This work was supported by NIH grants R21 HD068949-01 and RO1 GM065303.

Madison ve Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) kılavuzların (University of Wisconsin - - Madison Güvence numarası A3368-01) Tüm hayvan deneyleri Wisconsin Üniversitesi göre yapılmıştır. 1. Interrupted Çiftteşme aracılığıyla Yumurta Toplama için Females seçme NOT: IVF-tabanlı protokoller manuel basınç ile 9 arasındaki kadınlarda olgun yumurta ekstrüzyon güveniyor. Önceki protokoller yumurta bırakma davranışı geçiren kadınlarda olmadan tankları veya çift çiftleşmelerin doğrudan kadın kullanmış, ancak (zebra balığı hatta bağlı olarak yaklaşık% 20 ya da daha az), bu kadınların sadece küçük bir bölümü manuel basınç üzerine haddelenmiş ve yetkili yumurta verim. geliştirilmiş bir prosedürde, dişiler önceden sıralanmış doğrudan görsel gözlem ile yumurtlama için, çiftleşme anında kesinti takip etmektedir. Bu prosedür olarak neredeyse tüm kadın haddelenmiş ve yetkili yumurta bu kesintiye çiftleşme adımı verimi ile önceden seçilmiş, çok etkilidirelle bastırılarak. <ol><li> deneyden önce öğleden sonra, standart zebrabalıkları çiftleşme kutularında istenen Zebra balığı gerginlik çiftleşme çiftleri kurdu. Bir çiftleşme kutusu bölünme yoluyla ya da yumurtlama insert altında erkek ve insert içinde kadın yerleştirerek ya henüz fiziksel olarak onlardan ayrı kadın aynı odasında erkek tutun. </li><li> Bu çiftleşme başlar böylece deney sabahı, aynı yumurtlama insert içinde erkek ve kadın hem de yerleştirme, fiziksel bölümü çıkarın. </li><li> Görme doğal çiftleşme sırasında yumurta ekstrüzyon tespit etmek için çiftleşme çiftlerini içeren tanklar inceleyin. Yumurta ekstrüzyon, ayrı erkek ve dişi ilk belirtileri de üreme kesmek için. Erkeklerde ayrılmasının ardından, önceden seçilmiş kadın ayrı ayrı ya da aynı tanka toplanmış tutun. (Tipik 50-150 yumurta / dişi) istenen embriyo sayısına bağlı olarak birden fazla kadın kullanın. </li></ol> 2. Sperm Çözüm hazırlanması NOT: IVF rBir sperm çözüm olgun yumurta maruz Elies. Bu çözüm (HS2 tedavisi üzerine homozigot diploid embriyo haline) haploid zigot oluşturmak için, ya da (HS2 tedavi haline tetraploid embriyolar üzerinde olan) UV-işlenmiş diploid zigot oluşturmak için, işlenmemiş olabilir. Önceki sperm hazırlama protokolleri canlı erkeklerin anal bölge arasında Milt toplamak için kılcal tüpler kullanımı önerilen, ancak erkek sadece küçük bir bölümü Milt 9 vermiştir olarak etkisiz bir süreçtir. Aşağıda sunulan protokol daha güvenilir sonuçlar verir makaslanmış disseke testislerden sperm hazırlama, yerine dayanır. <ol><li> (Çözümler, 1, 2, 4 ve 5) tüm bileşenlerin içeren öncesinde Hank ön-karışım çözeltisi olarak zaman Hank çözeltisi hazırlayın sodyum bikarbonat çözeltisi (dışında Çözelti 6). Deneyin (Tablo 1) sabah Çözüm 6 taze hazırlayın ve karışıma ekleyin. Hanks solüsyonu (nihai solüsyon yapmak için, sabahı hazırlamakIVF işlemi), Hank Premix 990 ul ve taze yapılmış Çözüm 6 10 ul birleştirir. </li><li> Klimalı suda bir 0.016% çözüm olarak tricaine overexposure tarafından erkekleri euthanize. <ol><li> su içinde% 0.2 Stok çözelti olarak tricaine hazırlama (1 M Tris pH 9.0 ile pH 7.0 değerine tampon A) ve 4 ° C&#39;de tutun. Bir beher içinde, 100 ml su başına tricaine stok çözeltisi 8 ml ilave edilir, ve tricaine çözeltisine erkek aktarmak için bir ağ yerleştirin. </li><li> (100 ul / kavrama 10 kavrama dölleme, 1 mi Hank çözeltisi içinde toplanan 10 erkek örn testis) erkek başına 100 ul karşılık gelen Hank çözeltisi hacminde döllenmesi için gerekli kavrama için bir erkek Testislere eşdeğer kullanın. </li><li> 15 dakika boyunca solungaç hareketlerinin durdurulması ile ötenazi onaylayın. Ötenazi sonra, bir kaşıkla kaptan erkekleri kaldırın. koşullandırılmış su ile kısaca erkekleri durulayın ve bir kaç yerle ilgili kısaca yerleştirerek onları hafifçe kurulayınkağıt havlu. </li></ol></li><li> testisler, diseksiyon makas veya jilet kullanarak ilk başını kesmek ötenazi erkek kaldırmak ve yansıyan ışık kaynağı ile scissors.Under bir mikroskop diseksiyon ile karın boyunca uzunlamasına kesim yapmak, diseksiyon forseps ile iç organları çıkartmak için. forseps ile testisler kitlelerin her çekin ve Hank&#39;in çözeltisi içeren mikrosantrifüj tüp içine koyun. Not: Testis cloaca çevresinde birbirlerine iki uzatılmış gövde duvarları yanında bulunan saydam görünüş yapıları ve her şekilde tespit edilebilir. Testis diseksiyonu sonrası bir petri plakası yüzeyinde ve Hank çözeltisi koymadan önce 2-3 dakika kalabilirler. </li><li> dar bir spatula ile testislerin kesme ve / veya hafifçe hava kabarcığı oluşumunu engelleyerek, yukarı pipetleme ve 1000 ul ucu mikropipet ile çözelti içinde aşağı 5-6 kez testisler tarafından solüsyon içine sperm bırakın. testisler enkaz yerleşmek edelim. </li><li> o kadar 2-3 saat boyunca onun kudret tutabilir buz, sperm çözümü saklayın. Sperm çözeltisi UV tedaviye başlamadan halinde geride testislerin parçalar bırakarak temiz bir mikrosantrfuj tübüne solüsyonu aktarın. </li></ol> 3. UV Tedavi Not: UV muamelesi embriyoda etkin olmayan hale getirilmesi için sperm DNA çapraz bağlanması için kullanılır. jinogenetik haploid veya homozigot jinogenetik diploid embriyo üreten Bu adım yalnızca kullanılır. UV tedavisi için sperm çözüm testis (adım 2.4) parçalarından ayrılması gerektiğini, gibi büyük parçalar UV tedavisi sperm kalkan olabilir. <ol><li> Bir buz yatakta oturmuş bir depresyon cam levha temiz, kuru bir kuyuda (bir petri plakası içinde örneğin buz) sperm çözüm aktarın. de cam plaka başına sperma çözeltisi 1 ml kadar kullanın. </li><li> UV lamba altında buz yatakta depresyon cam plaka koyarak UV sperm çözüm Açığa. 115 V (60 Hz ile 90 saniye boyunca sperm çözüm tedavi, 0.68A) 19 cm (7.5 inç) mesafe UV-lamba. Bir pipet ucu ile hafifçe UV tedavisi sırasında her 30 saniyede (temiz pipet her 30 saniye kullanın) çözümü karıştırın. </li><li> Temiz bir pipet ucu ile mikropipet kullanılarak, yeni bir mikrosantrifüj tüpüne tedavi sperm çözeltisi aktarın. (Ekstraksiyon 2-3 saat daha uzun) IVF için gerekli olana kadar buz üzerinde saklayın. </li></ol> Olgun Yumurta 4. Manuel eldesi NOT: kolayca anestezi ve manuel basınç altında yumurta verecektir doğal çiftleşmelerin kesintiye elde Dişiler. Bu işlem sırasında, tricaine tedavi dikkatli bir şekilde kadın kurtarma engelleyebilir aşırı maruz önlemek için kontrol edilmelidir. <ol><li> tricaine çözüm ışığa maruz kalma ile kadın uyutmak: şartlandırılmış su çözümü tricaine net transfer kadın balık durana kadar, yaklaşık 2-5 dakika boyunca (klimalı balık suyun 8 Tricaine% 0.2 stok solüsyonu 100 ml ekleyerek yapılan) solungaç hareketi. </li> &lt;li&gt; En kısa zamanda bir kadın solungaç hareketi durur, onu toplamak ve kısaca koşullandırılmış suyla durulayın için bir kaşık kullanın. Yine, balık taşımak bir kağıt havlu birkaç yerle ilgili kısaca ve tekrar tekrar yerleştirerek hafifçe kurulayın, sonra temiz, kuru bir 10 cm çapında petri tabak aktarmak kaşık kullanarak. Potansiyel solungaç kapakçık zarar vermemek için, arka yöne anterior kaşıkla balık yaklaşın. </li><li> erken su ile aktif hale gelen herhangi bir serbest yumurta önlemek için, yavaşça ileri anal yüzgeç bölgeyi kurutmak için laboratuvar mendil veya yumuşak doku kullanın. parmaklarını Nemlendirme hafifçe su ile (onlara balık pulları yapışmasını önlemek için) destek olarak dişinin sırtına bir elin bir parmağı koyun ve yumurta haddelenmiş hale gelene kadar, diğer elinin bir parmağı ile dişinin karın boyunca hafif basınç uygulayın. </li><li> kadın bedeni yumurta uzaklaşmaya dar bir spatula kullanın. kurtarma için koşullu su ile bir tanka geri kadın yerleştirin. <br/&gt; NOT: kadın vücudunun bir tarafında yatıyor iken yumurta ekstrüde sonra, o devrildiğinde olabilir ve onu diğer tarafta tekrarlanan süreç ek yumurta elde etmek. , Kadın tam iyileşme sigorta karın sadece nazik manuel basınç uygulayın ve en az 2 dakika içinde suya geri dönmek için solungaç hareketi durağına prosedürünü yürütmek için. </li><li> (Su maruziyeti ile) etkinleştirin ve ekstrüzyon sonra eş zamanlı olarak 90 saniye içinde (sperm çözüm ilavesi ile) yumurta döllemek (bkz bölüm 5). </li></ol> Tüp Bebek 5. NOT: Doğal melezlerde Zebra balığı gübreleme, dış çiftleşme sırasında yumurta, su ve sperm ile eşzamanlı serbest bırakılması ve aktivasyon bağlıdır. suyun mevcudiyetinde sperm çözeltisi yumurta maruz bırakılarak vitro fertilizasyon taklit bu işlem. Su hacmi etkili bir sperm arttırmak için (1 mi), ilk küçüktür. Sperm tarafından bağlayıcı 15-20 sn 10 &lt;içinde gerçekleşir/ Sup&gt; ve su miktarı daha sonra arttırılabilir. Koryon sperm 11,12 bağlanması için yetki penceresi sınırlayarak debriyajın yakın senkronizasyon daha katkıda bulunur kaldırma. Elde edilen embriyolar için erken klevaj aşamalarında büyük ölçüde eş zamanlı olarak hücre bölünme döngüsü sergiler. <ol><li> (Bir erkek itibaren testislerin eşdeğerine karşılık gelen - Bölüm 2 bakınız) sperm çözeltinin 100 ul ekleyin bir petri tabakta ekstrüde yumurta debriyaja. Yavaşça yumurta zarar görmemesi için petri tabak yüzeyinden ucu kaldırmayın emin olmak birlikte sperm ve yumurta karıştırmak için yumurta arasında sperm çözümü eklemek için kullanılan pipet girdap. </li><li> Hemen embriyonik orta (E3) solüsyonu 1 ml ekleyerek yumurta aktive hafifçe pipet ile dönen tarafından ve yine hafifçe yumurtaları karıştırın ve sperm (klimalı su da bir Parça 5 ile 7 E3 için yedek olarak kabul edilir). Döllenme için zamanlama göreli başlatmak için bir zamanlayıcı başlatın. </li&gt; <li> 1 ml hacminde 1 MPF&#39;e anda, E3 ile plaka sel. Devam etmeden önce, tam koryon genişleme de dahil olmak üzere yumurta aktivasyonu, izin 10-12 MPF&#39;e kadar rahatsız bırakın. </li></ol> 6. Isı Şoku Tedavisi NOT: Erken embriyo uygulanan bir ısı şoku sonraki hücre döngüsü 2 sırasında iğ oluşumunu sürücü Sentriyoller tamamlanmamış bir tamamlayıcısı sonuçlanan centriole çoğaltılması engeller. Karık oluşumu 13 eksikliği dönüş sonuçlarında iğ olmaması. <ol><li> chorions genişlemesi (10-12 mpf) sonra, bir çay süzgeci içine petri tabak embriyolar dökün. çay süzgeci içinde kalan embriyolar toplamak için E3 ile yıkama şişesi kullanılarak petri tabak durulayın. </li><li> 28.5 ° C &#39;de E3 önceden ısıtılmış bir banyoda bir beher içinde embriyolar çay süzgeci yerleştirin. su banyosu sıcaklığına Beheri ve E3 öncesi denge ve yeterli E3 olduğundan emin olmak ve böylece çay tüm embriyolarsüzgeç ortamına maruz kalmaktadır. </li><li> 22 MPF&#39;e at, kısaca, 28.5 ° C su banyosunda çay süzgeci kaldırmak aşırı nemi ortadan kaldırmak için kağıt havlu üzerine kurulayın ve 41.4 ° C&#39;de ısı banyosunda benzer önceden ısıtılmış E3 beher içine yerleştirin. </li><li> 24 MPF&#39;e anda, kısa blot sonra 28.5 ° C su banyosunda geri E3 çay süzgeci aktarın. 29 MPF az 10 cm Petri levhaya çay süzgeci embriyolar aktarmak E3 ile yıkama şişesi kullanın. </li></ol> One-döngüsü Sitokinez Stall ile Embriyolar 7. Seçim <ol><li> süresi 35-45 MPF&#39;e sırasında iletilen bir ışık kaynağı ile bir mikroskop altında, 2-hücreli aşamaya simetrik bölünme geçiren ve olan bu embriyolar, bu nedenle döllenir seçin. Hücre bölünmesini geçiren olmayan embriyolar çıkarın. </li><li> İlk hücre döngüsü sırasında normal hücre bölünmesi için seçilen döllenmiş embriyolar, gözlemleyerek devam edin ve sn boyuncakinci hücre döngüsü (50-65 mpf). </li><li> 4 hücreleri ( &quot;No durak&quot;, 2: 4 hücreli embriyonun 2 düzeneği standart) aşağıdaki kategoriler (Şekil 2C) &#39;ye göre Sıralama embriyolar; 3 hücreleri (bir sapkın 2 küçük hücrelerde &quot;kısmi durak&quot;, 1 büyük hücreli düzenlemesi); 2 hücreleri (: 2 hücreli embriyo özdeş 1 düzenleme embriyo 1 bir tek hücre döngüsü gecikmesi sergileyen, &quot;durdu&quot;). taze petri tabak içine durdu embriyolar sıralayın. NOT: Bu aşamada, 2 embriyolar: 2 düzenleme de blastomere hücre bölünmesi durak yapılan ikinci bir hücre döngüsü sırasında hangi karşılık gelir; bir sapkın 2 küçük hücrelerde embriyolar: 1 büyük hücreli düzenlemesi ısı şoku bir blastomere ikinci hücre döngüsü sırasında bir hücre döngüsü durak neden ancak diğer burada karşılık gelir; ve embriyolar 1 &quot;durdu&quot;: 1 düzenlemenin ikinci hücre döngüsü sırasında her iki blastomer istenilen hücre bölünmesini yapılan bu nereye tekabülahır. Durduruldu embriyolar sonraki hücre döngüsü döneminde (65-80 mpf) sırasında hücre bölünmesini devam etmesi gerekir. Blastomer düzenleme mili 2,14 stabilize nedeniyle önceki hücre döngüsü eksik ipuçlarına, değişken olabilir, ancak çoğu embriyolar normal gelişim geçirebilen bir nispeten normal blastula oluşturacaktır. </li><li> Embriyolar 10 cm plaka başına 80 embriyo limitli, Petri plakasında geliştirmeye olanak sağlar. 24 HPF, onlar indirgenmiş ekseni uzantısı aksine, diploid veya homozigot diploid embriyolar 6 (eksen uzantısı (Şekil 3A, 3C) normal ölçüde) normal morfoloji özelliği ve haploidlerin artan vücut kalınlığı, karakteristik olup olmadığını belirlemek için embriyolar gözlemlemek (Şekil 3B)), ve / veya altın veya albino ve bu deneyler 36 MPF, (Şekil 3 ve aşağıya bakınız) 2,6,9 genetik pigment işaretlerini kullanarak diploidization değerlendirmek. </li&gt; <li> haploid morfoloji var, ya da parçalanmış olan veya diğer fena halde anormal kusurları sergilemek görünen herhangi bir embriyolar çıkarın. NOT: İstenirse, günlük olarak parçalanmış ya da fena halde anormal embriyolar kaldırmak için devam eden ve orta yenilemek için taze E3 eklerken embriyolar, 5 gün sonra döllenme kadar geliştirmeye olanak sağlar. Not: Hayatta kalan embriyolar da kuluçka sistemine aktarılması ve standart koşullar altında beslenerek 5. günde swimbladder şişirildikten sonra yetiştirilebilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+clones+of+homozygous+diploid+zebra+fish+(Brachydanio+rerio).">Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio).</a> Nature. 291, 293-296 (1981).</li><li>Heier, J., Takle, K., Hasley, A., Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ploidy+manipulation+and+induction+of+alternate+clevage+patterns+through+inhibition+of+centrosome+duplication+in+the+early+zebrafish+embryo.">Ploidy manipulation and induction of alternate clevage patterns through inhibition of centrosome duplication in the early zebrafish embryo.</a> Dev. Dyn. 244, 1300-1312 (2015).</li><li>Zhang, X., Onozato, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrostatic+pressure+treatment+during+the+first+mitosis+does+not+suppress+the+first+cleavage+but+the+second+one.">Hydrostatic pressure treatment during the first mitosis does not suppress the first cleavage but the second one.</a> Aquaculture. 240, 101-113 (2004).</li><li>Zhu, X. P., You, F., Zhang, P. J., Xu, J. H., Sun, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+hydrostatic+pressure+on+microtubule+organization+and+cell+cycle+in+gynogenetically+activated+eggs+of+olive+flounder+(Paralichthys+olivaceus).">Effects of hydrostatic pressure on microtubule organization and cell cycle in gynogenetically activated eggs of olive flounder (Paralichthys olivaceus).</a> Theriogenology. 68, 873-881 (2007).</li><li>Vertii, A., Zimmerman, W., Ivshina, M., Doxsey, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosome-intrinsic+mechanisms+modulate+centrosome+integrity+during+fever.">Centrosome-intrinsic mechanisms modulate centrosome integrity during fever.</a> Mol. Biol. Cell. 26, 3451-3463 (2015).</li><li>Walker, C., Detrich, W. H., Westerfield, M., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish: Genetics and genomics. Vol. 60 Methods in Cell Biology. , 43-70 (1999).</li><li>Blanco-Vives, B., S&#225;nchez-V&#225;zquez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronisation+to+light+and+feeding+time+of+circadian+rhythms+of+spawning+and+locomotor+activity+in+zebrafish.">Synchronisation to light and feeding time of circadian rhythms of spawning and locomotor activity in zebrafish.</a> Physiol. Behav. 98, 268-275 (2009).</li><li>Dekens, M. P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+regulates+the+cell+cycle+in+zebrafish.">Light regulates the cell cycle in zebrafish.</a> Curr. Biol. 13, 2051-2057 (2003).</li><li>Pelegri, F., Schulte-Merker, S., Detrich, W., Zon, L. I., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish: Genetics and Genomics Vol. 60 Methods in Cell Biology. , 1-20 (1999).</li><li>Hart, N. H., Becker, K. A., Wolenski, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sperm+entry+site+during+fertilization+of+the+zebrafish+egg:+localization+of+actin.">The sperm entry site during fertilization of the zebrafish egg: localization of actin.</a> Mol. Reprod. Dev. 32, 217-228 (1992).</li><li>Tsaadon, A., Eliyahu, E., Shtraizent, N., Shalgi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=When+a+sperm+meets+an+egg:+block+to+polyspermy.">When a sperm meets an egg: block to polyspermy.</a> Mol. Cell. Endocrinol. 252, 107-114 (2006).</li><li>Wong, J. L., Wessel, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defending+the+zygote:+search+for+the+ancestral+animal+block+to+polyspermy.">Defending the zygote: search for the ancestral animal block to polyspermy.</a> Curr. Top. Dev. Biol. 72, 1-151 (2006).</li><li>Rappaport, R., Rappaport, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+cleavage+furrows+by+the+mitotic+spindle.">Establishment of cleavage furrows by the mitotic spindle.</a> J. Exp. Zool. 189, 189-196 (1974).</li><li>W&#252;hr, M., Tan, E. S., Parker, S. K., Detrich, H. W. I., Mitchinson, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+for+cleavage+plane+determination+in+early+amphibian+and+fish+embryos.">A model for cleavage plane determination in early amphibian and fish embryos.</a> Curr. Biol. 20, 2040-2045 (2010).</li><li>Yabe, T., Ge, X., Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+maternal-effect+gene+cellular+atoll+encodes+the+centriolar+component+Sas-6+and+defects+in+its+paternal+function+promote+whole+genome+duplication.">The zebrafish maternal-effect gene cellular atoll encodes the centriolar component Sas-6 and defects in its paternal function promote whole genome duplication.</a> Dev. Biol. 312, 44-60 (2007).</li><li>Poss, K. D., Nechiporuk, A., Stringer, K. F., Lee, C., Keating, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ+cell+aneuploidy+in+zebrafish+with+mutations+in+the+mitotic+checkpoint+gene+mps1.">Germ cell aneuploidy in zebrafish with mutations in the mitotic checkpoint gene mps1.</a> Genes Dev. 18, 1527-1532 (2004).</li><li>Sakai, N., Burgess, S., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+in+vitro+fertilization+of+zebrafish+eggs+in+Hank's+saline+containing+bovine+serum+albumin.">Delayed in vitro fertilization of zebrafish eggs in Hank's saline containing bovine serum albumin.</a> Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 6, 84-87 (1997).</li><li>Roco, A. S., Olmstead, A. W., Degitz, S. J., Amano, T., Zimmerman, L. B., Bullejos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coexistence+of+Y,+W,+and+Z+sex+chromosomes+in+Xenopus+tropicalis.">Coexistence of Y, W, and Z sex chromosomes in Xenopus tropicalis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112, 4752-4761 (2015).</li><li>Streisinger, G., Singer, F., Walker, C., Knauber, D., Dower, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segregation+analyses+and+gene-centromere+distances+in+zebrafish.">Segregation analyses and gene-centromere distances in zebrafish.</a> Genetics. 112, 311-319 (1986).</li><li>Dekens, M. P. S., Pelegri, F. J., Maischein, H. -. M., N&#252;sslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+maternal-effect+gene+futile+cycle.is+essential+for+pronuclear+congression+and+mitotic+spindle+assembly+in+the+zebrafish+zygote.">The maternal-effect gene futile cycle.is essential for pronuclear congression and mitotic spindle assembly in the zebrafish zygote.</a> Development. 130, 3907-3916 (2003).</li><li>Pelegri, F., Mullins, M., Detrich, H. W., Westerfield, M., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Met. Cell Biol. Vol. 104. , 83-120 (2011).</li></ol>

The authors do not have competing financial interests.

kritik adımlar In vitro fertilizasyon etkili koşullar altında çalışmak için çok önemlidir. olgun yumurta (adım 1) iyi bir tedarik sigortalamak için dişiler çiftleşmek için ayarlanmış en az 5 gün süreyle çiftleşme haç kurulmuş olmamalıdır ve gebe görünmelidir. ıslahının kesinti sırasında, bir gözlemci doğal yumurta ekstrüzyon ilk görünüm için yeterli 15-30 tankları izleyebilirsiniz. İlk yumurtalar çoğu yumurta IVF işlemi için kadın iç kalmasını sa...

Bu protokol, jinogenetik haploidlerin (Şekil 1) ya da tetraploids üretimi homozigot jinogenetik diploid üretimi gibi zebra balığı embriyolar bölgesi ploidinin işleme izin verir. Bu tam bir hücre döngüsü (Şekil 2A, 2B) karşılık gelen sitokinez bir gecikme uyarılması ile elde edilir. sitokinez önemli bir döngü gecikmesi ısı şoku ile muamele ile elde edilmektedir. Orijinal olarak Streisinger ve arkadaşları tarafından tarif Isı Shock (HS) standart protokol ilk hücre döngüsü 1 sırasında bir döngüsü hücre bölünmesi durak sonuçlanan dönem 13-15 MPF&#39;e sırasında sıcaklık darbe yer. Bu protokolün etkinliği son zamanlarda ısı şok tedavi kayan zamansal pencere ile erken hücre döngüleri tarayarak geliştirilmiştir. Bu tarama, hala ilk hücre döngüsünün (22-24 mpf) içinde, bir ısı şok daha sonraki bir zaman noktası tespit olduğunu EMBR daha yüksek bir oranda sonuçlarıBu durumda, ikinci bir hücre döngüsü 2 etkileyen bir döngüsü hücre bölünmesi durak ile yo. İlk hücre döngüsü sırasında deneysel manipülasyonlar ikinci hücre döngüsü sırasında hücre bölünmesi ile müdahale ve DNA içeriği tekrarını neden gözlem diğer balık türlerinin 3,4 rapor edilmiştir. terimi &quot;2&quot; ısı darbesinin, standart HS yöntemi daha sonraki bir zaman noktasında meydana gelmesi ve HS2 neden olduğu hücre döngüsü gecikmesi ikinci bir hücre döngüsü sırasında meydana yansıtır - Biz Isı Şoku 2 (HS2 olarak tadil edilmiş protokole bakınız ). Bu çalışmalar, ısı şokundan sonra sitokinez tutuklama temeli aşağıdaki hücre döngüsünde iğ oluşumunu ve karık indüksiyon etkileyen ısı darbesi sırasında centriole çoğaltılması engellenmesi olduğunu göstermiştir. HS2% 100 yaklaşıyor hücre döngüsü tutuklama verimleri sonuçları ve standart HS 2&#39;den 4 kez daha yüksek Ploidi çoğaltılması up oranları. Embriyolar tedavi zekâha blastomer hücresi devir esnasında ısı şoku birçok zararlı etkileri gösterirler, bu ısı şoku düşündüren hücre bölünmesi 2 için gerekli çoklu süreçleri etkiler. Isı şok hücre bisiklet (süre 0-30 mpf) başlamadan önce uygulandığında Öte yandan, centriole çoğaltılması ile özel girişim ile tutarlı etkilere sahip görünüyor ve diğer temel hücre süreçlerini 2 etkileyecek gibi görünmüyor . Bu çalışmalar blastomer bölünme başlamadan önce zaman özellikle centriole inhibisyonu yoluyla ploidi işlemek için bir araç olarak ısı şok kullanarak mükellef bir gelişimsel dönem gibi görünüyor gösterdi. Centriole çoğaltılması ısı şok belirgin bir seçicilik altında yatan nedeni bilinmemektedir, ancak örneğin lökositler 5 gibi bazı hücre tiplerinde, ısı stresi altında gözlenen sentrozom alt yapılar, seçici bir bozulma ile ilişkili olabilir. embriyonik de zamansal senkronizasyonuvelopment in vitro fertilizasyon (IVF) ile elde edilir. üzerine tetraploid hale tek döngüsü sitokinez durak HS2 kaynaklı diploid embriyolar gübreleme sonuçları sırasında işlenmemiş sperm kullanımı. DNA&#39;sını inaktive çapraz bağlantılar, bir döngü sitokinez durma jinogenetik diploitler 2 olur HSII kaynaklı üzerine jinogenetik haploid embriyolar 6, sonuçlar taşıyan UV ile muamele edilmiş sperm, kullanımı. Çünkü ortaya çıkan tüm genom çoğaltılması, ikincisi jinogenetik diploitler genom boyunca her loküsündeki homozigot bulunmaktadır. özlülük için, biz &quot;haploidlerden&quot; ve &quot;homozigot diploid&quot; olarak homozigot jinogenetik diploid embriyolar olarak haploit embriyolar jinogenetik bakın. yaşayabilir ve fertil ise, homozigot diploitler steril ve ölümcül içermeyen hatları başlatmak için kullanılabilir. HS2 tarafından uyarılan doğrudan homozigotlu¤u de kolayca mut heterozigot taşıyıcısı olan kadınlarda homozigot diploidlerin beri, genetik analiz veya genetik ekranlar dahil edilmelidiryüksek ve sabit (% 50) oranlarında 2 de homozigotluğu ve ations sergi oranları. Aşağıdaki protokol HS2 gerçekleştirmek ve tam homozigotluğu ile Ploidi tekrarını ikna etmek için gereken adımları açıklar. tetraploid üretimi için, spermin çözeltisi muamele edilmemiş olmalıdır. homozigot diploid üretimi için, spermin, UV muamele ile inaktive edilmelidir. Tartışmada tarif edildiği gibi ek olarak, gözle görülebilir pigment belirteçler homozigot diploid belirlenmesini kolaylaştırmak için kullanılabilir. En iyi sonuçlar için IVF işlemi bu süre içinde meydana gelmelidir yüzden öncelikle ışık döngüsüne 7 ve hem yetişkinler hem de yumurta inisiyasyon ilk 3 saat boyunca balığı arkadaşı, sirkadiyen ritimler 8 duyarlıdır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Zebrafish mating boxes</td>
			<td style="width:71px;">Aqua Schwarz</td>
			<td style="width:119px;">SpawningBox1</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KCl</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S3264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P9791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CaCl2</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MgSO4-7H2O</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">63138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tricaine</td>
			<td style="width:71px;">Western Chemical</td>
			<td style="width:119px;">Tricaine-D (MS 222)</td>
			<td>FDA approved (ANADA 200-226)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tris base</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">77-86-1</td>
			<td>to prepare 1 M Tris pH 9.0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HCl</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">920-1</td>
			<td>to prepare 1 M Tris pH 9.0</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fish net (fine mesh) (4-5 in)</td>
			<td style="width:71px;">PennPlax</td>
			<td style="width:119px;">(ThatFishThatPlace # 212370)</td>
			<td>available in ThatFishThatPlace</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Plastic spoon</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>available in most standard stores</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dissecting scissors</td>
			<td style="width:71px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">14091-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dissecting forceps</td>
			<td style="width:71px;">Dumont</td>
			<td style="width:119px;">SS</td>
			<td>available from Fine Science Tools</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dissecting stereoscope (with transmitted light source)</td>
			<td style="width:71px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">SMZ645</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Reflective light source (LED arms)</td>
			<td style="width:71px;">Fostec</td>
			<td style="width:119px;">KL1600 LED</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petri plates 10 cm diameter</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Eppendorf tubes 1.5 ml</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ice bucket</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pipetteman P-1000</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pipette tips 1000 &#181;l</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Narrow spatula</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">14-374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Depression glass plate</td>
			<td style="width:71px;">Corning Inc</td>
			<td style="width:119px;">722085 (Fisher cat. No 13-748B)</td>
			<td>available from Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">UV lamp</td>
			<td style="width:71px;">UVP</td>
			<td style="width:119px;">Model XX-15 (cat No. UVP18006201)</td>
			<td>available from Fisher Scientific. Although not observed by us with this model, some UV sources have been observed to experience a decrease of intensity over time (if this is the case, see Modifications and Troubleshooting)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UV glasses</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Paper towels</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Kimwipes</td>
			<td style="width:71px;">Kimberly-Clark</td>
			<td style="width:119px;">06-666-11</td>
			<td>available from Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Timer stop watch</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Wash bottle</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">24020500</td>
			<td>available from Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tea strainer</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>available in kitchen stores</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">beakers, 250 ml (2)</td>
			<td style="width:71px;">Corning Inc.</td>
			<td style="width:119px;">1000250</td>
			<td>available from Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">water bath (2)</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>any maker, with accurary to 0.1 C (e.g. Shel Lab H2O Bath Series)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;">Hanks&#8217; Solution 1</td>
			<td style="width:71px;">see above</td>
			<td style="width:119px;">see above</td>
			<td>8.0g NaCl, 0.4g KCl in 100ml ddH2O. Store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hanks&#8217; Solution 2</td>
			<td style="width:71px;">see above</td>
			<td style="width:119px;">see above</td>
			<td>0.358g Anhydrous Na2HPO4, 0.6g KH2PO4 in 100ml ddH2O. Store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hanks&#8217; Solution 4</td>
			<td style="width:71px;">see above</td>
			<td style="width:119px;">see above</td>
			<td>0.72g CaCl2 in 50ml ddH2O. Store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hanks&#8217; Solution 5</td>
			<td style="width:71px;">see above</td>
			<td style="width:119px;">see above</td>
			<td>1.23g MgSO4 &#8729; 7H2O in 50ml ddH2O. Store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hank&#39;s Premix</td>
			<td style="width:71px;">see above</td>
			<td style="width:119px;">see above</td>
			<td>add, in the following order: 10.0 ml Solution 1;&#160; 1.0 ml Solution 2;&#160; 1.0 ml Solution 4;&#160; 86.0 ml ddH2O;&#160; 1.0 ml Solution 5. Store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hanks&#8217; Solution 6</td>
			<td style="width:71px;">see above</td>
			<td style="width:119px;">see above</td>
			<td>0.33g NaHCO3 in 10ml ddH2O. Prepare fresh the morning of the IVF procedure.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hank&#39;s Solution (final solution)</td>
			<td style="width:71px;">see above</td>
			<td style="width:119px;">see above</td>
			<td>Combine 990ul of Hank&#8217;s Premix and 10ul of freshly made Solution 6 (NaHCO3 solution)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ploidy manipulation of zebrafish embryos with heat shock 2 treatment

ploidinin Manipülasyon gibi diploidlerin için tetraploids için diploidlerin veya haploidlerden gibi yararlı dönüşümler için izin verir. Tek bir heterozigot anneden homozigot doğrudan üretimini sağlar, çünkü zebra balığı Danio rerio olarak, özellikle homozigot jinogenetik diploid nesil genetik analizinde yararlıdır. Bu makalede, ilk hücre döngüsü, Isı Şok 2 (HS2) sırasında ısı nabız dayalı ploidi çoğaltma için modifiye edilmiş bir protokol tanımlamaktadır. centriole çoğaltılması inhibisyonu yoluyla, bu yöntem, ikinci bir hücre döngüsü sırasında hassas hücre bölünmesi durak ile sonuçlanır. etkilenmemiş DNA çoğaltılması ile birlikte hassas bir döngüsü bölümü durak, tüm genom çoğaltılması sonuçlanır. Bu yöntem ile ilgili protokoller tek hücre döngüsü bölünmesi gecikme ve Ploidi tekrarını neden yumurta ve sperm toplama, sperm UV tedavisi, in vitro fertilizasyon ve ısı darbesi bulunmaktadır. Bu protokolün değiştirilmiş bir versiyonu uygulanabilirDiğer hayvan türleri ploid değişikliğine neden.

Bir hücre döngüsü sitokinez durak rağmen, DNA replikasyon embriyo (Şekil 1) DNA içeriğinin tekrarlardan sonuçlanan, embriyolar, normal olarak ortaya çıkar. Streisinger Isı Şok protokolü (standart HS) dönemi 13-15 dakika sonra döllenme (mpf) sırasında ısı nabız içerir ve türetilmiş bir yöntem burada açıklanan ise 35 mpf 1,2 ilk embriyonik hücre bölünmesi sırasında öncelikle sitokinez tutuklama indükler, Isı Şok 2 (HS2), döne...

Watch this Scientific Journal Video about Ploidy Manipulation of Zebrafish Embryos with Heat Shock 2 Treatment at JoVE.com

Ploidy Manipulation of Zebrafish Embryos with Heat Shock 2 Treatment

ploid manipülasyon için değiştirilmiş bir protokol, erken embriyoda sitokinez bir tek çevrim durak uyarılması için bir ısı şoku kullanır. Bu protokol zebrabalıkları gösterilmiştir, ancak diğer türlere uygulanabilir.

Isıl Şok 2 Tedavi ile Zebra balığı Embriyolar ploidisi Manipülasyon

Manipulation of ploidy allows for useful transformations, such as diploids to tetraploids, or haploids to diploids. In the zebrafish Danio rerio, ...

ploidy-manipulation-of-zebrafish-embryos-with-heat-shock-2-treatment

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.9K Görüntüleme.  University of Wisconsin.  ploid manipülasyon için değiştirilmiş bir protokol, erken embriyoda sitokinez bir tek çevrim durak uyarılması için bir ısı şoku kullanır. Bu protokol zebrabalıkları gösterilmiştir, ancak diğer türlere uygulanabilir. 

Video: Ploidy Manipulation of Zebrafish Embryos with Heat Shock 2 Treatment

Mechanical Vessel Injury in Zebrafish Embryos

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes. External development and optical transparency make these embryos especially amenable to microscopy, and numerous transgenic lines that label specific cell types with fluorescent proteins are available, making the zebrafish embryo an ideal system for visualizing the interaction of vascular, hematopoietic, and other cell types during injury and repair in vivo. Forward and reverse genetics in zebrafish are well developed, and pharmacological manipulation is possible. We describe a mechanical vascular injury model using micromanipulation techniques that exploits several of these features to study responses to vascular injury including hemostasis and blood vessel repair. Using a combination of video and timelapse microscopy, we demonstrate that this method of vascular injury results in measurable and reproducible responses during hemostasis and wound repair. This method provides a system for studying vascular injury and repair in detail in a whole animal model.

This article describes a method for creating a mechanical vessel injury in zebrafish embryos. This injury model provides a platform for studying hemostasis, injury-related inflammation, and wound healing in an organism ideally suited for real-time microscopy.

Zebra balığı Embriyolar Mekanik Gemi Sakatlık

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes.  External development ...

Gelişim Biyolojisi

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been described at the morphological level, little is known about the molecular basis of cellular changes that occur as the organism develops. With recent advancements in microfluidics and multiplexing technologies, it is now possible to characterize gene expression in single cells. This allows for investigation of heterogeneity between individual cells of specific cell populations to identify and classify cell subtypes, characterize intermediate states that occur during cell differentiation, and explore differential cellular responses to stimuli. This study describes a protocol to isolate viable, single cells from zebrafish embryos for high throughput multiplexing assays. This method may be rapidly applied to any zebrafish embryonic cell type with fluorescent markers. An extension of this method may also be used in combination with high throughput sequencing technologies to fully characterize the transcriptome of single cells. As proof of principle, the relative abundance of cardiac differentiation markers was assessed in isolated, single cells derived from nkx2.5 positive cardiac progenitors. By evaluation of gene expression at the single cell level and at a single time point, the data support a model in which cardiac progenitors coexist with differentiating progeny. The method and work flow described here is broadly applicable to the zebrafish research community, requiring only a labeled transgenic fish line and access to microfluidics technologies.

This protocol describes a method for isolating single cells from zebrafish embryos, enriching for cells of interest, capturing zebrafish cells in microfluidic based single cell multiplex systems, and assessing gene expression from single cells.

İzolasyon ve Zebra balığı Embriyolar gelen Tek Hücre Karakterizasyonu

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Generation of Parabiotic Zebrafish Embryos by Surgical Fusion of Developing Blastulae

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for candidate genes of interest, migratory behaviors of cells, and secreted signals in distinct genetic settings. Because parabiotic animals share a common circulation, any blood or blood-borne factor from one animal will be exchanged with its partner and vice versa. Thus, cells and molecular factors derived from one genetic background can be studied in the context of a second genetic background. Parabiosis of adult mice has been &#160;used extensively to research aging, cancer, diabetes, obesity, and brain development. More recently, parabiosis of zebrafish embryos has been used to study the developmental biology of hematopoiesis. In contrast to mice, the transparent nature of zebrafish embryos permits the direct visualization of cells in the parabiotic context, making it a uniquely powerful method for investigating fundamental cellular and molecular mechanisms. The utility of this technique, however, is limited by a steep learning curve for generating the parabiotic zebrafish embryos. This protocol provides a step-by-step method on how to surgically fuse the blastulae of two zebrafish embryos of different genetic backgrounds to investigate the role of candidate genes of interest. In addition, the parabiotic zebrafish embryos are tolerant to heat shock, making temporal control of gene expression possible. This method does not require a sophisticated set-up and has broad applications for studying cell migration, fate specification, and differentiation in vivo during embryonic development.

This protocol provides step-by-step instruction on how to generate parabiotic zebrafish embryos of different genetic backgrounds. When combined with the unparalleled imaging capabilities of the zebrafish embryo, this method provides a uniquely powerful means to investigate cell-autonomous versus non-cell-autonomous functions for candidate genes of interest.

Blastulae Gelişmekte Cerrahi Fusion tarafından Parabiyotik balığı Embriyolar Üretimi

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for ...

Affinity Labeling Detection of Endogenous Receptors from Zebrafish Embryos

By combining the powers of Affinity Labeling and Immunoprecipitation (AFLIP), a technique for the detection of low abundance receptors in zebrafish embryos has been implemented. This technique takes advantage of the selectivity and sensitivity conferred by affinity labeling of a given receptor by its ligand with the specificity of the immunoprecipitation. We have used AFLIP to detect the type III TGF-&#946; receptor (TGFBR3), also know as betaglycan, during early zebrafish development. AFLIP was instrumental in validating the efficacy of a TGFBR3 morphant zebrafish phenotype. In the first step, embryo protein extracts are prepared and used to generate 125I-TGF-&#946;2-TGFBR3 complexes that are purified by immunoprecipitation. Later, these complexes are covalently cross-linked and revealed using SDS-PAGE separation and autoradiography detection. This technique requires the availability of a labeled ligand for, and a specific antibody against, the receptor to be detected, and shall be easily adapted to identify any growth factor or cytokine receptor that meets these requirements.

A novel technique for the detection of low abundance endogenous receptors present in zebrafish embryos is described. We have named it AFLIP because it consists of affinity labeling of the receptor by its ligand linked to immunoprecipitation.

Zebra balığı Embriyolar Endojen Reseptör Affinity Etiketleme Tespiti

By combining the powers of Affinity Labeling and Immunoprecipitation (AFLIP), a technique for the detection of low abundance receptors in zebrafish ...

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

Cellular events that take place during the earliest stages of animal embryonic development are driven by maternally derived gene products deposited into the developing oocyte. Because these events rely on maternal products which typically act very soon after fertilization-that preexist inside the egg, standard approaches for expression and functional reduction involving the injection of reagents into the fertilized egg are typically ineffective. Instead, such manipulations must be performed during oogenesis, prior to or during the accumulation of maternal products. This article describes in detail a protocol for the in vitro maturation of immature zebrafish oocytes and their subsequent in vitro fertilization, yielding viable embryos that survive to adulthood. This method allows the functional manipulation of maternal products during oogenesis, such as the expression of products for phenotypic rescue and tagged construct visualization, as well as the reduction of gene function through reverse-genetics agents.

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

An optimized protocol for the in vitro maturation of zebrafish oocytes used for the manipulation of maternal gene products is presented here.

Kullanılması Anne Gen Ürünlerinin Fonksiyonel Manipülasyonu<em&gt; İn Vitro</emZebra balığı&gt; Oosit Olgunlaştırma

Cellular events that take place during the earliest stages of animal embryonic development are driven by maternally derived gene products deposited into ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the cells are located. Specifically, they have been developed to analyze the electrical activity of excitable cells, such as spinal neurons. In such a scenario, it is crucial to preserve the integrity of the spinal cell, but it is also important to preserve the anatomy and physiological shape of the systems involved. Indeed, the comprehension of the manner in which the nervous system-and other complex systems-works must be based on a systemic approach. For this reason, the live zebrafish embryo was chosen as a model system, and the spinal neuron membrane voltage changes were evaluated without interfering with the physiological conditions of the embryos. 
Here, an approach combining the employment of zebrafish embryos with a FRET-based biosensor is described. Zebrafish embryos are characterized by a very simplified nervous system and are particularly suited for imaging applications thanks to their transparency, allowing for the employment of fluorescence-based voltage indicators at the plasma membrane during zebrafish development. The synergy between these two components makes it possible to analyze the electrical activity of the cells in intact living organisms, without perturbing the physiological state. Finally, this non-invasive approach can co-exist with other analyses (e.g., spontaneous movement recordings, as shown here).

Protocols described here allow for the study of the electrical properties of excitable cells in the most non-invasive physiological conditions by employing zebrafish embryos in an in vivo system together with a fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based genetically encoded voltage indicator (GEVI) selectively expressed in the cell type of interest.

Canlı Zebra balığı Embriyolarında Biosense Motor Nöron Membranı Potansiyeli

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and zebrafish embryos. Our system comprises a chamber featuring a simple setup that is nevertheless robust to induce and maintain a specific oxygen concentration and temperature in any experimental solution of choice. The presented system is very cost-effective but highly functional, it allows induction and sustainment of hypoxia for direct experiments in vivo and for various time periods up to 48 h.
To monitor and study the effects of hypoxia, we have employed two methods - measurement of levels of hypoxia-inducible factor 1alpha (HIF-1&#945;) in whole embryos or specific tissues and determination of retinal stem cell proliferation by 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EdU) incorporation into the DNA. HIF-1&#945; levels can serve as a general hypoxia marker in the whole embryo or tissue of choice, here embryonic retina. EdU incorporation into the proliferating cells of embryonic retina is a specific output of hypoxia induction. Thus, we have shown that hypoxic embryonic retinal progenitors decrease proliferation within 1 h of incubation under 5% oxygen of both frog and zebrafish embryos.
Once mastered, our setup can be employed for use with small aquatic model organisms, for direct in vivo experiments, any given time period and under normal, hypoxic or hyperoxic oxygen concentration or under any other given gas mixture.

We introduce a novel hypoxic chamber system for use with aquatic organisms such as frog and zebrafish embryos. Our system is simple, robust, cost-effective and allows the induction and sustainment of hypoxia in vivo and for up to 48 h. We present 2 reproducible methods to monitor the effectiveness of hypoxia.

Kurbağa ve Zebra balığı Embriyolarında Hipoksinin İndüklenmesi

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain and protect cellular identities. The conversion of germ cells into specific neurons in the nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a powerful tool for performing genetic screens in order to dissect regulatory pathways that safeguard established cell identities. Reprogramming of germ cells to a specific type of neurons termed ASE requires transgenic animals that allow broad over-expression of the Zn-finger transcription factor (TF) CHE-1. Endogenous CHE-1 is expressed exclusively in two head neurons and is required to specify the glutamatergic ASE neurons fate, which can easily be visualized by the gcy-5prom::gfp reporter. A trans gene containing the heat-shock promoter-driven che-1 gene expression construct allows broad mis-expression of CHE-1 in the entire animal upon heat-shock treatment. The combination of RNAi against the chromatin-regulating factor LIN-53 and heat-shock-induced che-1 over-expression leads to reprogramming of germ cell into ASE neuron-like cells. We describe here the specific RNAi procedure and appropriate conditions for heat-shock treatment of transgenic animals in order to successfully induce germ cell to neuron conversion.

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

This protocol describes how to study cellular processes during cell fate conversion in Caenorhabditis elegans in vivo. Using transgenic animals, allowing heat-shock promoter-driven overexpression of the neuron fate-inducing transcription factor CHE-1 and RNAi-mediated depletion of the chromatin-regulating factor LIN-53 germ cell to neuron reprogramming can be observed in vivo.

Uygulama için yeniden programlamak Germ hücreleri için C. elegans nöronlarda RNAi ve transkripsiyon faktörü ifade ısı şok bağlı

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling processes of excitable neuronal and muscular cells and many other biological processes, such as embryonic developmental patterning. However, there is a need for in vivo electrical activity monitoring in vertebrate embryogenesis. The advances of genetically encoded fluorescent voltage indicators (GEVIs) have made it possible to provide a solution for this challenge. Here, we describe how to create a transgenic voltage indicator zebrafish using the established voltage indicator, ASAP1 (Accelerated Sensor of Action Potentials 1), as an example. The Tol2 kit and a ubiquitous zebrafish promoter, ubi, were chosen in this study. We also explain&#160;the processes of Gateway site-specific cloning, Tol2 transposon-based zebrafish transgenesis, and the imaging process for early-stage fish embryos and fish tumors using regular epifluorescent microscopes. Using this fish line, we found that there are cellular electric voltage changes during zebrafish embryogenesis, and fish larval movement. Furthermore, it was observed that in a few zebrafish malignant peripheral nerve sheath tumors, the tumor cells were generally polarized compared to the surrounding normal tissues.

Here, we show the process of creating a cellular electric voltage reporter zebrafish line to visualize embryonic development, movement, and fish tumor cells in vivo.

Zebra balığı erken embriyo ve tümör hücresel elektrik aktivitesinin görselleştirme

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. Although many immunohistochemistry protocols have been optimized for mammalian tissue and tissue sections, these protocols often require modification and optimization for non-mammalian model organisms. Zebrafish are increasingly used as a model system in basic, biomedical, and translational research to investigate the molecular, genetic, and cell biological mechanisms of developmental processes. Zebrafish offer many advantages as a model system but also require modified techniques for optimal protein detection. Here, we provide our protocol for whole-mount fluorescence immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae. This protocol additionally describes several different mounting strategies that can be employed and an overview of the advantages and disadvantages each strategy provides. We also describe modifications to this protocol to allow detection of chromogenic substrates in whole mount tissue and fluorescence detection in sectioned larval tissue. This protocol is broadly applicable to the study of many developmental stages and embryonic structures.

Here, we present a protocol for fluorescent antibody-mediated detection of proteins in whole preparations of zebrafish embryos and larvae.

Zebrabalığı Embriyoları ve Larvalarında Tüm Mount Immunohistochemistry

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...