이 방법은 연구자들이 티베트 의약품 화합물의 구조, 특히 나무의 구성 요소를 분석하는 데 도움이 될 수 있습니다. 그것은 자연 의학에서 화합물의 함량에 대한 질적 연구에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은이 경우 얻은 화합물 구조의 정확도가 데이터베이스의 정확도보다 높다는 것입니다.
이 기술은 방광이나 소변에서 대사 중간체의 구조 분석에 사용할 수 있습니다. 우선, 티베트 약 Abelmoschus manihot의 씨앗 샘플 준비. AMS 1g을 정확하게 칭량하여 30ml의 80% 메탄올이 들어 있는 원뿔형 플라스크에 넣습니다.
40 킬로 헤르츠에서 초음파 수조 초음파 처리기를 사용하여 섭씨 25도에서 30 분 동안 혼합물을 추출하십시오. 그 후, 시료를 14, 000g에서 5분 동안 원심분리한다. 주입 주사기 및 유기 0.22 미크론 미세다공성 멤브레인 필터를 준비하고, 상청액을 2-밀리리터 샘플 병으로 여과한다.
진공 펌프의 스위치를 켠 후 부분 압력 밸브와 함께 아르곤 실린더의 메인 밸브를 열고 압력을 약 0.3메가파스칼로 조정합니다. 그런 다음 질소 밸브를 엽니다. 질량 분석법(MS) 제어 소프트웨어를 실행합니다.
소프트웨어 패널에서 가열된 ESI 소스를 클릭하고 히터 온도, 가스 유량, 포지티브 및 네거티브 모드의 스프레이 전압, 모세관 온도를 포함한 MS 매개변수를 설정합니다. 적용 버튼을 클릭하여 액체 크로마토그래피 또는 LC용 이온 소스를 활성화합니다.각각 순수한 아세토니트릴의 수용액에서 0.1% 포름산을 사용하여 이동상 A와 B를 준비합니다. 용액을 A 및 B 유체 통로에 각각 연결하기 전에 최소 15분 동안 40킬로헤르츠의 초음파 처리기에서 가스를 제거합니다.
1:9 부피 메탄올 물 용액을 준비한 다음 펌프와 인젝터의 세척 유체 병에 수동으로 채웁니다. LC-MS 제어 소프트웨어를 실행한 후 직접 제어를 클릭하여 LC 제어판을 엽니다. 펌프 모듈에서 퍼지 밸브를 시계 반대 방향으로 엽니다.
추가 옵션을 클릭하여 펌프 설정을 열고 퍼지 매개변수를 3분 동안 분당 5밀리리터로 설정합니다. 제거를 클릭하여 거품 제거를 시작합니다. 완료되면 퍼지 밸브를 닫습니다.
그런 다음 Prime Syringe를 클릭하여 주사기를 3주기 동안 헹구고, Wash Buffer Loop를 클릭하여 루프를 한 주기 동안 헹구고, Wash Needle Externally를 클릭하여 바늘을 한 주기 동안 씻습니다. 샘플 병을 샘플러에 넣습니다. 기기 설정(Instrument Setup)을 클릭하여 분석법 편집 창을 열고 새로 만들기(New)를 클릭하여 새 LC-MS 기기 분석법을 생성합니다.
메서드에 대한 총 런타임을 설정하고 압력 한계를 설정합니다. Total Flow rate, flow gradient, sample temperature, column temperature 및 ready temperature delta(분석법 편집 창)의 준비 온도 델타. MS 분석법의 경우 일반 MS 또는 MSn 실험 유형을 선택합니다.
획득 시간, 극성, 질량 범위, 전환 값 번호 및 지속 시간의 값을 입력합니다. Save(저장)를 클릭하여 설정을 기기 방법으로 구성합니다. Sequence Setup(시퀀스 설정)을 클릭하여 시퀀스 테이블을 열고 샘플 유형, 파일, 이름, 경로, 샘플 ID, 기기 분석법, 위치 및 주입 부피에 대한 정보를 입력합니다.
저장을 클릭하여 시퀀스 테이블을 기록한 다음 설정을 구현하고 MS 수집을 시작합니다. MS 데이터를 데이터 처리 소프트웨어로 로드하려면 탐색기에서 원시 파일을 두 번 클릭합니다. 기본 피크 크로마토그램 BPI에서 마우스를 클릭하고 끌어 곡선 또는 AUC 아래의 최대 면적을 선택합니다.
해당 MS 스펙트럼이 동일한 창에 표시됩니다. 다음 MS/MS 분석을 위한 표적 이온을 선택합니다. Method Editing Window(분석법 편집 창)를 다시 열고 MSn 설정 테이블에서 대상 이온의 m/z를 Parent Mass(상위 질량) 열의 소수점 이하 한 자리로 설정합니다.
그런 다음 충돌 모드를 선택하고 충돌 에너지 또는 CE 값을 입력합니다. MS/MS 스캔 범위를 설정합니다. 저장을 클릭하여 MS 분석법을 기록하고 시퀀스 테이블에 새 파일 이름을 입력합니다.
시작 버튼을 클릭하여 MS/MS 수집을 시작합니다. 수집이 완료되면 탐색기에서 원시 파일을 두 번 클릭하여 MS/MS 원시 파일을 데이터 처리 소프트웨어에 로드합니다. 스펙트럼에서 가장 강한 단편 이온을 식별하고 MSn 방법 목록에 m/z 값을 입력합니다.
MSn 설정 테이블에서 충돌 모드, CE 값 및 스캔 범위를 포함한 MS3 매개변수를 설정합니다. 다시 저장을 클릭하여 MS 메서드를 기록하고 시퀀스 테이블에 새 파일 이름을 입력합니다. 시작을 클릭하여 MS3 획득을 시작합니다.
앞에서 설명한 대로 탐색기에서 원시 파일을 두 번 클릭하여 MS3 원시 파일을 데이터 처리 소프트웨어에 로드하고 단계를 반복하여 MS4 스펙트럼을 얻습니다. 데이터를 분석하려면 원시 파일을 두 번 클릭하여 MS에서 MSn까지의 모든 질량 스펙트럼을 엽니다. 이온과 해당 단편 이온 사이의 m/z 차이 값을 수동으로 계산합니다.
그런 다음 MS4 결과에 따라 코어 구조를 수동으로 그리고 m/z 차이 값을 기반으로 작용기 또는 분자 세그먼트를 사용하여 원래 구조를 도출합니다. MSn의 각 분자 구조에 따라 분자 절단 경로를 수동으로 그립니다. 모델 탄수화물 셀로비오스의 ESI-MS는 양성 모드에서 m/z 365에서 단백질화된 분자 MH를 생성했습니다.
생성물 이온 스캔 또는 CID MS/MS는 m/z 305에서 두 번째 단편 이온을 생성했습니다. 또한, MS3 및 MS4 분석은 각각 m/z 254 및 m/z 185에서 세 번째 및 네 번째 단편 이온을 순차적으로 생성했습니다. MS/MS 분석은 이온 단편화의 순서, 즉 고리 개방 가수분해, CC 절단 및 탈수를 밝혀냈습니다.
따라서이 방법은 탄수화물에 적합한 것으로 밝혀졌습니다. LC Q-TOF MS를 이용한 AMS의 예비 정성 분석에서 수많은 미지의 화합물이 존재함을 밝혀냈습니다. m/z(617)에서 MH 이온의 음의 MSn 분석은 m/z(571)에서 제2 단편 이온을 생성하였다.
이 단편 이온의 MS3 분석은 32 달톤에 해당하는 메탄올로서의 히드록시에틸과 물로서의 하이드록실(18 달톤)의 손실에 의해 m/z 525에서 세 번째 단편 이온을 생성했습니다. MS4 분석은 m/z 344 및 273에서 네 번째 단편 이온을 생성했습니다. 코어 구조의 수동 식별은 m/z 617에서 화합물의 분자 구조와 MSn에서 절단 경로를 나타냅니다.
다른 미지의 화합물의 MH 이온에 대한 생성물 이온 스캔이 수행되었고, 그 분자 구조 및 절단 메커니즘이 또한 밝혀졌다. 진공 펌프를 켠 후 실험 조건에 충분한 진공도를 보장하기 위해 최소 5시간 동안 기다리십시오. 통계 분석은 동일하거나 유사한 질량 대 전하 비율을 갖는 단편을 대조하는 데 사용할 수 있습니다.
질량 분석 용액이 증가함에 따라 이 기술은 연구자들이 천연 의약품에서 새로운 화합물을 얻는 데 도움이 될 수 있습니다.
