Hücre kültürü, kontrollü bir laboratuvar ortamında çeşitli hücre ve doku türlerini büyütmek için gerekli olan hassas bir beceridir. Hücre kültürü çalışması yaparken birincil endişe kontaminasyondur. Bu kontaminasyon bakteri, küf veya mikoplazma şeklinde olabilir.
Bu videoda özetlenen teknikler ve uygulamalar, hücrelerinizin canlı, sağlıklı ve kontaminasyonsuz kalmasını sağlayacaktır. Bu uygulamalara sıkı sıkıya bağlı kalınmalı ve tüm laboratuvar personeli yılda en az bir kez eğitim almalıdır. Çalışmaya başlamadan önce, sadece hücre kültürü odasında kullanılmak üzere tasarlanmış temiz bir laboratuvar önlüğü giyin.
Başka hiçbir yüzeye dokunmamış yeni eldivenler giyin. Eldivenlerin sıkıca oturduğundan emin olun. Nitril pudrasız eldivenler en iyisidir.
Laboratuvar önlüğü ve eldivenlerinin steril olması gerekmez. İşe hazırlanmak için eldivenleri, laboratuvar önlüğü kollarını ve biyolojik güvenlik kabininin içine% 70 etanol püskürtün. Çalışma yüzeyini, yanlara, arkaya, kabindeki herhangi bir öğeye ve ön cam panele hem içeriden hem de dışarıdan püskürtün.
Çalışma yüzeyini ve cam paneli tüy bırakmayan bir kağıt havluyla kurulayın. Çalışma alanını kabinin içinde düzenlemek için biraz zaman ayırın. Su banyolarını hücre kültürü odasının içinde tutun ve bunları yalnızca ısınma ortamı veya hücreleri çözme gibi hücre kültürü amaçları için kullanın.
Su banyoları boşaltılmalı ve haftada bir kez yıkanmalıdır. Kabine getirilen eşya miktarını sınırlayın ve ön veya arka ızgaraları bloke ederek biyolojik güvenlik kabini içindeki hava akışını kesmeyin. Kabinin içine yerleştirilen tüm eşyaları %70 etanol ile püskürtün ve kurulayın.
Medya şişesinin üst kısmına püskürterek başlayın ve aşağı doğru ilerleyin. Temiz bir kağıt havluyla, medya şişesinin üstünden başlayarak kurumasını sağlayın ve kademeli olarak aşağıya doğru ilerleyin. Kapağa doğru geri dönmeyin.
Bu dolapların çalışma şekli, odadan ve kabinin kendisinden ön ve arka ızgaralardan hava çekmeleridir. Hava, kabinin arkasına ve üstüne doğru gider. Orada, kirli hava filtre yığınından geçer ve filtrelenmiş temiz havanın bir kısmı kabindeki çalışma alanına doğru itilir.
Kabin serolojik pipetleri barındıracak kadar büyükse, içine yerleştirilebilirler, aksi takdirde kabinin dışına monte edilmiş bir kapta saklanabilirler. Kullanmadan önce muhafazalı pipetin her iki tarafında da delik, yırtılma veya delinme olup olmadığını kontrol etmek iyi bir uygulamadır. Sargıyı sökmeyin.
Bunun yerine, ambalajın uçlarını yavaşça soyun. Serolojik pipeti bir pipet yardımcısına yerleştirin ve sargıyı tek bir akışkan hareketle çıkarın. İmleci açık şişelerin veya şişelerin üzerine getirmeyin.
Açık bir şişenin veya şişenin üzerine ulaşmak veya açık şişelerin üzerinde çalışmak önerilmez. Dolapların içindeki hava akımı, içindeki herhangi bir şeyi aşağı doğru iter. Uzanmak, kolunuzun veya eldiveninizin, örneğin kolunuzda bulunan herhangi bir kontaminasyonu hücre kültürünüze potansiyel olarak itebilecek öğelerin üstünde olmasını sağlayacaktır.
Mümkün olduğunda, sıvı dökmeyin. Bunun yerine, serolojik bir pipet kullanarak ekleyin. İçeriği iyice karıştırın ve şişeyi başlatın.
Medyanın neyle desteklendiğini yazın. Yapışkan kültürlerle çalışıyorsanız ve plastik bir şişeye ihtiyacınız varsa, tüm paketi püskürtün ve içeri alın. Eldivenleriniz kuruduğunda, tekrar etanol ile püskürtün.
Yapışkan bir hücre hattıyla çalışırken, ortam veya yıkama solüsyonlarını aspire etmek için otoklavlanmış cam pipetler veya tek kullanımlık steril plastik pipetler kullanın. Metal kapağı saklama kabından dikkatlice çıkarın. Bir cam pipeti, kabı bir açıyla hafifçe sallayarak izole edin.
Kabın içine ulaşırken, diğer pipetlere dokunmaktan kaçının. Seçilen pipeti yalnızca bir uçtan tutun. Şişelerdeki ve şişelerdeki kapakları mümkün olan en kısa sürede hızla değiştirin.
Jantın çalışma yüzeyine temas etmemesi için kapakları çalışma yüzeyine baş aşağı yerleştirin. Kapağı üstten veya alttan tutmayın. Bunun yerine, yanlardan kapaklara dokunun.
Sıvıları aspire ederken, kabinin dışında bulunan bir vakum tuzağı şişesini zemindeki ikincil bir kapta kullanın. Kabin içinde çalışırken atık oluşacaktır. Elleri kabinin içine ve dışına çok sık hareket ettirmek hava akışını keseceğinden, herhangi bir atığı geçici olarak kabinin içinde bırakmak iyidir.
Çalışmanızı kesintiye uğratmaması için yan tarafa yerleştirin. Eldivenleri kuruduklarında cömertçe %70 etanol ile püskürtün. Islak damlamamaları için ellerinizi birbirine sürtün.
Serolojik pipetler hakkında kısa bir not. Kaputtaki başka bir şeye yanlışlıkla dokunurlarsa, onları dışarı atmaktan çekinmeyin. Kirlenmiş olabilecek bir pipet kullanmak yerine temiz bir serolojik pipetle yeni başlamak en iyisidir.
Hücreleri inkübatöre yerleştirmeden önce, mikroskop altında nasıl göründüklerini kontrol edin. Tek hücreler gözlenmelidir. Bu, hücrelerin tamamen yeniden askıya alındığını gösterir.
İnkübatörlere konuşmayın, hapşırmayın, öksürmeyin veya ağır nefes almayın. İnkübatör kapılarını hızla açın ve kapatın. Onları gerekenden daha uzun süre açık bırakmak, havada bulunan kirleticilerin inkübatörlere girmesine izin verebilir.
Kabinden çıkarmadan önce tüm şişelerin kapaklarının iyice kapatıldığından emin olun. Medya ışığa duyarlıdır. Kullanılmadığında karanlıkta dört santigrat derecede saklanmalıdır.
Hücre kültürü çalışmaları tamamlandıktan sonra kabinin içine tekrar %70 etanol püskürtün ve yüzeyi bir kağıt havlu ile silerek kurulayın. Biyolojik tehlike atık torbasını boşaltın. Bu işlemi tekrarlayın ve farklı bir hücre hattına geçerken eldivenleri değiştirin.
Cam şişelerde yetiştirilen süspansiyon kültürleriyle çalışırken, eldivenlerin ıslak olduğundan emin olun. Alüminyum folyoya ıslak eldivenlerinizle dokunun ve ardından biyolojik güvenlik kabinine yerleştirmeden önce şişenin altına sadece püskürtün. Hücre sayımı için bir örnek alırken, kabından sadece bir adet 1,5 ml'lik tüp çıkarın.
Diğer tüplerin hiçbirine dokunmayın. Kapağı çalışma yüzeyine baş aşağı yerleştirin. İç kenara dokunmayın.
Yanlardan dikkatli bir şekilde kullanın ve işiniz bittiğinde değiştirin. Süspansiyon hücrelerini ve cam şişeleri tutarken, şişenin tüm boynunu kaplayan çift katlanmış alüminyum folyo parçasını dikkatlice çıkarın. Dört köşeyi de yavaşça çekin ve folyoyu çalışma yüzeyine baş aşağı yerleştirin.
Cam şişeyi sadece alttan tutun. Folyo çıktıktan sonra boynundan dokunmayın. Hücre sayımı için örnek almak üzere 1 ml'lik bir serolojik pipet kullanın.
Medyanın şişelerin kenarından aşağı damlamasına izin vermeyin. Varsa,% 70 etanol içeren kağıt havlu püskürtün ve hemen temizleyin. Şişeleri veya şişeleri biyolojik güvenlik dolaplarından çıkarmadan önce kapakların veya alüminyum folyonun sıkıldığından emin olun.
Farklı hücre tipleri için ayrı inkübatörler kullanın. Bu, farklı hücre tiplerinin çapraz kontaminasyonunu önleyecektir. Kabin dışındaki sıvı atıkları toplamak için vakum kapanı şişesinin zeminde atık etiketli ikincil bir kapta yerleştirilmesi önerilir.
Hortum, aylık olarak değiştirilen bir filtreye bağlanır. Hortum kabinin yanından içeri girer. İş tamamlandıktan sonra biyolojik tehlike çöpünü çıkarın.
Lavabonun yanındaki duvarda bir cam yıkama protokolü bulundurun. İlk olarak, atılan hücreleri% 10 çamaşır suyu ile yaklaşık beş dakika bekletin. Daha sonra ağartıcı karışımını atın ve şişeyi suyla iyice durulayın.
Su ile sabun ekleyin, bir fırça ile çok iyi ovalayın, daha fazla su ile durulayın. Ve sonra son adım, cam eşyaları sağdaki musluktaki DI suyuyla durulamaktır. Cam şişeleri mümkün olan en kısa sürede yıkayın, cam eşyaları iyice ovalayın.
Sf9 hücreleri, düzgün bir şekilde temizlenmezse bu ölü hücre kenarını terk edecektir. Bu şişeleri bir cam yıkama tesisine göndermek yerine sadece hücre kültürü, otoklav hücre kültürü cam eşyaları için kullanın. Otoklav üzerindeki vakum döngüsünü 40 dakika sterilize edilmiş süre ve 40 dakika kuruma süresi boyunca kullanın.
Laboratuvarın ana alanındaki cam eşyalardan ayrı tutun. Hücre kültürü odasını, tüm malzemeler tek bir alanda bulunacak şekilde düzenleyin, böylece laboratuvar üyelerinin malzeme aramak için hücre kültürü odasından çıkma ihtiyacını en aza indirin. Hücreleri toplamak için kullanılan ve daha sonra hücre kültüründe yeniden kullanılan plastik şişeleri, yalnızca hücre kültürü kullanımı için etiketleyin.
Belirli bir hücre tipi için belirlenmiş hücre kültürü şişelerini kullanın. Kolay erişim için bu şişeleri hücre kültürü odasında saklayın. Süspansiyonda yetişen kültürler için, küf medyada yüzen toplar olarak tanınacaktır.
Bakteriyel kontaminasyona gelince, medyayı beyaz ve bulutlu hale getirecektir. Benzer şekilde, yapışkan hücreler için, küf kontaminasyonu bulanık yamalar olarak kolayca tanınabilir. Bakteriyel kontaminasyon normalde berrak ortam, beyaz ve bulutlu hale gelecektir.
Birçok mikoplazma türü, PCR tabanlı bir test kullanılarak güvenilir bir şekilde tanımlanabilir. Soldaki bant, DNA için moleküler ağırlık standartlarını göstermektedir. Sağdaki dört bant pozitif kontrollerdir.
Test edilen hücre tipleri altında hiçbir bant görünmez, çünkü mikoplazma tespit edilmemiştir. Hücre kültürü ortamı, pH göstergeleri mevcutsa rengi kırmızıdan sarıya değişecektir. Sarı renk, pH'ın düşük olduğunu ve ortamın değiştirilmesi gerektiğini gösterir.
Hücre sayımı yapılırken ışık mikroskobu altında başka büyümeler veya hücre şekilleri gözlenirse, bu kontaminasyonun bir göstergesi olabilir. Hücre sayımından önce hemositometrenin kapsamlı bir şekilde temizlenmesi gerektiğini unutmayın, çünkü bu tür döküntüler hücre kültürünün kendisinde değil, sadece hemositometrede bulunabilir. Kontaminasyon, hücre kültürü çalışması yaparken birincil endişelerden biri olsa da, bu riskler bu videoda özetlenen uygulamaları ve teknikleri izleyerek azaltılabilir.
Her ay aylık mikoplazma testi yapılırsa, laboratuvar personeli yıllık olarak eğitilir ve bu uygulamalara sıkı sıkıya bağlı kalınırsa, hücreleriniz sağlıklı ve kontaminasyonsuz kalacaktır. Bu aynı zamanda pahalı hücre kültürü ortamı satın alma, yeni hücreler satın alma ile ilgili maliyetleri azaltmaya yardımcı olacak ve inkübatör dekontaminasyon duruş süresini azaltacaktır. Unutmayın, başarılı hücre kültürünün anahtarı, ilk etapta kontaminasyonu önlemek için erken eylemdir.
