Bu yöntem, araştırmacıların Tibet tıbbı bileşiklerinin yapılarını, özellikle de ağacın bileşenlerini analiz etmelerine yardımcı olabilir. Doğal tıpta bileşiğin içeriğinin nitel çalışması hakkında fikir verebilir. Bu tekniğin temel avantajı, bu durumda elde edilen bileşik yapının doğruluğunun veritabanınınkinden daha yüksek olmasıdır.
Bu teknik, mesane veya idrardaki metabolik ara ürünlerin yapı analizinde kullanılabilir. Başlamak için, Tibet tıbbı Abelmoschus manihot'un tohum numunesi hazırlama. Bir gram AMS'yi doğru bir şekilde tartın ve 30 mililitre% 80 metanol içeren konik bir şişeye yerleştirin.
40 kilohertz'de bir ultrason banyosu sonikatör kullanarak, karışım üzerinde 25 santigrat derecede 30 dakika boyunca ekstraksiyon yapın. Ardından, numuneyi beş dakika boyunca 14.000 g'da santrifüj edin. Bir enjeksiyon şırıngası ve organik 0.22 mikron mikro gözenekli membran filtresi hazırlayın ve süpernatantı iki mililitrelik bir numune şişesine filtreleyin.
Vakum pompasının anahtarını açtıktan sonra, argon silindirinin ana valfini kısmi basınç valfi ile birlikte açın ve basıncı yaklaşık 0,3 megapaskal olarak ayarlayın. Ardından, azot valfini açın. Kütle spektrometresi veya MS kontrol yazılımını başlatın.
Yazılım panelinde Isıtmalı ESI Kaynağı'na tıklayın ve ısıtıcı sıcaklığı, gaz akış hızları, pozitif ve negatif modlar için püskürtme voltajı ve kılcal sıcaklık dahil olmak üzere MS parametrelerini ayarlayın. Sıvı kromatografisi veya LC için iyon kaynağını etkinleştirmek üzere Uygula düğmesine tıklayın.Saf asetonitrilde sulu bir çözelti içinde sırasıyla% 0.1 formik asit kullanarak mobil faz A ve B'yi hazırlayın. Çözeltileri sırasıyla A ve B sıvı pasajlarına bağlamadan önce en az 15 dakika boyunca 40 kilohertz'de bir ultrason banyosu sonikatöründe gazını alın.
Hacimce 1:9 hacimli bir metanol su çözeltisi hazırlayın, ardından pompanın ve enjektörün temizleme sıvısı şişelerine manuel olarak doldurun. LC-MS kontrol yazılımını başlattıktan sonra, LC kontrol panelini açmak için Direct Control (Doğrudan Kontrol) düğmesini tıklatın. Boşaltma vanasını pompa modülü üzerinde saat yönünün tersine çevirerek açın.
Pompa ayarını açmak ve boşaltma parametrelerini üç dakika boyunca dakikada beş mililitreye ayarlamak için Diğer Seçenek'e tıklayın. Balonun kaldırılmasını başlatmak için Temizle'ye tıklayın. İşiniz bittiğinde, boşaltma vanasını kapatın.
Ardından, şırıngayı üç döngü boyunca durulamak için Prime Şırınga'ya, döngüyü bir döngü boyunca durulamak için Tampon Döngüsünü Yıka ve iğneyi bir döngü boyunca yıkamak için Harici Yıkama İğnesi'ne tıklayın. Numune şişesini numune alma cihazına yerleştirin. Yöntem Düzenleme Penceresini açmak için Enstrüman Kurulumu'na tıklayın ve yeni bir LC-MS enstrüman yöntemi oluşturmak için Yeni'ye tıklayın.
Yöntem için toplam çalışma zamanı belirleyin ve basınç sınırını ayarlayın. Yöntem Düzenleme Penceresindeki toplam akış hızı, akış gradyanı, numune sıcaklığı, sütun sıcaklığı ve hazır sıcaklık deltası. MS yöntemi için Genel MS veya MSn deneme türünü seçin.
Edinme süresi, polarite, kütle aralığı, yönlendirme değeri numarası ve süre değerlerini girin. Ayarları bir enstrüman yöntemi olarak yapılandırmak için Kaydet'e tıklayın. Sıra tablosunu açmak için Sequence Setup (Sıra Kurulumu) öğesine tıklayın, burada numune türü, dosya, ad, yol, numune kimliği, enstrüman yöntemi, pozisyon ve enjeksiyon hacmi hakkındaki bilgileri girin.
Kaydet'e tıklayarak sıra tablosunu kaydedin, ardından ayarları uygulayın ve MS alımını başlatın. MS verilerini veri işleme yazılımına yüklemek için, Explorer'da ham dosyaya çift tıklayın. Temel tepe kromatogramı BPI'da, fareyi tıklatıp sürükleyerek eğrinin veya AUC'nin altındaki maksimum alanı seçin.
İlgili MS spektrumu aynı pencerede görüntülenecektir. Bir sonraki MS/MS analizi için hedeflenen iyonu seçin. Yöntem Düzenleme Penceresi'ni yeniden açın ve MSn ayar tablosunda, hedeflenen iyonun m/z'sini Üst Kütle sütununda bir ondalık basamağa ayarlayın.
Ardından, çarpışma modunu seçin ve çarpışma enerjisini veya CE değerini girin. MS/MS tarama aralığını ayarlayın. MS yöntemini kaydetmek için Kaydet'e tıklayın ve sıra tablosuna yeni bir dosya adı girin.
MS / MS alımını başlatmak için Başlat düğmesine tıklayın. Alma işlemi tamamlandıktan sonra, MS/MS ham dosyasını veri işleme yazılımına yüklemek için Explorer'da ham dosyaya çift tıklayın. Spektrumdaki en güçlü parça iyonunu tanımlayın ve MSn yöntem listesine m/z değerini girin.
MSn ayar tablosunda, çarpışma modu, CE değeri ve tarama aralığı dahil olmak üzere MS3 parametrelerini ayarlayın. Yine, MS yöntemini kaydetmek ve sıra tablosuna yeni bir dosya adı girmek için Kaydet'i tıklatın. MS3 alımını başlatmak için Başlat'ı tıklatın.
Daha önce gösterildiği gibi, MS3 ham dosyasını veri işleme yazılımına yüklemek için Explorer'da ham dosyaya çift tıklayın ve MS4 spektrumunu edinmek için adımları yineleyin. Verileri analiz etmek için, MS'den MSn'ye kadar tüm kütle spektrumlarını açmak için ham dosyalara çift tıklayın. iyon ve karşılık gelen parça iyonları arasındaki m / z fark değerlerini manuel olarak hesaplayın.
Ardından, çekirdek yapıyı MS4 sonuçlarına göre el ile çizin ve m/z fark değerine göre fonksiyonel gruplar veya moleküler segmentler kullanarak orijinal yapıyı türetin. MSn'deki her moleküler yapıya göre moleküler bölünme yollarını el ile çizin. Model karbonhidrat selobiyozunun ESI-MS'i, proteinli molekül M H'yi m / z 365'te pozitif modda üretti.
Ürün iyonu taraması veya CID MS/MS, m/z 305'te ikinci bir parça iyonu ile sonuçlandı. Ayrıca, MS3 ve MS4 analizleri sırasıyla m / z 254 ve m / z 185'te üçüncü ve dördüncü parça iyonları ile sonuçlandı. MS / MS analizi, iyon parçalanmalarının sırasını, yani halka açma hidrolizi, CC bölünmesi ve dehidrasyonu ortaya çıkardı.
Böylece, bu yöntem karbonhidratlar için uygun bulundu. LC Q-TOF MS kullanılarak AMS'nin ön kalitatif analizi, çok sayıda bilinmeyen bileşiğin varlığını ortaya koymuştur. m / z 617'deki M H iyonunun negatif MSn analizi, m / z 571'de ikinci bir parça iyonu üretti.
Bu fragman iyonunun MS3 analizi, 32 daltona karşılık gelen metanol olarak hidroksietil ve 18 dalton olan su olarak hidroksil kaybı ile m / z 525'te üçüncü bir parça iyonu üretti. MS4 analizi, m / z 344 ve 273'te dördüncü parça iyonları üretti. Çekirdek yapının manuel olarak tanımlanması, bileşiğin m/z 617'deki moleküler yapısını ve MSn'deki bölünme yollarını ortaya çıkardı.
Bilinmeyen başka bir bileşiğin M H iyonunun ürün iyonu taraması yapıldı ve moleküler yapısı ve bölünme mekanizması da ortaya çıkarıldı. Vakum pompası açıldıktan sonra, deney koşulları için yeterli vakum derecesini sağlamak için en az beş saat bekleyin. İstatistiksel analiz, aynı veya benzer kütle-yük oranına sahip parçaları harmanlamak için kullanılabilir.
Kütle spektrometresi çözeltisinin artmasıyla, bu teknik araştırmacıların doğal ilaçlarda daha yeni bileşikler elde etmelerine yardımcı olabilir.
