Cette méthode peut aider les chercheurs à analyser les structures des composés de la médecine tibétaine, en particulier les composants de l’arbre. Il peut fournir un aperçu de l’étude qualitative de la teneur en composé en médecine naturelle. Le principal avantage de cette technique est que la précision de la structure composée obtenue dans ce cas est supérieure à celle de la base de données.
Cette technique peut être utilisée dans l’analyse de la structure des intermédiaires métaboliques dans la vessie ou l’urine. Pour commencer, la préparation de l’échantillon de graines de la médecine tibétaine Abelmoschus manihot. Peser avec précision un gramme d’AMS et le placer dans une fiole conique contenant 30 millilitres de 80% de méthanol.
À l’aide d’un sonicateur à bain à ultrasons à 40 kilohertz, effectuez une extraction sur le mélange pendant 30 minutes à 25 degrés Celsius. Ensuite, centrifuger l’échantillon à 14 000 g pendant cinq minutes. Préparez une seringue d’injection et un filtre à membrane microporeuse organique de 0,22 micron, et filtrez le surnageant dans un flacon d’échantillon de deux millilitres.
Après avoir allumé l’interrupteur de la pompe à vide, ouvrez la vanne principale du cylindre d’argon avec la soupape de pression partielle et ajustez la pression à environ 0,3 mégapascal. Ensuite, ouvrez la valve d’azote. Lancez le logiciel de contrôle de spectrométrie de masse, ou MS.
Cliquez sur Heated ESI Source dans le panneau logiciel et définissez les paramètres MS, y compris la température du chauffage, les débits de gaz, la tension de pulvérisation pour les modes positif et négatif et la température capillaire. Cliquez sur le bouton Appliquer pour activer la source d’ions pour la chromatographie liquide ou LC.Préparez les phases mobiles A et B en utilisant de l’acide formique à 0,1% dans une solution aqueuse dans de l’acétonitrile pur respectivement. Dégazez-les dans un sonicateur à bain à ultrasons à 40 kilohertz pendant au moins 15 minutes avant de connecter les solutions aux passages de fluide A et B respectivement.
Préparez une solution d’eau de méthanol volume par volume de 1:9, puis remplissez-la manuellement dans les bouteilles de liquide de nettoyage de la pompe et de l’injecteur. Après avoir lancé le logiciel de contrôle LC-MS, cliquez sur Contrôle direct pour ouvrir le panneau de commande LC. Ouvrez la vanne de purge dans le sens inverse des aiguilles d’une montre sur le module de pompe.
Cliquez sur Plus d’option pour ouvrir le réglage de la pompe et régler les paramètres de purge à cinq millilitres par minute pendant trois minutes. Cliquez sur Purger pour commencer la suppression des bulles. Une fois cela fait, fermez la vanne de purge.
Ensuite, cliquez sur Prime Seringue pour rincer la seringue pendant trois cycles, Wash Buffer Loop pour rincer la boucle pendant un cycle et Wash Needle Externally pour laver l’aiguille pendant un cycle. Placez le flacon d’échantillon dans l’échantillonneur. Cliquez sur Configuration de l’instrument pour ouvrir la fenêtre Édition de méthode et cliquez sur Nouveau pour créer une nouvelle méthode d’instrument LC-MS.
Établissez une durée d’exécution totale pour la méthode et définissez la limite de pression. Débit total, gradient d’écoulement, température de l’échantillon, température de la colonne et delta de la température prête dans la fenêtre Modification de méthode. Pour la méthode MS, sélectionnez le type d’expérience MS général ou MSn.
Entrez les valeurs du temps d’acquisition, de la polarité, de la plage de masse, du nombre de valeurs de déviation et de la durée. Cliquez sur Enregistrer pour configurer les paramètres en tant que méthode instrumentale. Cliquez sur Configuration de la séquence pour ouvrir la table de séquences, dans laquelle entrez les informations sur le type d’échantillon, le fichier, le nom, le chemin, l’ID de l’échantillon, la méthode de l’instrument, la position et le volume d’injection.
Enregistrez la table de séquences en cliquant sur Enregistrer, puis implémentez les paramètres et lancez l’acquisition MS. Pour charger les données MS dans le logiciel de traitement des données, double-cliquez sur le fichier brut dans l’Explorateur. Dans le chromatogramme de pointe de base BPI, sélectionnez la zone maximale sous la courbe ou l’ASC en cliquant et en faisant glisser la souris.
Le spectre MS correspondant sera affiché dans la même fenêtre. Sélectionnez un ion ciblé pour la prochaine analyse MS/MS. Rouvrez la fenêtre Modification de méthode et, dans le tableau des paramètres MSn, définissez le m/z de l’ion ciblé sur une décimale dans la colonne Masse parente.
Ensuite, sélectionnez le mode de collision et entrez l’énergie de collision ou la valeur CE. Définissez la plage d’analyse MS/MS. Cliquez sur Enregistrer pour enregistrer la méthode MS et entrez un nouveau nom de fichier dans la table de séquence.
Cliquez sur le bouton Démarrer pour lancer l’acquisition MS/MS. Une fois l’acquisition terminée, double-cliquez sur le fichier brut dans l’Explorateur pour charger le fichier brut MS/MS dans le logiciel de traitement des données. Identifiez l’ion fragment le plus fort du spectre et entrez sa valeur m/z dans la liste des méthodes MSn.
Dans le tableau des paramètres MSn, définissez les paramètres MS3, y compris le mode de collision, la valeur CE et la plage de balayage. Encore une fois, cliquez sur Enregistrer pour enregistrer la méthode MS et entrez un nouveau nom de fichier dans la table de séquence. Cliquez sur Démarrer pour lancer l’acquisition MS3.
Comme démontré précédemment, double-cliquez sur le fichier brut dans l’Explorateur pour charger le fichier brut MS3 dans le logiciel de traitement des données et répétez les étapes pour obtenir le spectre MS4. Pour analyser les données, double-cliquez sur les fichiers bruts pour ouvrir tous les spectres de masse de MS à MSn. Calculez manuellement les valeurs de différence m/z entre l’ion et les ions fragments correspondants.
Ensuite, dessinez manuellement la structure de base en fonction des résultats MS4 et dérivez la structure originale en utilisant des groupes fonctionnels ou des segments moléculaires basés sur la valeur de différence m / z. Dessinez manuellement les chemins de clivage moléculaire en fonction de chaque structure moléculaire dans MSn. L’ESI-MS du cellobiose glucidique modèle a produit la molécule protéinée M H à m/z 365 en mode positif.
Le balayage ionique du produit, ou CID MS/MS, a donné un deuxième fragment ionique à m/z 305. De plus, l’analyse MS3 et MS4 a abouti séquentiellement aux troisième et quatrième ions fragments à m/z 254 et m/z 185, respectivement. L’analyse MS/MS a révélé la séquence des fragmentations ioniques, à savoir l’hydrolyse par ouverture du cycle, le clivage CC et la déshydratation.
Ainsi, cette méthode s’est avérée appropriée pour les glucides. L’analyse qualitative préliminaire de l’AMS à l’aide de LC Q-TOF MS a révélé la présence de nombreux composés inconnus. L’analyse MSn négative de l’ion M H à m/z 617 a produit un deuxième ion fragment à m/z 571.
L’analyse MS3 de cet ion fragment a produit un troisième ion fragment à m/z 525 par la perte d’hydroxyéthyle sous forme de méthanol correspondant à 32 dalton et d’hydroxyle sous forme d’eau, soit 18 daltons. L’analyse MS4 a produit des ions de quatrième fragment à m/z 344 et 273. L’identification manuelle de la structure du noyau a révélé la structure moléculaire du composé à m/z 617 et ses chemins de clivage dans MSn.
Le balayage ionique produit de l’ion M H d’un autre composé inconnu a été effectué, et sa structure moléculaire et son mécanisme de clivage ont également été révélés. Une fois la pompe à vide allumée, attendez au moins cinq heures pour vous assurer d’un degré de vide suffisant pour les conditions expérimentales. L’analyse statistique peut être utilisée pour rassembler les fragments ayant le même rapport masse / charge ou similaire.
Avec l’augmentation de la solution de spectrométrie de masse, cette technique pourrait aider les chercheurs à obtenir de nouveaux composés en médecine naturelle.
