabetes. 55, 978-987 (2006).</li><li>Haluzik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+background+(C57BL/6J+versus+FVB/N)+strongly+influences+the+severity+of+diabetes+and+insulin+resistance+in+ob/ob+mice.">Genetic background (C57BL/6J versus FVB/N) strongly influences the severity of diabetes and insulin resistance in ob/ob mice.</a> Endocrinology. 145, 3258-3264 (2004).</li><li>Chomczynski, P., Sacchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-step+method+of+RNA+isolation+by+acid+guanidinium+thiocyanate-phenol-chloroform+extraction.">Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.</a> Analytical biochemistry. 162, 156-159 (1987).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9, 671-675 (2012).</li><li>Planat-Benard, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+human+adipose+lineage+cells+toward+endothelial+cells:+physiological+and+therapeutic+perspectives.">Plasticity of human adipose lineage cells toward endothelial cells: physiological and therapeutic perspectives.</a> Circulation. 109, 656-663 (2004).</li><li>Kusminski, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MitoNEET-driven+alterations+in+adipocyte+mitochondrial+activity+reveal+a+crucial+adaptive+process+that+preserves+insulin+sensitivity+in+obesity.">MitoNEET-driven alterations in adipocyte mitochondrial activity reveal a crucial adaptive process that preserves insulin sensitivity in obesity.</a> Nat Med. 18, 1539-1549 (2012).</li><li>Trajcevski, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+lipid+oxidation+and+maintenance+of+muscle+insulin+sensitivity+despite+glucose+intolerance+in+a+diet-induced+obesity+mouse+model.">Enhanced lipid oxidation and maintenance of muscle insulin sensitivity despite glucose intolerance in a diet-induced obesity mouse model.</a> PLoS One. 8, 71747 (2013).</li><li>Montgomery, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+strain-dependent+variation+in+obesity+and+glucose+homeostasis+in+response+to+high-fat+feeding.">Mouse strain-dependent variation in obesity and glucose homeostasis in response to high-fat feeding.</a> Diabetologia. 56, 1129-1139 (2013).</li><li>de Queiroz, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+driving+retroperitoneal+adipocyte+hypertrophy+and+hyperplasia+in+response+to+a+high-sugar+diet.">Molecular mechanism driving retroperitoneal adipocyte hypertrophy and hyperplasia in response to a high-sugar diet.</a> Mol Nutr Food Res. 58, 2331-2341 (2014).</li><li>Ye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+role+of+adipose+tissue+hypoxia+in+obesity+and+insulin+resistance.">Emerging role of adipose tissue hypoxia in obesity and insulin resistance.</a> Int J Obes (Lond). 33, 54-66 (2009).</li><li>Xiong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+local+corticotropin-releasing+hormone+receptor+2+signalling+pathway+partly+mediates+hypoxia-induced+increases+in+lipolysis+via+the+cAMP-protein+kinase+A+signalling+pathway+in+white+adipose+tissue.">The local corticotropin-releasing hormone receptor 2 signalling pathway partly mediates hypoxia-induced increases in lipolysis via the cAMP-protein kinase A signalling pathway in white adipose tissue.</a> Mol Cell Endocrinol. 392, 106-114 (2014).</li><li>Bozec, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+size+is+controlled+by+Fra-2+through+LIF/LIF-receptor+signalling+and+hypoxia.">Osteoclast size is controlled by Fra-2 through LIF/LIF-receptor signalling and hypoxia.</a> Nature. 454, 221-225 (2008).</li><li>Varia, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pimonidazole:+a+novel+hypoxia+marker+for+complementary+study+of+tumor+hypoxia+and+cell+proliferation+in+cervical+carcinoma.">Pimonidazole: a novel hypoxia marker for complementary study of tumor hypoxia and cell proliferation in cervical carcinoma.</a> Gynecol Oncol. 71, 270-277 (1998).</li><li>Park, M. H., Choi, K. Y., Jung, Y., Min do, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipase+D1+protein+coordinates+dynamic+assembly+of+HIF-1alpha-PHD-VHL+to+regulate+HIF-1alpha+stability.">Phospholipase D1 protein coordinates dynamic assembly of HIF-1alpha-PHD-VHL to regulate HIF-1alpha stability.</a> Oncotarget. 5, 11857-11872 (2014).</li><li>Tennant, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactivating+HIF+prolyl+hydroxylases+under+hypoxia+results+in+metabolic+catastrophe+and+cell+death.">Reactivating HIF prolyl hydroxylases under hypoxia results in metabolic catastrophe and cell death.</a> Oncogene. 28, 4009-4021 (2009).</li><li>Kim, J., So, D., Shin, H. W., Chun, Y. S., Park, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIF-1alpha+Upregulation+due+to+Depletion+of+the+Free+Ubiquitin+Pool.">HIF-1alpha Upregulation due to Depletion of the Free Ubiquitin Pool.</a> Journal of Korean medical science. 30, 1388-1395 (2015).</li><li>Amelio, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAp73+opposes+tumor+angiogenesis+by+promoting+hypoxia-inducible+factor+1alpha+degradation.">TAp73 opposes tumor angiogenesis by promoting hypoxia-inducible factor 1alpha degradation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 226-231 (2015).</li><li>Suga, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+remodeling+under+ischemia:+death+of+adipocytes+and+activation+of+stem/progenitor+cells.">Adipose tissue remodeling under ischemia: death of adipocytes and activation of stem/progenitor cells.</a> Plast Reconstr Surg. 126, 1911-1923 (2010).</li><li>Moreno-Indias, I., Tinahones, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+adipose+tissue+expandability+and+lipogenic+capacities+as+ones+of+the+main+causes+of+metabolic+disorders.">Impaired adipose tissue expandability and lipogenic capacities as ones of the main causes of metabolic disorders.</a> J Diabetes Res. 2015, 970375 (2015).</li><li>Keuper, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inflammatory+micro-environment+promotes+human+adipocyte+apoptosis.">An inflammatory micro-environment promotes human adipocyte apoptosis.</a> Mol Cell Endocrinol. 339, 105-113 (2011).</li><li>Sera, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+origin+of+adipocytes.">Hematopoietic stem cell origin of adipocytes.</a> Experimental hematology. 37, 1108-1120 (2009).</li><li>Zuk, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilineage+cells+from+human+adipose+tissue:+implications+for+cell-based+therapies.">Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies.</a> Tissue engineering. 7, 211-228 (2001).</li><li>Zuk, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+adipose+tissue+is+a+source+of+multipotent+stem+cells.">Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells.</a> Molecular biology of the cell. 13, 4279-4295 (2002).</li><li>Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue:+from+lipid+storage+compartment+to+endocrine+organ.">Adipose tissue: from lipid storage compartment to endocrine organ.</a> Diabetes. 55, 1537-1545 (2006).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Adipositler nedeniyle aşırı enerji depolama tarafından uyarılan adiposit hiperplazisi ve hipertrofisi, ifşa, büyüklüğü, sayısı ve alanı ile fenotipik karakterize aşırı beslenme 5. Yağ asidi düzensizliklerine ve sonraki metabolik sendromların neden bu olaylar aynı zamanda &quot;sağlıklı&quot; yağ genleşme olarak adlandırılır korunmuş metabolizması ile artmış yağ kitlesinin devletler vardır. Örneğin, Kusminski ve ark., 21 büyük yağ genişleme ile fareler bu yağ genleşme mutlaka metabolik sendromlar bağlantılı ve adipositlerin özelliklerini değerlendirmek için dikkatli bir şekilde kararlı olması gerekir değil düşündüren, metabolik sağlıklı kalmasını gösterdi. adipoz dokusu (AT), vücut metabolizmasının düzenlenmesinde önemli bir rol oynar. AT dislipidemi, ateroskleroz, hiperinsülinemi ve hiperglisemi 3 etkileyebilecek en büyük endokrin organdır. homeostasis ve moleküler m AT değerlendirilmesiBunu düzenleyen echanisms metabolik sistemi bozuklukları daha iyi anlaşılmasını izin verebilir. Bu nedenle, adiposit farklılaşması düzenleyen mekanizmaların açıklığa kavuşturulması, adiposit büyüklüğü ve yağ yastığı kütlesi obezite bozuklukları için yeni tedavi tedavi geliştirmek için yardımcı olacaktır. In vivo ve in vitro yöntemler kullanarak, adiposit farklılaşması ve aktivitesi Gıda ve gen ekspresyonu etkilerin rolünü tespit etmek mümkündür. Bizim protokol glukoz ve insülin metabolik yanıtı 22-24 analiz kadar önemlidir tarafından önerilen adiposit farklılaşması, çoğalması ve apoptoz arasındaki dengeyi belirleyen, AT homeostazı belirlemek. İfade profil birincil adipositlerdeki adipogenesis, lipojenez, lipoliz, yağ asidi alımı, hipoksi, apoptoz ve çoğalması yer alan genlerin analizleri ve visseral AT adiposit homeostazında ve bunların olası işlev bozukluğu üzerine genel bir bakış elde etmek için yüksek verimli bir yöntemdir.Ilginç adaylardır western blot veya immünohistolojik boyama ile protein seviyesinde analiz edilmelidir. Simetrik olmayan siyanin boyalar kullanarak gerçek zamanlı PCR sistemi ile optimum sonuçlar elde etmek için, 1&#39;den 10 ng arasında değişen cDNA konsantrasyonları ve 50 900 nM arasında değişen optimum astar konsantrasyonları spesifik olmayan amplifikasyon en aza indirmek için test edilmelidir. kritik bileşenleri primerler şunlardır; Her bir çalışma için, erime eğrileri katı özgüllük sağlamak ve primer dimerlerin oluşumunu hariç tutmak için kontrol edilmesi gerekmektedir. Bu nedenle, bunun yerine cDNA&#39;nın H2O ile bir negatif kontrol kullanımı tavsiye edilmektedir. Ayrıca, ticari olarak temin edilebilen simetrik olmayan siyanin boyalar (örneğin, ROX) pasif bir referans boya içeren bir iç referans bir sinyal sağlamak için ana karışımı olarak temin edilmiştir. cDNA sinyali hali-kuyu sinyal dalgalanmaları düzeltmek için ROX sinyallerine veri analizi sırasında normalize edilir. Başka bir nokta, bir goo kurmak için dikkate alınması gerekend qPCR sistemi temizlik geninin seçimdir. Her durum için, birden fazla temizlik genler kullanılır, örneğin, HPRT β-aktin, GAPDH, β-2-Mg veya HSP90. Hipoksik koşullar ile stabilize HIF proteinler ana sadece adipositler yaşamda kalmasını saptamak düzenleyiciler, aynı zamanda, örneğin glukoz, insülin tolerans ve lipid metabolizması 11,25,26 gibi metabolik değişiklikler vardır. yağ yastığı hipoksik alanlarını tespit etmek için, HIF-1α immünohistokimyasal olarak bölümlerde AT belirlenir. HIF proteinleri hızlı bir şekilde normoksik koşullar altında 5 ila 10 dakika içinde bozulmuş olması nedeniyle, prosedür ve histolojik analiz için yağ yastığı sabitleme sıkı geçen süre önlemek için kontrol edilmelidir. Bu nedenle, sadece HIF boyamasıyla hipoksi sağlamak için, pimonidazol AT hipoksik alanlarının belirlenmesi için kullanılır. Zaten kemik 27&#39;de görüldüğü gibi pimonidazol, dokulara dağıtmak mümkünVe etkin bir şekilde daha da spesifik antikor 28 bağlanarak histolojik bölümlerde tespit edilir, özellikle hipoksik hücrelerde tiol içeren proteinlere bağlanarak hipoksik alanları işaretleyin. Bununla birlikte, diğer belirteçler ve yöntemler hipoksi yol analiz etmek için kullanılabilir. Örneğin, hidroksillenmiş prolinlerin tanır ve proteozomal HIF aracılık etmek için poli-dağılmasını teşvik normoksi altında prolin artıkları hidroksilasyonunu neden prolil hidroksilaz (PHD) enzim, yanı sıra, von Hippel-Lindau (VHL) protein, katılımı bozulma, yolu 29,30 tam bir bakış açısından analiz edilmesi gerekir. Ayrıca, HIFs her yerde tespiti de 31,32 değiştirebilir olabilir protein istikrar ve parçalanmasını belirleyecek. Ayrıca, TÜNEL lekelemesi ile Ki67 çoğalmayı ve apoptozis histolojik kesitlerin boyamasıyla in vivo olarak belirlenir. Ki67 ve a ile proliferasyon miktarının belirlenmesiAkışkan sitometri analizi ile TÜNEL ya Annexin V boyama ile poptosis da 33 üzerinden gerçekleştirilir. Proliferasyon elbette bu Ki67 pozitif hücrelerin ölçümüyle bahsedilmeyen adiposit hücre döngüsü, analizi gibi teknikler ile ölçülebilir. FACS apoptosis hücre ölümü süreci karşı nekroz düzeylerini belirleyecek Annexin V ve TOP-PR-3 analizleri ile Dahası, TUNEL tarafından apoptoz çalışması tamamlanabilir. Apoptoz AT homeostazı için önemli olan hücre ölümü programının için temel süreçtir. Nitekim, adiposit apoptoz düzensizliği obeziteye katkıda süreçlerde daha önce karıştığı ve 34 Lipodistrofi edilmiştir. Ayrıca, 2011 yılında, Keuper ve ark. Adiposit apoptozis yağ dokusu iltihabı bağlı. Makrofajlar da makrofajlar çekmek preadipositlerin ve adipositler, apoptoza neden olduğunu göstermiştir. makrofaj işe iltihabı, hangi Contr hızlandırırglikoz ve insülin toleransı 35 gibi metabolik sendromlar ibutes. Ancak, adiposit apoptoz kötü okudu fenomen kaynaklı adiposit apoptoz kilo azalmasına neden olabilir hipotezi rağmen, halen devam etmektedir. Mevcut protokol, in vivo çoğalması, apoptoz ve hipoksi gibi farklı fenomen incelemek için immünohistokimyasal yaklaşımlar kullanır. Bu nedenle, doku kritik bir adımdır% 4 formaldehit ile tespit edildi. Genişletilmiş bir doku tespit süresi antikor olmayan erişilebilir hale epitoplara, değişmesine yol açar. Bunun aksine, kısa bir sabitleme süresi reaktiflere epitop duyarlılığını arttırır. tespitin tavsiye en uygun zaman 24 saattir. Ayrıca, bölümlerin kalınlığının ayrıca epitoplara bağlanan antikorlar etkiler; Optimal kalınlığı 2 um ile 5 arasında bir. 5 um daha kalın kesitler artan bağlama sitelere yalancı pozitif sonuç verecektir. Bunun aksine, sections ince 2&#39;den mikron daha az bağlayıcı siteleri içeren ve olumlu alanlarda iyi tanımlanmış değildir. Bundan başka kritik faktörler epitoplara spesifik bağlanma kalitesini etkileyen antikorun kendisi, kuluçkalama süresi, konsantrasyon ve eşit bir ısı vardır. Bu nedenle, bir antikor konsantrasyon ve inkübasyon zamanı doğrulamak her durum için gereklidir. Etüdün tamamlanması için, farklı tedaviler, uyarılması ya da ko-kültürler ile uzatılabilir bir in vitro adiposit farklılaşma protokolünü sağlar. Nitro adiposit kültürlerinde kullanılarak, adiposit farklılaşması ve işlevleri kusurları tespit etmek mümkündür. tüm primer hücreler için olduğu gibi, ADSCs ve adipositlerin sağlıklı davranış ve görünüm oldukça önemlidir, güvenilir sonuçlar elde etmek. ayrıntı, sitoplazmik vakuolleşmeye ve / veya dekolmanı birincil yetersiz orta, mikrobiyal kontaminasyonu veya yaşlanmayı gösteren bozulma belirtileri vardırHücreler. Diğer protokoller 36 tarafından tarif edildiği gibi, kemik iliğinden izole mezenkimal kök hücre kullanmak da mümkündür, oysa bu protokol, yağ yastığı dokusundan izole adipositlerin kullanıyor. En son adiposit farklılaşması çok erken aşamada ortaya çıkan ek farklılaşma sorunları yansıtıyor olabilir stromal progenitör hücreler içerir, bu mevcut protokolde cevapsız olabilir. Ayrıca, ADSCs hızla (bir hafta içinde 10 kereden daha fazla) genişletilebilir ve bazı pasajlar sonra uzun süreli kültür ADSCs hala mezenkimal pluripotensini 37,38 saklayın. ADSCs kullanmanın bir diğer avantajı ADSCs basit ve minimal invaziv bir yöntemdir liposuction ile hastalardan hasat edilebilir çünkü kolayca, insana geçiş olabilir. AT endokrin şekilde birkaç diğer organları etkiler gibi protokol adipokinlerin şekilde genişletilmelidir. leptin, adiponektin, tümör nekroz faktör-α (TNF) a olarak Adipokinler,adipositler tarafından salgılanan nd resistin yağ metabolizması, enerji homeostazisini ve insülin duyarlılığını 39 kontrol ederek metabolik hastalıkların etkilediği bilinmektedir. Bu nedenle, serum ve adiposit secretome analizleri yapılmalıdır. IL-6 gibi, AT fonksiyon bozukluğu, adipokinlerin ve pro-inflamatuar sitokinlerin, durumunda, örneğin karaciğer ve pankreas ve kas fonksiyonunun 4 gibi organların bozulması neden olur. sistemik organ işlev bozukluğu bertaraf etmek için, hayvan modelleri ya da hücre kültürleri uyarılması ve alımını glikoza tepki açısından test edilebilir. Burada AT ve in vivo adipositlerin temel durumunu analiz etmek için bir protokol sağlar ve in vitro adiposit homeostazı ve işlevsellik moleküler mekanizmalarını ortaya çıkarmak için.

Dünya Sağlık Örgütü 2014 raporuna göre, dünyanın yetişkin nüfusunun% 39 aşırı kilolu ve% 13 1 obez olduğunu. Yakın gelecekte, kilolu insanların yaşlı nüfusun önemli bir bölümünü oluşturacaktır. Obezite ve yaşlanma önemli bir özellik morbidite ve mortalite 2 ile ilgili olarak yağ düzensizliği olduğunu. Adipokinler, adipoz dokuda (AT) tarafından salgılanan proteinler, obezite gibi metabolik sendromlar tetikleyebilir ve 2 diyabetin 3 yazabilirsiniz. Metabolik hastalıklar çoğunlukla genişleme 4 AT sonuçlanır adipositlerin lipid damlacıkları aşırı enerji depolama, kaynaklanır. Bu nedenle kontrol etmek fırsatları bulmak için nedenleri ve AT genişleme moleküler mekanizmaları belirlemek için ilgi çekicidir. Aşırı beslenme iki olay tarafından düzenlenir AT genişleme yol açar: aşırı enerji depolama adipositlerin lipid damlacıkları halinde, bir süreçAyrıca, adiposit hiperplazisi 5 olarak bilinen (adiposit boyutunda bir artış) ve artan adipogenesis, hipertrofiye neden olur. Adipogenesis adipositlere multipotent mezenkimal kök hücreler (MSC), farklılaşma, bir işlemdir. Birincisi, MKH taahhüt aşamasında preadipositlerden dönüşür. İkincisi, Preadipositler daha olgun ve işlevsel adipositlerin 6 özelliklerini elde etmek için ayırt. Çeşitli transkripsiyon faktörleri, örneğin çinko parmak protein 423 (Zfp423) ve erken B hücre faktör 1 (Ebf1) halinde preadiposit tespiti için ana düzenleyici olarak tanımlanmıştır. Zfp423 erken bağlılık indükler ise, Ebf1 adiposit progenitörlerin 6 üretimi için gereklidir. Terminal farklılaşma sıkı peroksizom proliferatör ile aktive olan reseptör γ (PPARy) esas transkripsiyon faktörü 7, burada bir transkripsiyon kaskadı ile kontrol edilmektedir. Bundan başka önemli transkripsiyon faktörleri (Cı CCAAT / güçlendirici bağlayıcı protein olan/ EBP) ailesi üyeleri (C / EBPα C / EBPβ ve C / EBPδ) Kruppel benzeri faktör (KLFs) cAMP karşılık elemanı bağlama proteini (CREB) ve erken gelişme tepkisi 20 (Krox20) 6. Son zamanlarda, aktive edici protein-1 (AP-1) Aile adiposit farklılaşması işlemi 8,9 rol oynadığı gösterilmiştir. AP-1 Aile Fos, Haz ve / veya aktive edici transkripsiyon faktörü (ATF) üyeden oluşan bir dimerik protein kompleksi ile oluşturulur. Fos-ilgili bir antijen 1 ve 2 (Fra-1 ve Fra-2) adiposit farklılaşmasını regüle edebilirler. Fra-1 Fra-2 kontrol adiposit devir 9 ise, / EBPα 8 C inhibe adiposit farklılaşmasını bozar. Fra-2, böylece sadece adiposit farklılaşması sırasında PPARγ2 ifadesini bastırmak yoluyla adiposit sayısını azaltır, aynı zamanda hipoksi-indüklenebilir faktör (HIFs) ifade doğrudan baskı yoluyla adiposit apoptoz azalır. HIF aile HETE olduğunuHIF-1 a, 2a, HIF-HIF-1 p oluşan rodimeric transkripsiyon faktörü kompleksi. Heterodimerler bir oksijen duyarlı HIF-α protein (HIF-1α HIF-2α) ve oksijen duyarsız HIF-1β alt-biriminin 10 oluşur. Normoxia sırasında, HIF-α proteinler poli ubiquitinylated ve nihayet proteazomlar 11 tarafından yıkılırlar. genleşme sırasında meydana gelen hipoksik koşullar altında HIF-α proteinler artık hidroksillenmiş vardır. Bu nedenle yapısal olarak ifade HIF-1 p ile stabilize ve form dimerleri olur. HIF yanıt elemanları ile kontrol genlerin transkripsiyonel aktivasyon anjiyojenez, metabolizma ve enflamasyon 12 düzenlenmesi ile ilgili. Gerçekten de, HIF-1α, glukoz tolerans indükte enerji sarfiyatını ve lipit çevresel kullanımı engellenmesi, hem de tarafından leptin seviyesi ve HFD kaynaklı hepatik steatoz 13 arttırarak disfonksiyonu teşvik eder. Ayrıca, HIF-1α adipocy düzenlerte apoptoz, in vivo ve in vitro 9. Mevcut protokol erişkin farelerde adiposit homeostazının moleküler özelliklerini çözülmeye durumu AT çalışmak için yöntemleri açıklar. Bu apoptoz, çoğalması ve in vivo ve in vitro olarak, adipositlerin farklılaşmasının hipoksi ile kontrol edilebilir gösterir. Bunu yapmak için, Fabp4-CreERT fareler 9 Fra-2 floxed alelleri taşıyan farelerin geçerek oluşturulan Fra-2&#39;nin adiposit belirli bir silinen fareler kullanır. Fabp4-Cre ERT fareler kullanılarak, silme adiposit tamoksifen enjeksiyon 14 belirli ve indüklenebilir. Yetişkin modeli için, tamoksifen periton içine enjeksiyonlarla 6 haftalıkken itibaren 5 ardışık gün boyunca gerçekleştirilir. Analiz yapılmadan önce Böylece, fareler 6 hafta boyunca normal bir diyet veya yüksek yağ içeren bir diyete tabi tutulur. Bu çalışmada kullanılan fare erkek gibi östrojenler gibi kadınlık hormonları, önlemek için bir C57BL6 arka dayanmaktadırVücut yağ dağılımı 15 düzenleyen gösterilmiştir. Başka genetik arka plan kullanarak da lipid yönetiminde 16 suş ile ilgili farklılıklara, metabolik fenotip değiştirebilir. Bu protokol histoloji kullanarak hipoksi altında AT nasıl analiz ve immünohistokimyasal ve profil analizleri geni kullanılarak in vivo adiposit apoptoz, çoğalmasını ve farklılaşmasını ölçmek için nasıl gösterir. Çalışma hipoksi maruz kalma değişmiş birincil adiposit farklılaşması ve apoptoz nasıl analiz edileceğini gösteren in vitro deneyler ile tamamlanmıştır.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>RNAlater solution</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM7021</td>
			<td>RNA stabilization solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td rowspan="2">Applied Biosystems</td>
			<td>4368813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Select Master Mix</td>
			<td>4472908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Mouse Anti-Human Ki-67&#160;&#160;</td>
			<td rowspan="2">BD Biosciences</td>
			<td>550609</td>
			<td>Clone &#160;B56&#160;(RUO)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Mouse Anti-Human Ki-67&#160; Clone &#160;B56&#160;(RUO)</td>
			<td>550609</td>
			<td>Proliferation marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Annexin V</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>640906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleaved Caspase-3 Rabbit mAb</td>
			<td rowspan="2">Cell signalling</td>
			<td>9664S</td>
			<td>&#160;Clone 5A1E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb</td>
			<td>9664</td>
			<td>Apoptosis marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypoxyprobe-1 Plus Kit</td>
			<td>Hypoxyprobe</td>
			<td>HP2-200Kit</td>
			<td>Hypoxia marker, Solid pimonidazole HCl (Hypoxyprobe-1), FITC conjugated to mouse IgG&#8321; monoclonal antibody (FITC-MAb1), Rabbit anti-FITC conjugated with horseradish peroxidase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine2000 Reagent&#160;</td>
			<td rowspan="2">Invitrogen</td>
			<td>11668-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TO-PRO-3 Iodide</td>
			<td>T3605</td>
			<td>Nuclear counterstain, Monomeric cyanine nucleic acid stain, Excitation&#8260;Emission: 642&#8260;661 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayer&#8217;s hemalum</td>
			<td>Merck</td>
			<td>109249</td>
			<td>hematoxylin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pegGOLD TriFast</td>
			<td rowspan="3">Peqlab</td>
			<td>30-2030</td>
			<td>TRIzol, single-phase solution of guanidinisothiocyanat and phenol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percellys Ceramic Kit 1.4 mm</td>
			<td>91-PCS-CK14</td>
			<td>tubes containing ceramic beads (1.4 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precellys 24</td>
			<td>91-PCS24</td>
			<td>homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIF-1 alpha Antibody</td>
			<td rowspan="2">Pierce</td>
			<td>PA1-16601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIF-1 alpha Antibody, 16H4L13</td>
			<td>700505</td>
			<td>Hypoxia marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11 684 795 001</td>
			<td>TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling (TUNEL)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>318906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I Solution (1 unit/&#181;L)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EN0525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotinylated anti mouse IgG (H+L)</td>
			<td rowspan="4">Vector Laboratories</td>
			<td>BA-9200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotinylated anti mouse IgG (H+L)</td>
			<td>BA-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectastain ABC Kit</td>
			<td>PK-4000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mechanism of regulation of adipocyte numbers in adult organisms through differentiation and apoptosis homeostasis

Considering that adipose tissue (AT) is an endocrine organ, it can influence whole body metabolism. Excessive energy storage leads to the dysregulation of adipocytes, which in turn induces abnormal secretion of adipokines, triggering metabolic syndromes such as obesity, dyslipidemia, hyperglycemia, hyperinsulinemia, insulin resistance and type 2 diabetes. Therefore, investigating the molecular mechanisms behind adipocyte dysregulation could help to develop novel therapeutic strategies. Our protocol describes methods for evaluating the molecular mechanism affected by hypoxic conditions of the AT, which correlates with adipocyte apoptosis in adult mice. This protocol describes how to analyze AT in vivo through gene expression profiling as well as histological analysis of adipocyte differentiation, proliferation and apoptosis during hypoxia exposure, ascertained through staining of hypoxic cells or HIF-1&#945; protein. Furthermore, in vitro analysis of adipocyte differentiation and its responses to various stimuli completes the characterization of the molecular pathways behind possible adipocyte dysfunction leading to metabolic syndromes.

Bu örneği kullanılarak, in vivo ve in vitro adiposit homeostazı belirleme göstermek Fra-2 fl / FL vahşi tür littermates göre Fabp4-CreERT fareleri. Bizim protokol artan adiposit apoptosis ile belirtildiği gibi hipoksi artarak HIF ifade adiposit disfonksiyonu ile ilişkilidir nasıl tanımlar. yüksek yağlı diyet Artan adiposit büyüklüğü ve alanı (YYD) uygulanan fareler Aşırı beslenme, diğer faktörlerin yanı sıra, lipid damlacıkları aşırı enerji depolama kaynaklanan adiposit hipertrofisi ile sonuçlanır. adiposit boyutu ve alan hipertrofisi bir göstergesidir. Normal yağ yastığı Bölümleri (ND; Şekil 6a) ve yüksek yağlı diyet (YYD Şekil 6b) 6 hafta sonra adiposit büyüklüğü ve bölgenin fareler yanı sıra sayımsal açıkça göstermektedir adiposit hipertrofisiHFD tedavi edilen farelerde (Şekil 6c, d) artmış adiposit boyutu ile gösterilir YYD, s. Yetişkin adipoz dokusu (AT) artan hipoksi Fra-2 fl / fl Fabp4-CreERT fareler artmış HIF-1α seviyesi ve adiposit apoptosise neden olur AT hipoksi in vivo durumunu belirlemek için, Fra-2 fl / fl Fabp4-CreERT farenin 12 haftalıkken Fra-2 silme işleminden sonra 6 hafta analiz ve vahşi tip littermates ile karşılaştırılmıştır. Pimonidazol intraperitonal etkili hipoksi belirteci olarak farelere tatbik edilir; o toksik olmayan ve AT içine dağıtmak yapabiliyor. In vivo AT hipoksik adipositler immünohistokimyasal antikor boyama (Şekil 7a) tarafından tanımlanır. Bundan başka, farelerin AT artan hipoksik durumu artan HIF-1α pozitif ADIP eşlikHIF-1α ifade seviyeleri ve hedef genlerin 9 miktarının ile teyit edilir immünohistokimyasal boyama Şekil 7B), gösterildiği gibi ocytes. Buna ek olarak, Fra-2 bölümlerin arasında, TÜNEL lekelemesi fl / fl Fabp4-CreERT fare ve kontrol litermatlarının (Şekil 7c) adiposit apoptoz hipoksi ve HIF-1α ifade ile korele artış gösterir. hipoksi nedenli adiposit apoptoz yoluyla primer adipositler HIF-1α ifade artışı Başka bir yerde, 20 tarif edilen şekilde in vitro adiposit apoptoz analiz etmek için deri altı yağ pedleri elde adipositler kullanımı. Beklendiği gibi, adipositlerde HIF-1α sentezleme hipoksi (Şekil 8a) 24 saat sonra artmıştır. ayrıca HIF-1α faaliyetleri, HIF hedef RNA düzeylerinin analiz etmekBu Inos (uyarılabilir nitrik oksit sintaz) genler qPCR nicelendirilir. 8b hipoksik koşullar altında HIF-1α artmış ekspresyonu Inos mRNA düzeyleri artan yol açar göstermektedir. Daha önce adipositlerde HIF-1α ekspresyonunda artış adiposit apoptoz ile ilişkilidir artmış in vivo (Şekil 8) &#39;de gösterilen bu yana, apoptoz da hipoksik koşullar altında Annexin V boyama ile in vitro kültürlerinde ölçülür. İn vivo veriler (Şekil 7) ile uyumlu olarak, artmış bir HIF-1α seviyesi hipoksik koşullar neden olduğu artan adiposit apoptoz ile (Şekil 8b) eşlik eder. Ayrıca, bu hipoksik kaynaklı apoptosisi kanıtlamak için, HIF-bağlıdır; HIF-1α HIF-2α yabani tip veya Fra-2 eksik farelerde elde edilen adipositler RNA müdahalesi ile susturulur. Annexin gösterildiği gibi artan adiposit apoptoz HIF-1α veya HIF-2a susturma tarafından restore<html> Hipoksi sensörü HIF-α adiposit apoptoz düzenleyen kanıtlayan Şekil 8b V boyama. <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/53822/53822fig6.jpg" /> Şekil 6: Yüksek yağlı diyet (HFD) farelerde adiposit boyutu ve alan artışı normal diyet (ND) ile beslenen erkek doğal tipte farelerin perigonadal yağ yastığı alınan kesitlerin (A, B), H &amp; E boyama, (a) ya da yüksek. -FAT diyet (HFD), (b) 6 hafta. Barlar 500 mikron temsil etmektedir. (C, d) (b) 6 hafta boyunca ND: (a) ya da YYD ile beslenen doğal tipte farelerin perigonadal yağ pedi adiposit boyutu (c) ve alan (d) sayımsal. n = 10. Veri ± SEM ortalama değerler olarak gösterilmektedir. İstatistiksel analiz Student t-testi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. *** P &lt;0.0001.: //www.jove.com/files/ftp_upload/53822/53822fig6large.jpg &quot;Target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 7," src="/files/ftp_upload/53822/53822fig7.jpg" /> Fra-2 fl / fl Fabp4-CreERT fareler yetişkin adipositlerde artmış HIF-1α düzeyi ve apoptosis: Şekil 7. Hipoksi (a) ve HIF-1α erkek Fra-2 fl / fl Fabp4-creERT fare ve kontrol litermatlarının erkek, 6 hafta sonra tamoksifen enjeksiyon AT (b) boyama. Büyütme 20X, 40X yerleştirin. Siyah oklar hipoksik alanları ve HIF-1α pozitif hücreler göstermektedir. (C), TÜNEL lekelemesi Fra-2 fl / FL tamoksifen enjeksiyondan 6 hafta sonra Fabp4-CreERT fare ve kontrol litermatlarının. Büyütme 20X, 40X yerleştirin. Siyah oklar TUNEL pozitif hücreler gösterir. Bu rakam Luther et modifiye edilmişark. 9. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53822/53822fig7large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 8," src="/files/ftp_upload/53822/53822fig8.jpg" /> Şekil 8:. Hipoksi ile birincil adipositlerde artmış HIF-1α ekspresyonu ve adiposit apoptoz hipoksik odalarına yerleştirilir primer adipositler HIF-1α ve HIFs hedef Inos mRNA seviyelerinin, (a) Gerçek zamanlı PCR analizi, belirtilen zaman noktalarında analiz edilmiştir. Izole edilen primer adipositlerde Annexin V FACS lekelenmesi ile apoptozun (b) Niceleme Fra-2 fl / FL SH kontrol veya HIF-1α HIF-2a karşı SH plazmid ile transfekte edilmiş ve hipoksi altına Fabp4-CreERT fareleri ya da vahşi-tipli kontrollerden 24 saat boyunca (% 1 O 2). Bu rakam, Luther ve diğ modifiye edilmiştir. <sup&gt; 9. Veri SD İstatistiksel analizler Student t-testi kullanılarak yapıldı ± ortalama değerler olarak gösterilmektedir. * P &lt;0.05 ve ** p &lt;0.01 anlamlı olarak kabul edildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53822/53822fig8large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Mechanism of Regulation of Adipocyte Numbers in Adult Organisms Through Differentiation and Apoptosis Homeostasis at JoVE.com

Mechanism of Regulation of Adipocyte Numbers in Adult Organisms Through Differentiation and Apoptosis Homeostasis

Adipose tissue (AT) can influence whole body homeostasis, therefore understanding the molecular mechanisms of adipocyte differentiation and function is of importance. We provide a protocol for gaining new insights into these processes by analyzing adipocyte homeostasis, differentiation and hypoxia exposure as a model for induced adipocyte apoptosis.

Farklılaşma ve Apoptoz Homeostazis sayesinde Yetişkin Organizmalar içinde Adiposit Numaraları Yönetmeliği Mekanizması

Considering that adipose tissue (AT) is an endocrine organ, it can influence whole body metabolism. Excessive energy storage leads to the dysregulation of ...

mechanism-regulation-adipocyte-numbers-adult-organisms-through

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

14.9K Görüntüleme.  Universitätsklinikum Erlangen. Adipose tissue (AT) can influence whole body homeostasis, therefore understanding the molecular mechanisms of adipocyte differentiation and function is of importance. We provide a protocol for gaining new insights into these processes by analyzing adipocyte homeostasis, differentiation and hypoxia exposure as a model for induced adipocyte apoptosis.

Video: Mechanism of Regulation of Adipocyte Numbers in Adult Organisms Through Differentiation and Apoptosis Homeostasis

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

Evans Blue Dye ile Zebra balığı Larva İskelet Kası Bütünlüğü Analizi

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Gelişim Biyolojisi

Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated by transcription factors which bind genomic regulatory regions including enhancers and promoters of cardiac constitutive genes. DNA is wrapped around histones that are subjected to chemical modifications. Modifications of histones further lead to repressed, activated or poised gene transcription, thus bringing another level of fine tuning regulation of gene transcription. Embryonic Stem cells (ES cells) recapitulate within embryoid bodies (i.e., cell aggregates) or in 2D culture the early steps of cardiac development. They provide in principle enough material for chromatin immunoprecipitation (ChIP), a technology broadly used to identify gene regulatory regions. Furthermore, human ES cells represent a human cell model of cardiogenesis. At later stages of development, mouse embryonic tissues allow for investigating specific epigenetic landscapes required for determination of cell identity. Herein, we describe protocols of ChIP, sequential ChIP followed by PCR or ChIP-sequencing using ES cells, embryoid bodies and cardiac specific embryonic regions. These protocols allow to investigating the epigenetic regulation of cardiac gene transcription.

A fine tuning regulation of gene transcription underlies embryonic cell fate decision. Herein, we describe chromatin immunoprecipitation assays used to investigate epigenetic regulation of both cardiac differentiation of stem cells and cardiac development of mouse embryos.

Embriyonik Kök Hücre ve Doku Kardiyak Farklılaşma epigenetik Yönetmelik

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

Isolating Hair Follicle Stem Cells and Epidermal Keratinocytes from Dorsal Mouse Skin

The hair follicle (HF) is an ideal system for studying the biology and regulation of adult stem cells (SCs). This dynamic mini organ is replenished by distinct pools of SCs, which are located in the permanent portion of the HF, a region known as the bulge. These multipotent bulge SCs were initially identified as slow cycling label retaining cells; however, their isolation has been made feasible after identification of specific cell markers, such as CD34 and keratin 15 (K15). Here, we describe a robust method for isolating bulge SCs and epidermal keratinocytes from mouse HFs utilizing fluorescence activated cell-sorting (FACS) technology. Isolated hair follicle SCs (HFSCs) can be utilized in various in vivo grafting models and are a valuable in vitro model for studying the mechanisms that govern multipotency, quiescence and activation.

An ideal model for studying adult stem cell biology is the mouse hair follicle. Here we present a protocol for isolating different populations of hair follicles stem cells and epidermal keratinocytes, employing enzymatic digestion of mouse dorsal skin followed by FACS analysis.

Dorsal Fare Cilt Saç Folikül Kök Hücreler ve epidermal keratinositler Ayırma

The hair follicle (HF) is an ideal system for studying the biology and regulation of adult stem cells (SCs). This dynamic mini organ is replenished by ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem cells (hPSCs). Until recently, efforts to differentiate hPSCs into HSCs have predominantly generated hematopoietic progenitors that lack HSC potential, and instead resemble yolk sac hematopoiesis.&#160;These resulting hematopoietic progenitors may have limited utility for in vitro disease modeling of various adult hematopoietic disorders, particularly those of the lymphoid lineages. However, we have recently described methods to generate erythro-myelo-lymphoid multilineage definitive hematopoietic progenitors from hPSCs using a stage-specific directed differentiation protocol, which we outline here. Through enzymatic dissociation of hPSCs on basement membrane matrix-coated plasticware, embryoid bodies (EBs) are formed. EBs are differentiated to mesoderm by recombinant BMP4, which is subsequently specified to the definitive hematopoietic program by the GSK3&#946; inhibitor, CHIR99021. Alternatively, primitive hematopoiesis is specified by the PORCN inhibitor, IWP2. Hematopoiesis is further driven through the addition of recombinant VEGF and supportive hematopoietic cytokines. The resulting hematopoietic progenitors generated using this method have the potential to be used for disease and developmental modeling, in vitro.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, used to differentiate hPSCs into CD34+ hematopoietic progenitors. This method uses stage-specific manipulation of canonical WNT signaling to specify cells exclusively to either the definitive or primitive hematopoietic program.

İlkel ve kesin hematopoetik ataları insan Pluripotent kök hücrelerden farklılaşma yönetmen

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

Diseksiyon ve mantar vücut immünfloresan boyama ve yetişkin Drosophila melanogaster beynindeki nöronlar Photoreceptor

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, antibodies for specific cell markers are applied on tissue sections. In adult skeletal muscle, satellite cells (SCs) are stem cells that contribute to muscle repair and regeneration. Therefore, it is important to visualize and trace the satellite cell population under different physiological conditions. In resting skeletal muscle, SCs reside between the basal lamina and myofiber plasma membrane. A commonly used marker for identifying SCs on the myofibers or in cell culture is the paired box protein Pax7. In this article, an optimized Pax7 immunofluorescence protocol on skeletal muscle sections is presented that minimizes non-specific staining and background. Another antibody that recognizes a protein (laminin) of the basal lamina was also added to help identify SCs. Similar protocols can also be used to perform double or triple labeling with Pax7 and antibodies for additional proteins of interest.

The precise identification of satellite cells is essential for studying their functions under various physiological and pathological conditions. This article presents a protocol to identify satellite cells on adult skeletal muscle sections by immunofluorescence-based staining.

Kas iskelet uydu hücreleri tarafından Pax7 ve Laminin antikorlar ile ayirt tanımlaması

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

Derivation and Differentiation of Canine Ovarian Mesenchymal Stem Cells

Interest in mesenchymal stem cells (MSCs) has increased over the past decade due to their ease of isolation, expansion, and culture. Recently, studies have demonstrated the wide differentiation capacity that these cells possess. The ovary represents a promising candidate for cell-based therapies due to the fact that it is rich in MSCs and that it is frequently discarded after ovariectomy surgeries as biological waste. This article describes procedures for the isolation, expansion, and differentiation of MSCs derived from the canine ovary, without the necessity of cell-sorting techniques. This protocol represents an important tool for regenerative medicine because of the broad applicability of these highly differentiable cells in clinical trials and therapeutic uses.

Herein, we describe a method for the isolation, expansion, and differentiation of mesenchymal stem cells from canine ovarian tissue.

Türetme ve köpek yumurtalık mezenkimal kök hücre farklılaşma

Interest in mesenchymal stem cells (MSCs) has increased over the past decade due to their ease of isolation, expansion, and culture. Recently, studies ...

Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle

The majority of work on the neuronal specification has been carried out in genetically and physiologically tractable models such as C. elegans, Drosophila larvae, and fish, which all engage in undulatory movements (like crawling or swimming) as their primary mode of locomotion. However, a more sophisticated understanding of the individual motor neuron (MN) specification&#8212;at least in terms of informing disease therapies&#8212;demands an equally tractable system that better models the complex appendage-based locomotion schemes of vertebrates. The adult Drosophila locomotor system in charge of walking meets all of these criteria with ease, since in this model it is possible to study the specification of a small number of easily distinguished leg MNs (approximately 50 MNs per leg) both using a vast array of powerful genetic tools, and in the physiological context of an appendage-based locomotion scheme. Here we describe a protocol to visualize the leg muscle innervation in an adult fly.

Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle

Here we describe a protocol to visualize the axonal targeting with a florescent protein in adult legs of Drosophila by fixation, mounting, imaging, and post-imaging steps.

Drosophila bacak Motor Nöron aksonlar yetişkin kütikül aracılığıyla görselleştirmek

The majority of work on the neuronal specification has been carried out in genetically and physiologically tractable models such as C. elegans, Drosophila ...

Induction of Endothelial Differentiation in Cardiac Progenitor Cells Under Low Serum Conditions

Cardiac progenitor cells (CPCs) may have therapeutic potential for cardiac regeneration after injury. In the adult mammalian heart, intrinsic CPCs are extremely scarce, but expanded CPCs could be useful for cell therapy. A prerequisite for their use is their ability to differentiate in a controlled manner into the various cardiac lineages using defined and efficient protocols. In addition, upon in vitro expansion, CPCs isolated from patients or preclinical disease models may offer fruitful research tools for the investigation of disease mechanisms.
Current studies use different markers to identify CPCs. However, not all of them are expressed in humans, which limits the translational impact of some preclinical studies. Differentiation protocols that are applicable irrespective of the isolation technique and marker expression will allow for the standardized expansion and priming of CPCs for cell therapy purpose. Here we describe that the priming of CPCs under a low fetal bovine serum (FBS) concentration and low cell density conditions facilitates the endothelial differentiation of CPCs. Using two different subpopulations of mouse and rat CPCs, we show that laminin is a more suitable substrate than fibronectin for this purpose under the following protocol: after culturing for 2 - 3 days in medium including supplements that maintain multipotency and with 3.5% FBS, CPCs are seeded on laminin at &#60;60% confluence and cultured in supplement-free medium with low concentrations of FBS (0.1%) for 20 - 24 hours before differentiation in endothelial differentiation medium. Because CPCs are a heterogeneous population, serum concentrations and incubation times may need to be adjusted depending on the properties of the respective CPC subpopulation. Considering this, the technique can be applied to other types of CPCs as well and provides a useful method to investigate the potential and mechanisms of differentiation and how they are affected by disease when using CPCs isolated from respective disease models.

This protocol describes an endothelial differentiation technique for cardiac progenitor cells. It particularly focuses on how serum concentration and cell-seeding density affect the endothelial differentiation potential.

İndüksiyon düşük Serum koşullar altında kalp Progenitor hücreler endotel farklılaşma

Cardiac progenitor cells (CPCs) may have therapeutic potential for cardiac regeneration after injury. In the adult mammalian heart, intrinsic CPCs are ...

Accurate Follicle Enumeration in Adult Mouse Ovaries

Sexually reproducing female mammals are born with their entire lifetime supply of oocytes. Immature, quiescent oocytes are found within primordial follicles, the storage unit of the female germline. They are non-renewable, thus their number at birth and subsequent rate of loss largely dictates the female fertile lifespan. Accurate quantification of primordial follicle numbers in women and animals is essential for determining the impact of medicines and toxicants on the ovarian reserve. It is also necessary for evaluating the need for, and success of, existing and emerging fertility preservation techniques. Currently, no methods exist to accurately measure the number of primordial follicles comprising the ovarian reserve in women. Furthermore, obtaining ovarian tissue from large animals or endangered species for experimentation is often not feasible. Thus, mice have become an essential model for such studies, and the ability to evaluate primordial follicle numbers in whole mouse ovaries is a critical tool. However, reports of absolute follicle numbers in mouse ovaries in the literature are highly variable, making it difficult to compare and/or replicate data. This is due to a number of factors including strain, age, treatment groups, as well as technical differences in the methods of counting employed. In this article, we provide a step-by-step instructional guide for preparing histological sections and counting primordial follicles in mouse ovaries using two different methods: [1] stereology, which relies on the fractionator/optical dissector technique; and [2] the direct count technique. Some of the key advantages and drawbacks of each method will be highlighted so that reproducibility can be improved in the field and to enable researchers to select the most appropriate method for their studies.

Here, we describe, compare, and contrast two different techniques for accurate follicle counting of fixed mouse ovarian tissues.