Bu araştırma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (U1904116) tarafından ortaklaşa desteklenmiştir.

Tüm prosedürler Henan Tarım Üniversitesi (Henan Eyaleti, Çin) Hayvan Bakım Komitesi'nin etik standartlarına uygun olarak onaylanmış ve gerçekleştirilmiştir.
1. Sığır hepatosit hücre kültürü
<ol><li>Birincil hepatosit hücreleri17'yi çözün ve oda sıcaklığında 4 dakika boyunca 400 x g santrifüj yapın. NOT: Primer hepatosit hücreleri kültürlendi ve daha önce yayınlanmış bir rapor17'yi takiben muhafaza edildi.</li>
	<li>Dondurulmuş depolama solüsyonunu bir pipetle atın ve% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve Dulbecco'nun modifiye Eagle's medium (DMEM) içeren 1 mL ortam ile askıya alın. Ardından, mililitre başına hücre sayısını hesaplamak için bir hücre sayma odası kullanın ve ardından yukarıdaki hücre süspansiyonunun konsantrasyonunu hesaplayın ve hücre konsantrasyonunu 1 x 107 hücre / mL'ye ayarlayın.<ol><li>Hücre süspansiyonunu, yukarıdaki ortamın 3 mL'sini içeren 60 mm'lik bir hücre kültürü kabına ekleyin. Hücreleri kültürleyin ve 24 saat boyunca 37 ° C'de ve% 5 CO2'de inkübe edin.</li>
	</ol></li>
	<li>Hücreler% 80'e büyüdüğünde, ortamı atın ve fosfat tamponlu salin (PBS) ile durulayın, ardından hücreleri sindirmek için 750 μL% 0.25 tripsin ekleyin. Hücreleri 3 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin, ardından aynı miktarda% 10 FBS ile nötralize edin. Oda sıcaklığında 4 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj yapmak için hücre süspansiyonunu toplayın.</li>
</ol>2. Yağ kırmızısı O boyama
<ol><li>Cam kapaklar içeren 24 delikli hücre kültür plakasının her bir kuyucuğuna %10 FBS ve DMEM içeren 800 μL kültür ortamı ekleyin. Hücre süspansiyonunun 50 μL'sini alın (adım 1.3'te elde edilen) ve karıştırmak için 950 μL PBS'ye ekleyin. Mililitre başına hücre sayısını hesaplamak için bir hücre sayma odası kullanın ve ardından yukarıdaki hücre süspansiyonunun konsantrasyonunu hesaplayın. Son olarak, hücre konsantrasyonunu her bir kuyucukta 4 x 104 / mL'ye ayarlayın ve 24 saat boyunca 37 ° C'de ve% 5 CO2'de inkübe edin.</li>
	<li>24 saat sonra, kültür ortamını atın ve PBS ile yıkayın. 1 mg/mL sığır serum albümini (BSA) içeren 800 μL DMEM indüksiyon ortamı ile askıya alın.</li>
	<li>Toplam 100 μL LA'yı 900 μL susuz etanol içinde çözün ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve standart bir çözelti (100 mmol / L) hazırlayın. 24 delikli plakaya 0 μmol/L, 100 μmol/L, 150 μmol/L ve 200 μmol/L LA gradyanı ekleyin. Her tedaviyi dört kez tekrarlayın. 24 saat boyunca 37 ° C'de ve% 5 CO2'de inkübe edin.</li>
	<li>Kültür ortamını çıkarın ve hücreleri PBS ile üç kez yıkayın. 20 dakika boyunca 400 μL% 4 paraformaldehit ile sabitleyin. Fiksatif çözeltiyi atın ve PBS ile üç kez yıkayın.</li>
	<li>Hücreleri 5 dakika boyunca% 60 izopropil alkol ile inkübe edin, sonra atın. Taze hazırlanmış yağ kırmızısı O çalışma solüsyonunu ( bakınız Malzeme Tablosu) (3:2 yağ kırmızısı O:su oranı) 20-30 dakika boyunca ekleyin ve boyama solüsyonunu atın. Fazla boya çözeltisi kalmayana kadar hücreleri PBS ile iki ila beş kez yıkayın.</li>
	<li>300 μL hematoksilin boyama çözeltisi ekleyin (hematoksilin: 1:10 su oranı) ve çekirdeği 1-2 dakika boyunca yeniden boyayın. Boya çözeltisini atın ve hücreleri PBS ile iki ila beş kez yıkayın. Cam kapak kapaklarını 24 delikli plakadan çıkarın ve slaytın üzerine 10 μL tablet sızdırmazlık maddesi (bkz.</li>
	<li>Sızdırmazlıktan sonra, optik mikroskobun yağ merceği altındaki hücrelerin LD'lerini gözlemleyin ve görüntüleyin (bkz. LD'lerin çapını cellSens yazılımı ile ölçün ve LD'lerin sayısını ve boyutunu analiz edin.</li>
</ol>3. LD'lerin boyutunun ve sayısının ölçülmesi
<ol><li>Görüntü yakalama: Bilgisayarı ve mikroskop anahtarını art arda açın, slaytı yükleme platformuna yerleştirin, görüntü analiz yazılımını açın (bkz. Malzeme Tablosu) ve görüntüyü görüntülemek için bilgisayarı bağlayın.<ol><li>Görüntüleri düşük güçte bulun ve görüntüleme slaytına uygun miktarda sedir yağı damlatın. Gözlem faktörünü 100x'e ayarlayın, otomatik pozlamayı ayarlayın ve uygun görüş alanını ayarlayarak görüntüleri yakalayın. Görüntüleme için her grup için üç boyalı hücre slaytı seçin.</li>
	</ol></li>
	<li>Çap ölçümü: Çapları ölçmek için her görüntü için rastgele 60 LD seçin. Her görüntünün ölçümünden sonra, görüntüleri kaydedin ve LD'lerin ortalama boyutunun ve dağılım oranının daha sonraki analizi için ölçüm sonuçlarını bir tabloya çıkarın.</li>
	<li>Miktar ölçümü: Her boyanmış ve fotoğraflanmış slayt için üç görüntü seçin ve her resimde miktar ölçümü için rastgele üç hücre seçin. Hücrenin etrafındaki LD sayısını sayıp analiz edin ve hücredeki ortalama LD sayısını hesaplayın.</li>
</ol>4. LD füzyonunun dinamik gözlemi
<ol><li>Adım 1.1-1.3'te belirtilen hücre kültürü adımlarını izleyin. Hücreler% 80'e kadar büyüdüğünde, ortamı atın ve PBS ile durulayın, ardından 3 dakika boyunca 750 μL tripsin ile sindirin. Daha sonra, 750 μL ortam ekleyin, oda sıcaklığında 4 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj yapın ve süpernatanı atın.</li>
	<li>Hücreleri 1 mL kültür ortamında askıya alın, sayın ve hücre konsantrasyonunu 35 mm'lik bir tabakta 5 x 105 hücre / mL'ye ayarlayın. 37 °C'de kültür ve 24 saat boyunca %5 CO2 .</li>
	<li>Hücreler% 80'e büyüdüğünde, ortamı 24 saat boyunca DMEM + 150 μmol / L LA olarak değiştirin ve LD'leri biriktirmek için kültüre 37 ° C'de ve% 5 CO2'de bir inkübatörde devam edin.</li>
	<li>24 saat sonra, kültür ortamını çıkarın. Yapışkan hücreleri PBS ile yıkayın ve karanlıkta 30 dakika boyunca 10 μg / mL BODIPY 493/503 nötr floresan probu (bkz. Kuluçkadan sonra, kültür kabındaki hücreleri PBS ile üç kez yıkayın ve DMEM + 150 μmol / L LA ekleyin. NOT: 10 μg/mL BODIPY boyama sırasında ve sonrasında ışığa maruz kalmaktan kaçının; 1 mg/mL BODIPY PBS (1:100) ile seyreltildi.</li>
	<li>LD'lerin dinamik değişikliklerini gözlemlemek için kültür kabını canlı hücre istasyonunun mikroskobunun oluğuna yerleştirin (bkz.<ol><li>Güç, iletim ışık kaynağı, mikroskop güç kaynağı, cıva lambası floresan ışık kaynağı, şarj bağlantılı cihaz (CCD) kamera güç kaynağı, bilgisayar ana bilgisayar güç kaynağı, CO 2 valfi ve CO2 inkübatörünü açın.</li>
	</ol></li>
	<li>Yükleme platformundaki oluğa damıtılmış su ekleyerek havalandırma deliğinden geçmediğinizden emin olun.</li>
	<li>Bilgisayarı açın ve "NIS-Elements" ı çalıştırın. İlk olarak, 4x objektif lenste uygun görüş alanını bulun, ardından art arda 40x objektif lense ayarlayın. Örneği mikroskopta gözlemlemek için E100'ü ve örneği bilgisayarda önizlemek ve fotoğraflamak için L100'ü seçin. NOT: E100 ve L100, canlı hücre iş istasyonundaki mikroskop ayar düğmeleridir (bkz. Malzeme Tablosu), sırasıyla göz merceğini ve bilgisayar ekranını temsil eder.</li>
	<li>Floresan kanalı (örneğin, Ph-40x, Floresein izotiyosiyanat [FITC], deklanşör) ve deney için beklenen çekim süresi gibi parametreleri tasarlayın. Her iki görüntü arasındaki 5 dakikalık çekim aralığı ve toplam 6 saatlik çekim süresi dahil olmak üzere çekim süresini zamanında ayarlayın. NOT: Uzun süreli çekimlerde mükemmel netleme sistemi (PFS) netleme sabitleme işlevinin kullanılması gerekir. Bunun için önce görüş alanını ve netleme uzunluğunu ayarlayın, ardından bilgisayar ekranında PFS'ye tıklayın ve son olarak ince netleme spiralini ayarlayın.</li>
	<li>Farklı kanal modları, tek kanal veya tümü seçin, farklı bir görüş alanı seçin, önizleme'yi tıklayın, görüş alanını ayarlayın, bu parametreleri ayarlayın ve çekime başlamak için koşmaya başla'yı tıklayın. Önce 5 dakika boyunca bir test çekimi yapın; Operasyon normal olduktan sonra uzun zaman alabilir.</li>
	<li>Çekim gerçekleştirildikten sonra, verileri 'avi' formatında bir videoya dışa aktarmak için Dosya > Farklı Kaydet > Kaydet türü > avi formatını seçin. Veri programını kaydetmek ve fotoğrafları dışa aktarmak için '.nd2' görüntü biçimini kullanın.</li>
	<li>Makineyi kapatmak için, ters sırada kapatın.</li>
</ol>5. İstatistik ve sonuç analizi
<ol><li>Tek yönlü ANOVA kullanarak verileri analiz edin. Sonuçları ortalama ± standart hata olarak raporlayın.</li>
</ol>

Lipid Damlacık Boyutu ve Füzyonunun Oil Red O ve BODIPY Kullanılarak Canlı Hücre Görüntülemesi

<ol>
	<li>Fujimoto, T., Parton, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Not+just+fat:+the+structure+and+function+of+the+lipid+droplet.">Not just fat: the structure and function of the lipid droplet.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (3), 004838 (2011).</li><li>Grasselli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+non-alcoholic+fatty+liver+disease+and+potential+translational+value:+The+effects+of+3,5-L-diiodothyronine.">Models of non-alcoholic fatty liver disease and potential translational value: The effects of 3,5-L-diiodothyronine.</a> Annals of Hepatology. 16 (5), 707-719 (2017).</li><li>Herdt, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ruminant+adaptation+to+negative+energy+balance:+Influences+on+the+etiology+of+ketosis+and+fatty+liver.">Ruminant adaptation to negative energy balance: Influences on the etiology of ketosis and fatty liver.</a> Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice. 16 (2), 215-230 (2000).</li><li>Pino-de la Fuente, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exercise+regulation+of+hepatic+lipid+droplet+metabolism.">Exercise regulation of hepatic lipid droplet metabolism.</a> Life Sciences. 298, 120522 (2022).</li><li>O'Connor, D., Byrne, A., Berselli, G. B., Long, C., Keyes, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mega-stokes+pyrene+ceramide+conjugates+for+STED+imaging+of+lipid+droplets+in+live+cells.">Mega-stokes pyrene ceramide conjugates for STED imaging of lipid droplets in live cells.</a> Analyst. 144 (5), 1608-1621 (2019).</li><li>Gao, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+lipid+droplet+fusion+and+growth+by+CIDE+family+proteins.">Control of lipid droplet fusion and growth by CIDE family proteins.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA). Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (10), 1197-1204 (2017).</li><li>T&#252;t&#252;nc&#252; Konyar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+changes+in+insoluble+polysaccharides+and+neutral+lipids+in+the+developing+anthers+of+an+endangered+plant+species,+Pancratium+maritimum.">Dynamic changes in insoluble polysaccharides and neutral lipids in the developing anthers of an endangered plant species, Pancratium maritimum.</a> Plant Systematics and Evolution. 304, 397-414 (2018).</li><li>Spangenburg, E. E., Pratt, S. J. P., Wohlers, L. M., Lovering, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+BODIPY+(493/503)+to+visualize+intramuscular+lipid+droplets+in+skeletal+muscle.">Use of BODIPY (493/503) to visualize intramuscular lipid droplets in skeletal muscle.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 598358 (2011).</li><li>Mehlem, A., Hagberg, C. E., Muhl, L., Eriksson, U., Falkevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+neutral+lipids+by+oil+red+O+for+analyzing+the+metabolic+status+in+health+and+disease.">Imaging of neutral lipids by oil red O for analyzing the metabolic status in health and disease.</a> Nature Protocols. 8 (6), 1149-1154 (2013).</li><li>Diaz, G., Melis, M., Batetta, B., Angius, F., Falchi, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrophobic+characterization+of+intracellular+lipids+in+situ+by+Nile+Red+red/yellow+emission+ratio.">Hydrophobic characterization of intracellular lipids in situ by Nile Red red/yellow emission ratio.</a> Micron. 39 (7), 819-824 (2008).</li><li>Duan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+synthesis+of+polarity-sensitive+fluorescent+dyes+based+on+the+BODIPY+chromophore.">The synthesis of polarity-sensitive fluorescent dyes based on the BODIPY chromophore.</a> Dyes and Pigments. 89 (3), 217-222 (2011).</li><li>Rumin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+fluorescent+Nile+red+and+BODIPY+for+lipid+measurement+in+microalgae.">The use of fluorescent Nile red and BODIPY for lipid measurement in microalgae.</a> Biotechnology for Biofuels. 8, 42 (2015).</li><li>Fam, T. K., Klymchenko, A. S., Collot, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+fluorescent+probes+for+lipid+droplets.">Recent advances in fluorescent probes for lipid droplets.</a> Materials. 11 (9), 1768 (2018).</li><li>Raboisson, D., Mouni&#233;, M., Maign&#233;, &. #. 2. 0. 1. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diseases,+reproductive+performance,+and+changes+in+milk+production+associated+with+subclinical+ketosis+in+dairy+cows:+A+meta-analysis+and+review.">Diseases, reproductive performance, and changes in milk production associated with subclinical ketosis in dairy cows: A meta-analysis and review.</a> Journal of Dairy Science. 97 (12), 7547-7563 (2014).</li><li>Ospina, P. A., Nydam, D. V., Stokol, T., Overton, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Associations+of+elevated+nonesterified+fatty+acids+and+&#946;-hydroxybutyrate+concentrations+with+early+lactation+reproductive+performance+and+milk+production+in+transition+dairy+cattle+in+the+northeastern+United+States.">Associations of elevated nonesterified fatty acids and &#946;-hydroxybutyrate concentrations with early lactation reproductive performance and milk production in transition dairy cattle in the northeastern United States.</a> Journal of Dairy Science. 93 (4), 1596-1603 (2010).</li><li>Campos-Espinosa, A., Guzm&#225;n, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+of+experimental+steatosis+in+vitro:+hepatocyte+cell+culture+in+lipid+overload-conditioned+medium.">A model of experimental steatosis in vitro: hepatocyte cell culture in lipid overload-conditioned medium.</a> Journal of Visualized Experiments. (171), e62543 (2021).</li><li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+nonesterified+fatty+acids+on+the+synthesis+and+assembly+of+very+low+density+lipoprotein+in+bovine+hepatocytes+in+vitro.">Effects of nonesterified fatty acids on the synthesis and assembly of very low density lipoprotein in bovine hepatocytes in vitro.</a> Journal of Dairy Science. 97 (3), 1328-1335 (2014).</li><li>Wang, L., Liu, J. Y., Miao, Z. J., Pan, Q. W., Cao, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+and+their+interactions+with+other+organelles+in+liver+diseases.">Lipid droplets and their interactions with other organelles in liver diseases.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 133, 105937 (2021).</li><li>Sanjabi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+hypertrophy:+a+crucial+determining+factor+in+insulin+regulation+by+adipocytes.">Lipid droplets hypertrophy: a crucial determining factor in insulin regulation by adipocytes.</a> Scientific Reports. 5, 8816 (2015).</li><li>Saponaro, C., Gaggini, M., Carli, F., Gastaldelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+subtle+balance+between+lipolysis+and+lipogenesis:+a+critical+point+in+metabolic+homeostasis.">The subtle balance between lipolysis and lipogenesis: a critical point in metabolic homeostasis.</a> Nutrients. 7 (11), 9453-9474 (2015).</li><li>Yang, A., Mottillo, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocyte+lipolysis:+from+molecular+mechanisms+of+regulation+to+disease+and+therapeutics.">Adipocyte lipolysis: from molecular mechanisms of regulation to disease and therapeutics.</a> Biochemical Journal. 477 (5), 985-1008 (2020).</li><li>Gluchowski, N. L., Becuwe, M., Walther, T. C., Farese, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+and+liver+disease:+from+basic+biology+to+clinical+implications.">Lipid droplets and liver disease: from basic biology to clinical implications.</a> Nature Reviews Gastroenterology &amp; Hepatology. 14 (6), 343-355 (2017).</li><li>Meex, R. C. R., Schrauwen, P., Hesselink, M. K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+myocellular+fat+stores:+lipid+droplet+dynamics+in+health+and+disease.">Modulation of myocellular fat stores: lipid droplet dynamics in health and disease.</a> American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 297 (4), 913-924 (2009).</li><li>Sarnyai, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+cis-and+trans-monounsaturated+fatty+acids+on+palmitate+toxicity+and+on+palmitate-induced+accumulation+of+ceramides+and+diglycerides.">Effect of cis-and trans-monounsaturated fatty acids on palmitate toxicity and on palmitate-induced accumulation of ceramides and diglycerides.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (7), 2626 (2020).</li><li>Ricchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effect+of+oleic+and+palmitic+acid+on+lipid+accumulation+and+apoptosis+in+cultured+hepatocytes.">Differential effect of oleic and palmitic acid on lipid accumulation and apoptosis in cultured hepatocytes.</a> Journal of Gastroenterology and Hepatology. 24 (5), 830-840 (2009).</li><li>Fei, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+phosphatidic+acid+in+the+formation+of+&amp;#34;supersized&amp;#34;+lipid+droplets.">A role for phosphatidic acid in the formation of &amp;#34;supersized&amp;#34; lipid droplets.</a> PLoS Genetics. 7 (7), e1002201 (2011).</li><li>Kowada, T., Maeda, H., Kikuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BODIPY-based+probes+for+the+fluorescence+imaging+of+biomolecules+in+living+cells.">BODIPY-based probes for the fluorescence imaging of biomolecules in living cells.</a> Chemical Society Reviews. 44 (14), 4953-4972 (2015).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+the+fluorescent+dye+BODIPY+in+the+study+of+lipid+dynamics+of+the+rice+blast+fungus+Magnaporthe+oryzae.">Application of the fluorescent dye BODIPY in the study of lipid dynamics of the rice blast fungus Magnaporthe oryzae.</a> Molecules. 23 (7), 1594 (2018).</li></ol>

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Patolojik durumlara bağlı olarak, hepatik LD'ler boyutlarında ve sayılarında muazzam değişikliklere uğrarlar. LD'ler hepatosit hücrelerinde yaygın olarak bulunur ve karaciğer sağlığı ve hastalığında önemli bir rol oynar18. LD'lerin miktarı ve büyüklüğü, LD'lerin biyogenezi üzerine yapılan güncel araştırmaların temelidir19. Hücreler ve dokular için LD'lerin büyüklüğü ve sayısı, enerji depolama ve serbest bırakma yeteneklerini yansıt?...

Hepatositlerde lipid damlacığı (LD) birikimi, karaciğer fibrozisi ve hepatosellüler karsinoma ilerleyebilen alkolsüz yağlı karaciğer hastalığının (NAFLD) tipik özelliğidir. Yağlı karaciğer hastalığının en erken belirtisinin, hepatosit1'in sitoplazmasında LD birikimi ile karakterize steatoz olduğu bulunmuştur. Karaciğer steatozu her zaman LDs2'nin artmış sayısı ve / veya genişlemiş boyutu ile ilişkilidir. LD'lerin, çekirdek olarak trigliseritten (TG) oluşan endoplazmik retikulumdan (ER) üretildiği ve proteinler ve fosfolipitlerle çevrili olduğu düşünülmektedir3. TG depolamasından sorumlu hücre altı organel olarak, LD'ler boyutları, sayıları, lipit kompozisyonları, proteinleri ve diğer organellerle etkileşimleri ile ilgili farklı özellikler sergilerler ve bunların hepsi hücre enerjisi homeostazını etkiler4. TG seviyesi LD'lerin boyutu ile pozitif ilişkilidir ve daha yüksek bir hücre içi TG içeriği daha büyük LD'leroluşturabilir 5. LD'ler, TG'nin lokal sentezi, ER'de lipit katılımı ve çoklu LD'lerin füzyonu yoluyla boyut olarak artar6. Büyük LD'ler içeren hücreler (adipositler, hepatositler, vb.), LD füzyonu ile lipit depolanmasını etkili bir şekilde arttırmak için özel bir mekanizmaya sahiptir. LD'lerin dinamik değişiklikleri, hücrenin farklı enerji metabolizması durumlarını yansıtır. Sağlıklı ve anormal hücrelerdeki çeşitli hepatik LD'lerin gözlemlenmesine ve analizine izin veren metodolojiler geliştirmek çok önemlidir.
LD'ler için ana floresan olmayan boyalar Sudan Siyah B ve yağ kırmızısı O. Sudan Siyah B nötr lipitleri, fosfolipitleri ve steroidleri boyar7. Yağ kırmızısı O esas olarak iskelet kası, kardiyomiyositler, karaciğer dokusu, yağ hücreleri, vb.LD'leri boyamak için kullanılır 8 ve farelerde ve insanlarda karaciğer steatozunun kantitatif tespiti için standart bir araç olarak kabul edilir9. LD'lerin dinamik değişimi esas olarak floresan boyama ile gerçekleştirilir. Nil kırmızısı ve BODIPY yaygın olarak kullanılan floresan lipit boyalarıdır10,11. Nil kırmızısı ile karşılaştırıldığında, BODIPY daha güçlü doku geçirgenliğine sahiptir ve LDs12 ile daha iyi bağlanır. BODIPY etiketli LD'ler, canlı hücreleri boyamak ve diğer organellerle kolokalizasyon için kullanılabilir13.
Ruminant hayvanlarda yağlı karaciğer hastalığı insidansı monogastrik hayvanlara göre anlamlı derecede yüksektir14. Geçiş döneminde, süt negatif enerji dengesi durumu yaşarlar3. Büyük miktarlarda esterleştirilmemiş yağ asitleri (palmitik asit, oleik asit, linoleik asit, vb.) sığır hepatositlerinde TG'lere sentezlenir, bu da karaciğer fonksiyonel anormalliğine yol açar ve süt ürünlerinin kalitesini ve üretim verimliliğini büyük ölçüde azaltır15. Bu çalışma, LD'lerin boyut ve sayılarını analiz etmek ve LD füzyon dinamiklerini izlemek için bir protokol sağlamayı amaçlamaktadır. Hepatositler16'ya farklı konsantrasyonlarda linoleik asit (LA) ekleyerek bir LD oluşum modeli oluşturduk ve LD'leri yağ kırmızısı O ile boyayarak işlem sırasında LD'lerin boyutundaki ve sayısındaki değişiklikleri gözlemledik. Ek olarak, LD'lerin hızlı füzyon süreci BODIPY 493/503 ile boyanarak da gözlenmiştir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200072</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1110</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BODIPY 493/503</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>2295015</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cedar oil</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>C7140</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell counting chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353002</td>
			<td>material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell sens software&#160;</td>
			<td>Olympus IX73</td>
			<td></td>
			<td>software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>2492319</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hematoxylin</td>
			<td>DingGuo</td>
			<td>AR0712</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image view</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>image analysis sodtware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>linoleic acid</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>SL8520</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live Cell Station</td>
			<td>Nikon A1 HD25</td>
			<td></td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oil red O</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G1260</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>optical microscope</td>
			<td>Olympus IX73</td>
			<td></td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin &#38; Streptomycin 100&#215;</td>
			<td>NCM Biotech</td>
			<td>CLOOC5</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30258.01</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealing agent</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>S2150</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of lipid droplet size and fusion in bovine hepatic cells

Lipid damlacıkları (LD'ler), lipid metabolizmasında ve hücrelerde nötr lipid depolanmasında önemli rol oynayan organellerdir. Obezite, yağlı karaciğer hastalığı ve diyabet gibi çeşitli metabolik hastalıklarla ilişkilidirler. Hepatik hücrelerde, LD'lerin boyutları ve sayıları yağlı karaciğer hastalığının belirtileridir. Ayrıca, oksidatif stres reaksiyonu, hücre otofajisi ve apoptoza genellikle LD'lerin boyutlarında ve sayılarında değişiklikler eşlik eder. Sonuç olarak, LD'lerin boyutları ve miktarları, LD biyogenezinin mekanizması ile ilgili mevcut araştırmaların temelini oluşturmaktadır. Burada, yağ asidine bağlı sığır karaciğer hücrelerinde, LD'leri boyamak ve LD'lerin boyutlarını ve sayılarını araştırmak için yağ kırmızısı O'nun nasıl kullanılacağını açıklıyoruz. LD'lerin boyut dağılımı istatistiksel olarak analiz edilmiştir. Küçük LD'lerin büyük LD'lere kaynaşma süreci de canlı hücre görüntüleme sistemi tarafından gözlemlenir. Mevcut çalışma, farklı fizyolojik koşullar altında LD'lerin boyut değişim eğilimini doğrudan gözlemlemenin bir yolunu sunmaktadır.

Lipid droplet (LD) accumulation in hepatocytes is the typical characteristic of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), which can progress to liver fibrosis and hepatocellular carcinoma. It has been found that the earliest manifestation of fatty liver disease is steatosis, characterized by LD accumulation in the cytoplasm of the hepatocyte1. Liver steatosis is invariably associated with an increased number and/or expanded size of LDs2. LDs are thought to be generated from the endoplasmic reticulum (ER), consisting of triglyceride (TG) as the core, and are surrounded by proteins and phospholipids3. As the subcellular organelle responsible for TG storage, LDs exhibit different features regarding their size, number, lipid composition, proteins, and interaction with other organelles, all of which affect cell energy homeostasis4. The TG level is positively correlated with the size of LDs, and a higher intracellular TG content could form larger LDs5. LDs increase in size through the local synthesis of TG, lipid incorporation in the ER, and the fusion of multiple LDs6. Cells (adipocytes, hepatocytes, etc.) that contain large LDs have a special mechanism to efficiently increase lipid storage by LD fusion. The dynamic changes of LDs reflect the different energy metabolism states of the cell. It is crucial to develop methodologies that allow the observation and analysis of the various hepatic LDs in healthy and abnormal cells.
The main non-fluorescent dyes for LDs are Sudan Black B and oil red O. Sudan Black B stains neutral lipids, phospholipids, and steroids7. Oil red O is mainly used for staining LDs of skeletal muscle, cardiomyocytes, liver tissue, adipose cells, etc8., and is considered a standard tool for the quantitative detection of liver steatosis in mice and humans9. The dynamic change of LDs is mainly carried out by fluorescence dyeing. Nile red and BODIPY are both commonly used fluorescent lipid dyes10,11. Compared with Nile red, BODIPY has stronger tissue permeability and binds better with LDs12. BODIPY-labeled LDs can be used for staining living cells and colocalization with other organelles13.
The incidence of fatty liver disease is significantly higher in ruminant animals than in monogastric animals14. During the transition period, dairy cows experience a state of negative energy balance3. Large quantities of non-esterified fatty acids (palmitic acid, oleic acid, linoleic acid, etc.) are synthesized into TGs in bovine hepatocytes, which leads to liver functional abnormality and greatly reduces the quality of milk products and production efficiency15. The present study aims to provide a protocol to analyze the size and the number of LDs, as well as to monitor the LD fusion dynamics. We constructed a model of LD formation by adding different concentrations of linoleic acid (LA) in hepatocytes16 and observed the changes in the size and the number of LDs during the process by staining LDs with oil red O. In addition, the process of the rapid fusion of LDs was also observed by staining with BODIPY 493/503.

Yazar Spotlight: Sığır Hepatik Hücrelerinde Lipid Damlacık Boyutunun ve Füzyonunun Değerlendirilmesi  

Sığır Hepatik Hücrelerinde Lipid Damlacık Büyüklüğü ve Füzyonunun Değerlendirilmesi

Our research focus on the lipid droplet number and the size induced by linoleic acid in liver cells. Additionally, we aim to provide insights into the mechanism of the fatty liver. Recent advancements in this field of research, suggests that choline, CCT alpha, established induced autophagy, can regulate lipid droplet size in bovine hepatic cells.Moreover, living cell workstation observations have shown that phospholipids have a considerable effect on lipid droplet fusion. Currently, gene aiding, fluorescence tweezer, liquid chromatography, omics analysis, single chromatography, flow cytometry, and other technologies are being used to group the vast research in this field. The experimental method has some limitations.For example, the phenomenon of limited fields can only be observed for lipid droplet fields and under a certain flight of waste. Oil Red O staining is more convenient, less expensive, and more widely used to measure the apparent size of lipid droplets than lipid droplet fluorescence staining. It is simple to operate and requires less equipment.Furthermore, we directly observe this phenomenal of lipid fusion through the living cell station. This study provide a simple and repeatable method to observe lipid droplet size and fusion, which can be widely applied to lipid droplet analysis in cellular lipid metabolism research. We will continue to conduct intensive research on lipid droplets, focusing on the mechanism of lipid droplet fusion and the structure changes of fatty liver in dairy cows.

LD hücrelerinin boyanması Şekil 1'de gösterilmiştir. Kırmızı noktalar hücre LD'lerini yansıtır ve mavi noktalar çekirdekleri yansıtır. LA tedavisinde her resimdeki LD'lerin boyut ve sayısının farklı olduğu görülebilir.
LA dozajındaki artışla birlikte, LD'lerin ortalama çapı ve sayısı, LA konsantrasyonuna bağlı olarak önemli ölçüde artan bir eğilim göstermiştir (Şekil 2). Şeki...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Lipid Droplet Size and Fusion in Bovine Hepatic Cells at JoVE.com

Bu protokol, lipit damlacıklarını (LD'ler) boyamak, yağ asidi kaynaklı yağlı hepatosit modelinde LD'lerin boyutunu ve sayısını hesaplamak ve canlı hücre görüntüleme ile küçük LD'lerin büyük LD'lere kaynaşma sürecini gözlemlemek için BODIPY 493/503'ün nasıl kullanılacağını açıklamaktadır.

Lipid droplets (LDs) are organelles that play an important role in lipid metabolism and neutral lipid storage in cells. They are associated with a variety ...

Araştırmamız, lipit damlacık sayısına ve karaciğer hücrelerinde linoleik asit tarafından indüklenen boyuta odaklanmaktadır. Ek olarak, yağlı karaciğerin mekanizması hakkında bilgi vermeyi amaçlıyoruz. Bu araştırma alanındaki son gelişmeler, indüklenmiş otofajiyi kuran kolin, CCT alfa'nın, sığır hepatik hücrelerinde lipit damlacık boyutunu düzenleyebileceğini düşündürmektedir.Ayrıca, canlı hücre iş istasyonu gözlemleri, fosfolipitlerin lipit damlacık füzyonu üzerinde önemli bir etkiye sahip olduğunu göstermiştir. Şu anda, gen yardımı, floresan tweezer, sıvı kromatografisi, omik analiz, tek kromatografi, akış sitometrisi ve diğer teknolojiler bu alandaki geniş araştırmaları gruplandırmak için kullanılmaktadır. Deneysel yöntemin bazı sınırlamaları vardır.Örneğin, sınırlı alanlar fenomeni sadece lipit damlacık alanları için ve belirli bir atık uçuşu altında gözlemlenebilir. Yağ Kırmızı O boyama, lipit damlacıklarının görünür boyutunu ölçmek için lipit damlacığı floresan boyamasından daha uygun, daha az pahalı ve daha yaygın olarak kullanılır. Kullanımı kolaydır ve daha az ekipman gerektirir.Dahası, bu fenomen lipit füzyonunu canlı hücre istasyonu aracılığıyla doğrudan gözlemliyoruz. Bu çalışma, hücresel lipid metabolizması araştırmalarında lipit damlacık analizine yaygın olarak uygulanabilen lipit damlacık boyutunu ve füzyonunu gözlemlemek için basit ve tekrarlanabilir bir yöntem sunmaktadır. Süt ineklerinde lipid damlacık füzyon mekanizmasına ve yağlı karaciğerin yapı değişikliklerine odaklanarak lipid damlacıkları üzerinde yoğun araştırmalar yapmaya devam edeceğiz.

evaluation-of-lipid-droplet-size-and-fusion-in-bovine-hepatic-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Evaluation of Lipid Droplet Size and Fusion in Bovine Hepatic Cells

1.1K Görüntüleme.  Henan Agricultural University. Araştırmamız, lipit damlacık sayısına ve karaciğer hücrelerinde linoleik asit tarafından indüklenen boyuta odaklanmaktadır. Ek olarak, yağlı karaciğerin mekanizması hakkında bilgi vermeyi amaçlıyoruz. Bu araştırma alanındaki son gelişmeler, indüklenmiş otofajiyi kuran kolin, CCT alfa'nın, sığır hepatik hücrelerinde lipit damlacık boyutunu düzenleyebileceğini düşündürmektedir.Ayrıca, canlı hücre iş istasyonu gözlemleri, fosfolipitlerin lipit daml...

Video: Yazar Spotlight: Sığır Hepatik Hücrelerinde Lipid Damlacık Boyutunun ve Füzyonunun Değerlendirilmesi  

Lipid droplets (LDs) are organelles that play an important role in lipid metabolism and neutral lipid storage in cells. They are associated with a variety of metabolic diseases, such as obesity, fatty liver disease, and diabetes. In hepatic cells, the sizes and numbers of LDs are signs of fatty liver disease. Moreover, the oxidative stress reaction, cell autophagy, and apoptosis are often accompanied by changes in the sizes and numbers of LDs. As a result, the dimensions and quantity of LDs are the basis of the current research regarding the mechanism of LD biogenesis. Here, in fatty acid-induced bovine hepatic cells, we describe how to use oil red O to stain LDs and to investigate the sizes and numbers of LDs. The size distribution of LDs is statistically analyzed. The process of small LDs fusing into large LDs is also observed by a live cell imaging system. The current work provides a way to directly observe the size change trend of LDs under different physiological conditions.

The present protocol describes how to use oil red O to dye lipid droplets (LDs), calculate the size and number of LDs in a fatty acid-induced fatty hepatocyte model, and use BODIPY 493/503 to observe the process of small LDs fusing into large LDs by live cell imaging.

Biyoloji

Oil Red O Staining and Measurement of Lipid Droplets (LDs) in Bovine Hepatocyte Cells

To begin, take a previously seated 24 well culture plate and place a glass cover slip in each well. Then add 800 microliters of culture medium containing 10%FBS and DMEM. After adjusting cell concentration.Incubate it at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide for 24 hours. Then discard the culture medium and wash the cells with PBS. Suspend the cells in 800 microliters of DMEM induction medium containing BSA.Dissolve linoleic acid in anhydrous ethanol to prepare a standard solution at a concentration of 100 millimolar per liter. Add linoleic acid in increasing gradient to the plate and repeat it four times. Then incubate the plate at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide for 24 hours.At the end of the incubation, remove the culture medium and wash the cells with PBS three times. Fix them with 400 microliters of 4%paraform aldehyde for 20 minutes. Then discard the fixative solution and wash them again.Incubate the cells with 60%isopropyl alcohol for five minutes then discard it. Add freshly prepared oil red O working solution and discard it after 20 to 30 minutes. Wash the cells with PBS two to five times until the excess dye solution is removed.Restain the nucleus with 300 microliters of hematoxylin solution for one to two minutes. Then discard the dye solution and wash them again. Remove the glass cover slip from the PBS washed plate and place it with cells facing down on a microscopic slide containing 10 microliters of tablet sealant.To measure the size and number of LDs, turn on the computer and microscope switch successively and place the slide on the loading platform. Then open the image analysis software. Find the images at low power and drip an appropriate amount of cedar oil on the imaging slide.Gradually adjust the objective 200x and adjust the field of view until a clear image is found. Then capture images from the desired regions and save them. Randomly, select 60 LDs for each image and measure the diameter.Export the measurement results into a table to analyze LDs average size and distribution ratio. The stained hepatocyte cultured cells showed different sizes and numbers of LDs. Under the different concentrations of linoleic acid treatment.The number of LDs per cell was negatively correlated with different concentrations of linoleic acid. The median LD number per cell was 136 for the 100 micromolar per liter linoleic acid treated group and decreased at high concentrations. The average diameter of LDs in the control group was 0.72 micrometers which increased with increasing concentration in the linoleic acid treated group.A high linoleic acid concentration increased the proportion of large LDs and decreased small LDs.

Yağ Kırmızısı O Sığır Hepatosit Hücrelerinde Lipit Damlacıklarının (LD) Boyanması ve Ölçümü

Dynamic Observation of Lipid Droplet (LD) Fusion in Bovine Hepatocyte Cells

To begin, obtain 80%grown bovine hepatocyte cells and replace the culture medium with DMEM containing linoleic acid. Incubate the cells at 37 degrees Celsius in 5%carbon dioxide for 24 hours to accumulate the LDs. Then remove the culture medium and wash the adherence cells with PBS.Add BODIPY neutral fluorescent probe in the cells and incubate in the dark for 30 minutes. After three PBS washes, add DMEM containing linoleic acid to the cells. Place the culture dish in the groove of the microscope of the living cell station and turn on the microscope and computer.Run NIS-Elements software. Find the field of view at 4x magnification. Then adjust it to the 40x, turn PFS on, refocus, and select the appropriate field of view.For the test run, set the appropriate time and channels. Then press Run Now to shoot the samples for one minute. For the experiment, in the Time tab, set the interval time of five minutes and shoot duration of six hours, set fluorescent and bright-field channels, and press Run now to shoot the samples.Then choose File followed by Save As and AVI Image File format to export the data to a video in AVI format. Large LDs were formed through the fusion of small LDs. In the first 15 minutes, there were smaller LDs.From 20 minutes, they started to fuse and were completely fused into larger LDS by 35 minutes.