この方法は、研究者がチベット医学化合物、特に木の成分の構造を分析するのに役立ちます。それは自然医学における化合物の含有量の定性的研究への洞察を提供することができます。この技術の主な利点は、この場合に得られる化合物構造の精度がデータベースのそれよりも高いことである。
この技術は、膀胱または尿中の代謝中間体の構造解析に使用できます。はじめに、チベット薬アベルモスカスマニホットの種子サンプルの準備。1グラムのAMSを正確に計量し、30ミリリットルの80%メタノールを含む円錐フラスコに入れます。
40キロヘルツの超音波浴超音波処理器を使用して、摂氏25度で30分間混合物の抽出を行う。その後、サンプルを14, 000gで5分間遠心分離します。注射シリンジと有機0.22ミクロン微多孔膜フィルターを用意し、上清をろ過して2ミリリットルのサンプルボトルに入れます。
真空ポンプのスイッチをオンにした後、分圧バルブと一緒にアルゴンシリンダーのメインバルブを開き、圧力を約0.3メガパスカルに調整します。次に、窒素バルブを開きます。質量分析(MS)制御ソフトウェアを起動します。
ソフトウェアパネルの加熱ESIソースをクリックし、ヒーター温度、ガス流量、正モードと負モードのスプレー電圧、毛細管温度などのMSパラメータを設定します。[適用]ボタンをクリックして、液体クロマトグラフィーまたはLCのイオン源をアクティブにし、純粋なアセトニトリル中の水溶液に0.1%ギ酸を使用して移動相AとBをそれぞれ調製します。溶液をそれぞれAおよびB流体通路に接続する前に、少なくとも15分間40キロヘルツの超音波浴超音波処理器でそれらを脱気する。
1:9体積のメタノール水溶液を準備し、ポンプとインジェクターのクリーンアウト液ボトルに手動で充填します。LC-MS制御ソフトウェアを起動した後、ダイレクトコントロールをクリックしてLCコントロールパネルを開きます。ポンプモジュールのパージバルブを反時計回りに開きます。
[その他のオプション]をクリックしてポンプ設定を開き、パージパラメータを毎分5ミリリットルで3分間設定します。[パージ]をクリックして、バブルの除去を開始します。完了したら、パージバルブを閉じます。
次に、プライムシリンジをクリックしてシリンジを3サイクルすすぎ、洗浄バッファーループをクリックしてループを1サイクルすすぎ、針を外部から洗浄して針を1サイクル洗浄します。サンプルボトルをサンプラーに入れます。装置のセットアップをクリックしてメソッド編集ウィンドウを開き、新規をクリックして新しい LC-MS 装置メソッドを作成します。
メソッドの合計実行時間を設定し、圧力制限を設定します。メソッド編集ウィンドウの総流量、流量勾配、サンプル温度、カラム温度、および準備温度デルタ。MS メソッドの場合は、実験タイプとして [一般 MS] または [MSn] を選択します。
取得時間、極性、質量範囲、迂回値番号、および期間の値を入力します。[保存]をクリックして、計測器メソッドとして設定を構成します。シーケンス設定をクリックしてシーケンステーブルを開き、サンプルタイプ、ファイル、名前、パス、サンプルID、装置メソッド、位置、注入量に関する情報を入力します。
[保存]をクリックしてシーケンステーブルを記録し、設定を実装してMS取得を開始します。MSデータをデータ処理ソフトウェアにロードするには、エクスプローラーで生のファイルをダブルクリックします。ベースピーククロマトグラムBPIで、マウスをクリックしてドラッグすることにより、曲線またはAUCの下の最大面積を選択します。
対応するMSスペクトルが同じウィンドウに表示されます。次のMS/MS分析のターゲットイオンを選択します。メソッド編集ウィンドウを再度開き、MSn設定テーブルで、ターゲットイオンのm/zを親質量列の小数点以下1桁に設定します。
次に、衝突モードを選択し、衝突エネルギーまたはCE値を入力します。MS/MS スキャン範囲を設定します。保存をクリックしてMSメソッドを記録し、シーケンステーブルに新しいファイル名を入力します。
[スタート]ボタンをクリックして、MS/MSアクイジションを開始します。取得が完了したら、エクスプローラでRAWファイルをダブルクリックして、MS/MSのRAWファイルをデータ処理ソフトウェアにロードします。スペクトル内で最も強いフラグメントイオンを特定し、そのm/z値をMSn法リストに入力します。
MSn設定テーブルで、衝突モード、CE値、スキャン範囲などのMS3パラメータを設定します。もう一度、[保存]をクリックしてMSメソッドを記録し、シーケンステーブルに新しいファイル名を入力します。[開始]をクリックして、MS3の取得を開始します。
前に示したように、エクスプローラーで生ファイルをダブルクリックしてMS3 rawファイルをデータ処理ソフトウェアにロードし、手順を繰り返してMS4スペクトルを取得します。データを解析するには、生のファイルをダブルクリックして、MSからMSnまでのすべてのマススペクトルを開きます。 イオンと対応するフラグメントイオンの間のm/z差値を手動で計算します。
次に、MS4の結果に従ってコア構造を手動で描画し、m / z差値に基づいて官能基または分子セグメントを使用して元の構造を導き出します。MSnの各分子構造に従って分子切断経路を手動で描画します。モデル糖鎖セロビオースのESI-MSは、ポジティブモードでm/z 365でタンパク質化分子MHを生成しました。
プロダクトイオンスキャン、またはCID MS / MSは、m / z 305で2番目のフラグメントイオンをもたらしました。さらに、MS3およびMS4分析により、それぞれm/z 254およびm/z 185に3番目および4番目のフラグメントイオンが順次得られた。MS/MS分析により、イオンフラグメンテーションのシーケンス、すなわち開環加水分解、CC切断、脱水が明らかになりました。
したがって、この方法は炭水化物に適していることがわかりました。LC Q-TOF MSを用いたAMSの予備定性分析により、多数の未知化合物の存在が明らかになりました。m/z 617でのM Hイオンの負のMSn分析では、m/z 571で2番目のフラグメントイオンが生成されました。
このフラグメントイオンのMS3分析では、32ダルトンに相当するメタノールとしてのヒドロキシエチルと水としてのヒドロキシル(18ダルトン)の損失により、m/z 525で3番目のフラグメントイオンが生成されました。MS4分析では、m/z 344および273に4番目のフラグメントイオンが生成されました。コア構造を手動で同定すると、m/z 617での化合物の分子構造とMSnでの切断経路が明らかになりました。
別の未知化合物のMHイオンのプロダクトイオンスキャンを行い、その分子構造と切断機構も明らかにした。真空ポンプの電源を入れた後、実験条件に十分な真空度を確保するために少なくとも5時間待ちます。統計解析は、同一または類似の質量電荷比を有するフラグメントを照合するために使用することができる。
質量分析ソリューションの増加に伴い、この技術は研究者が天然医薬品の新しい化合物を入手するのに役立つ可能性があります。
