Bu protokol, F0 CRISPR enjekte edilen zebra balığı spermini kullanarak binlerce genomu hızlı bir şekilde taramak için bir yöntem açıklamaktadır. Bu teknik erişilebilirliği açısından avantajlıdır. Pahalı, uzmanlaşmış dizileme tabanlı yaklaşımlardan ziyade, yöntemimiz F0 erkek taşıyıcılarını indeller veya spesifik genom düzenlemeleri için taramak için PCR kısıtlama enzimleri ve jel elektroforezi kullanır.
Bu prosedürün en zor kısmı spermi hızlı bir şekilde elde etmektir, ancak çok sayıda dismorfik balıkla çalışırsak in vitro fertilizasyon için iyi bir teknik haline gelir ve bu nedenle bize sorun çıkaran balıkları geçmenin kolay bir yoludur. Hem vahşi tip hem de F0 balıkları için üreme tankları kurarak başlayın ve tankları gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün erkek balığı uyuşturduktan sonra, temiz bir kağıt havlu yığınına aktarmak için oluklu bir kaşık kullanın.
Fazla suyu gidermek için balıkları yavaşça yuvarlayın. Herhangi bir suyu, temiz bir katlanmış doku ile kurutarak çıkarın. Oluklu kaşığı kullanarak balıkları hazırlanan süngere aktarın.
Balık ventral tarafını yukarı doğru yerleştirin ve anal yüzgeçlerin etrafındaki alanı temiz bir katlanmış doku kağıdı ile hafifçe lekeleyin. Spermi toplamak için, pelvik yüzgeçleri orta hattan yavaşça uzaklaştırmak ve kloakı açığa çıkarmak için kılcal bir tüp kullanın. Kılcal tüpü kloakın yanına yerleştirin.
Parmaklarınızla veya bir çift filtre forsepsle, balığın kenarlarını solungaçlardan aşağıya doğru hafifçe sıkın. Kılcal hareketi kullanarak, spermi tüpte toplayın ve 40 mikrolitre 50 milimolar sodyum hidroksit çözeltisi içeren bir PCR tüpüne yerleştirin, ardından numuneyi tüpe atın. Sperm örneklerini mini bir santrifüjde döndürdükten sonra, PCR tüplerini bir termal döngüleyiciye yerleştirin.
Numuneleri 95 santigrat derecede 40 dakika ısıtarak ve ardından 25 santigrat derecede soğutarak döngüleyiciyi çalıştırın. Numuneleri döngüleyiciden çıkardıktan sonra, pH sekizinin bir molar tris hidroklorüründen 10 mikrolitre ekleyerek pH'ı nötralize edin. Süspansiyonu aspire ederek karıştırın ve ardından numuneleri santrifüj edin.
Ön ısıtma için termal döngüleyiciyi 95 santigrat dereceye ayarlayın. Bu arada, her sperm örneği için 25 mikrolitre PCR reaksiyon karışımı hazırlayın. Yukarı ve aşağı pipetleme yaparak iyice karıştırın, ardından numuneleri döndürün.
Numuneleri önceden ısıtılmış termal döngüleyiciye yerleştirin ve döngüyü ayarlayın. Bir jel çözeltisi elde etmek için, agaroz tozu, jel lekesi ve TBE tamponunun karıştırılmasıyla hazırlanan% 4'lük bir agaroz jel çözeltisini mikrodalgada pişirin. Jel çözeltisini bir jel döküm çerçevesine dökün ve bir tarafa bir tarak yerleştirin.
Jel katılaşmasından sonra, tarağı dikkatlice çıkarın. Jeli, kuyucuklar negatif elektrota en yakın olacak şekilde bir elektroforez teçhizatına yerleştirin. TBE çalışma arabelleğini, kuyular tamamen suya batırılana kadar makineye dökün.
Beş mikrolitre DNA merdivenini ilk kuyucuğa pipetleyerek jeli yüklemeye başlayın. Kalan kuyucukları 5 ila 10 mikrolitre PCR ürünü ile yükleyin. Amplikonların yeterli şekilde ayrılmasını sağlamak için jeli 150 voltta 1 saat çalıştırın.
DNA bantlarını görüntülemek için jel görüntüleyiciyi kullanın. p2ry12 lokus analizi, vahşi tip amplikonun 250 baz çifti uzunluğunda tek bir bant gösterdiğini, indels içeren F0 enjekte edilen erkek amplikonların çoklu bantlar halinde çalıştığını gösterdi. DNAH10 lokus analizi, vahşi tip amplikonun tek bir 400 baz çifti uzunluğunda bant olarak çalıştığını göstermiştir.
İndel içeren F0 enjeksiyonlu erkek amplikonlar, çoklu bantlar halinde veya jel hareketliliği azalmış tek bir bant olarak çalıştı. F0 enjekte edilen bir numaralı erkek, sindirilmiş üründe, PCR ürününde bulunmayan ek bir banda sahipti ve bu da onu mutant knock-in line kurulumu için en iyi kurucu aday haline getirdi. Bir erkek balık sıkıldığında sperm üretmezse, balıkları bir hafta boyunca dinlendirmek ve çok sert sıkmak ve onlara zarar verme riski yerine tekrar denemek en iyisidir.
FC veya erkek kurucu geçtikten sonra, alellerin F1 soyunda sırasının doğrulanması gerekir. F1 amplikonlarını doğrudan sıralamak ve heterozigot alel analizi yapmak bunu yapmanın kolay bir yoludur.
