Protokolümüz, yaprak apoplastında yetişen bakteri popülasyonlarının geri kazanılmasını sağlayan nazik bir bitki aşılama ve ekstraksiyon yöntemi sağlar, bu da akış sitometrisi gibi tek hücreli gen ekspresyon analizi için uygundur. Bu yöntem, numuneleri bitki hücresel kalıntıları ile önemli ölçüde kirletmeden apoplasttan önemli miktarda bakterinin ekstraksiyonuna izin verir. Apoplastik bakterilerin geri kazanımı için optimize edilmiş bu yöntem, bitki patojenik bakterileri veya faydalı endositik bakterileri içeren bir dizi bitki bakteri sistemine doğrudan veya küçük değişikliklerle uygulanabilir.
Prosedürü gösteren, laboratuvarımızdan doktora öğrencisi Nieves Lopez-Pagan olacaktır. Başlamak için, 10 santimetre çapında bir tencereyi önceden sulanmış 1:3 vermikülit bitki substratı karışımı ile doldurun. Tencereyi delikli bir metal ağ ile örtün ve metal ağı lastik bir bant kullanarak ıslak toprağa ayarlayın.
Daha sonra, Arabidopsis tohumlarını ıslak bir kürdan ile metal ağın deliklerine ekin. Üç ila dört tohumu tencerenin içinde uzak pozisyonlara yerleştirin. Yüksek bağıl nemi korumak için tencereyi plastik bir kubbe ile örtün ve 72 saat boyunca dört santigrat derecede tabakalaşma için inkübe edin.
Saksıyı kısa gün koşullarında bir bitki büyüme odasına aktarın. Tencereyi ortaya çıkarmak için plastik kubbeyi çıkarın. Tohumlar çimlendikten sonra, fidelerin çoğunu çıkarmak için cımbız kullanın, saksının her birinde bir fide tutun.
Daha sonra bir Petri kabının altını ıslak bir kağıt havluyla kaplayarak ve fasulye tohumlarını üstüne yerleştirerek Phaseolus vulgaris fasulye bitkilerini hazırlayın. Petri kabını cerrahi bantla kapatın ve üç ila dört gün boyunca 28 santigrat derecede inkübe edin. Çimlenmiş tohumları ıslak 1: 3 vermikülit bitki substratı karışımı ile doldurulmuş 10 santimetre çapında bir tencereye aktarın ve uzun gün ayarları altında bir bitki büyüme odasında inkübe edin.
İlgilenilen Pseudomonas şırıngasının gliserol stoğunu eksi 80 santigrat dereceden uygun antibiyotiklerle desteklenmiş bir LB plakasına çizin. Plakayı 40 ila 48 saat boyunca 28 santigrat derecede inkübe edin. Bakteriyel biyokütleyi kazıyın ve beş mililitre 10 milimolar magnezyum klorür içinde yeniden askıya alın.
Optik yoğunluğu 600 nanometrede ölçün ve 10 milimolar magnezyum klorür ekleyerek 0.1'e ayarlayın. Mililitre başına beş kez 10 ila beşinci CFU'luk nihai bir inokülum konsantrasyonu elde etmek için 10 milimolar magnezyum klorürde seri seyreltmeler yapın. Daha sonra, Arabidopsis bitkileri için 200 mililitre inokülum ve fasulye bitkileri için 50 mililitre hazırlayın.
Aşılamadan önce, yüzey aktif madde Silwet L-77'yi fasulye aşılaması için% 0.02 ve Arabidopsis için% 0.01'lik bir nihai konsantrasyona ekleyin. Arabidopsis infiltrasyonu için, tencerenin üzerine bir X oluşturan iki tahta çubuk yerleştirin ve tencereyi 200 mililitre inokülum içeren 14 santimetre çapında bir Petri kabının üzerine aşağı bakacak şekilde yerleştirin. Fasulye yapraklarının aşılanması için, bitkileri ve inokulum çözeltisini bir vakum odasına yerleştirin ve yaprağı, inokulumu içeren 50 mililitrelik bir konik santrifüj tüpüne yerleştirin.
Yapraklara sızmak için 30 saniye boyunca 500 milibar nabız verin. Fazla inokülum çözeltisini bir parça kağıtla boşaltın ve planları karşılık gelen büyüme odalarına geri gönderin. Aşılamadan dört gün sonra, Arabidopsis bitkisinin hava kısmını veya aşılanmış yaprağı fasulye bitkisinden kesin ve iğnesiz 20 mililitrelik bir şırıngaya yerleştirin.
Fasulye yaprakları için, yaprağı kendi üzerine yuvarlayın ve abaksiyel yüzü dışa doğru bırakın. Dokuyu örtmek için yeterli miktarda damıtılmış su ekleyin. Daha sonra, şırıngayı dik konumda tutan pistonu yerleştirin ve tüm hava ucun yanına yerleşene kadar namluya hafifçe dokunarak şırınganın içindeki fazla hava ve hava kabarcıklarını çıkarın ve havayı çıkardıktan sonra şırınga namlusunun ucunu parafin filmi ile örtün.
Şimdi doku koyulaşana kadar pozitif basınç oluşturmak için pistona dikkatlice bastırın. Ardından, negatif basınç oluşturmak için pistonu çekin. Parafin filmi ve pistonu çıkarın ve apoplastla ekstrakte edilen bakterileri içeren sıvıyı toplayın.
Tek hücreli bir analiz için, damıtılmış suda% 1.5'lik bir agaroz çözeltisi hazırlayın. Eritildikten sonra, yan yana yerleştirilmiş iki mikroskopi slaytı arasındaki boşluğu doldurmak için yeterli hacim ekleyin ve üstüne başka bir slayt yerleştirin. 15 dakika sürmelerine izin verin ve üstüne yerleştirilen slaytı dikkatlice çıkarın.
Bir bıçak kullanarak, agaroz pedini kullanmadan önce beş milimetre beş milimetre parçaya bölün. Paralel olarak, apoplastla ekstrakte edilen bakterilerin bir milimetresini santrifüjleyin. Bir pipet kullanarak süpernatantı dikkatlice çıkarın ve hücreleri konsantre etmek için peleti 20 mikrolitre suya yeniden askıya alın.
Konsantre hücrelerin iki mikrolitrelik bir damlasını 0.17 milimetrelik bir kapak kayması üzerine yerleştirin ve damlayı bir parça agaroz pedi ile örtün. Belirli lazerler kullanarak yeşil floresan bakterileri tanımlamak için bakteri preparatını konfokal mikroskop altında görselleştirin. Parlak alanı kullanarak tüm bakterileri tanımlayın ve her iki alanı birleştirin.
Akış sitometrisi ile analiz yapmak için, apoplastla ekstrakte edilen bakteri süspansiyonlarının bir alikotunu alın. Akış sitometresini kullanarak analiz edin ve 100.000 olay elde edin. HRPL GFP ekspresyonu GFP floresan ile izlenir.
Nokta grafiği grafikleri, GFP'nin popülasyondaki hücre boyutuna karşı floresan yoğunluğu dağılımını gösterirken, histogramlar GFP'nin hücre sayılarına karşı floresan yoğunluğunu gösterir. Floresan mikroskopi görüntüleri, hrpL OFF ekspresyonu ile ilişkili heterojen GFP seviyelerini göstermektedir.
GFP floresansı düşük olan veya hiç olmayan bakteriler gözlenir. En iyi sonuçlar için, bitki dokusuna zarar vermemek ve böylece bitki hücresel içeriğinden kaynaklanan kontaminasyonu sınırlamak için bakteri ekstraksiyon adımları sırasında nazik olun. Elde edilen bakteri örnekleri, bitki kontaminasyonunu azaltmanın, sonraki bakteriyel genomik veya transkriptomik analiz için nükleik asit ekstraksiyonları gibi bir avantaj olduğu diğer amaçlar için kullanılabilir.
