Yazarlar, mikrodizi robotikle ilgili uzman tavsiyeleri için ArrayJet'e teşekkür eder. SS ve JS, Chiang Mai Üniversitesi, Temel Fon 2022'nin (FF65/004) desteğini kabul eder.

MAPP yönteminin ana deneysel aşamaları Şekil 1'de özetlenmiştir.
1. Numunelerin hazırlanması
NOT: Burada yöntem, açıklama amacıyla bitki dokularına uygulanır. Seçilen bitkiler Coffea arabica, Allium sativum var. ophioscorodon ve birkaç Tayland mango çeşidi (Aokrong, Kam, Rad, Chokanan, Mamkamdang, Talabnak, Mahachanok ve Nga). Bitkiler ticari önemleri nedeniyle seçildi. İnsan tüketimi için işlenmesi, şu anda yeterince kullanılmayan tarımsal-endüstriyel atıklar üretir ve bu da saf glikanlar da dahil olmak üzere katma değerli ürünler kaynağı sağlayabilir. Bu nedenle, biyoprospektif amaçlar için atık bitki biyokütlesinin glikan bileşimini karakterize etmek için MAPP uygulandı.
<ol><li>Bitki materyalini farklı dokulara ayırın (örneğin kök, gövde ve yapraklar).</li>
	<li>Bitki dokularını 40 °C'de sıcak hava fırınında 12-24 saat kurutun (numuneye göre süreyi azaltın/artırın). Alternatif olarak, numuneleri sıvı nitrojen içinde dondurun ve ardından ~4 gün boyunca liyofilize edin.</li>
	<li>Numuneleri, bir havan tokmağı ve havan tokmağı veya her tüpte bir bilyalı rulman bulunan mekanik bir doku parçalayıcı (Malzeme Tablosuna bakınız) kullanarak ince bir toz halinde homojenize edin. NOT: Taze bitki dokusu için homojenizasyondan önce kurutma veya liyofilize edilmesi önerilir. Genel olarak, havan tokmağı ve havan ile homojenizasyon çoğu kuru numune için yeterlidir. Tahıllar, baklagiller ve makarna gibi işlenmiş gıda maddeleri gibi özellikle esnek numuneler için sıvı nitrojende ani dondurma, numune homojenizasyonunun hızını ve verimliliğini artırabilir. Mekanik homojenizasyonun neredeyse tüm numune türleriyle uyumlu olduğunu, önemli ölçüde daha hızlı ve daha az emek yoğun olduğunu ve aynı ekipmanın (yani havan ve havan) tekrar tekrar kullanılmasından kaynaklanan numune çapraz kontaminasyonu riskini etkili bir şekilde en aza indirdiğini gördük.</li>
</ol>2. Alkolde çözünmeyen kalıntının (AIR) hazırlanması
<ol><li>50-100 mg havada kurutulmuş ve homojenize edilmiş numune materyaline 1,5 mL %70 (h/h) etanol ekleyin.</li>
	<li>Karıştırmak için iyice vorteksleyin ve ardından oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 10.000 x g'da santrifüjleyin. Elde edilen süpernatanı bir pipet kullanarak atın ve peleti saklayın.</li>
	<li>Kalan pelete 1.5 mL metanol ve kloroform (1:1 [h/h]) ekleyin. Girdap, santrifüj ve süpernatanı adım 2.2'ye göre atın.</li>
	<li>Kalan pelete 1.5 mL% 100 aseton ekleyin. Girdap, santrifüj ve süpernatanı adım 2.2'ye göre atın.</li>
	<li>Elde edilen peleti, kalan asetonun buharlaşmasını sağlamak için gece boyunca bir çeker ocakta veya kuruyana kadar bir vakumlu santrifüjde yerleştirin. NOT: AIR malzemesi gerekli olana kadar ortam sıcaklığında saklanabilir.</li>
</ol>3. Glikan ekstraksiyonu
NOT: Mümkünse, yeniden süspansiyona yardımcı olmak için tüm ekstraksiyon adımlarını her tüpte bir bilyalı rulman bulunan bir doku parçalayıcıda gerçekleştirin. Bir doku parçalayıcısı mevcut değilse, bunun yerine sürekli karıştırma veya çalkalama ile ekstraksiyonlar yapılabilir. Bu mümkün değilse ekstraksiyon süresini uzatmak gerekebilir.
<ol><li>10 mg AIR malzemesine 30 μL/mg 50 mM sikloheksandiamintetraasetik asit (CDTA; bkz . Malzeme Tablosu), pH 7.5 ekleyin.</li>
	<li>27 Hz'de 2 dakika, ardından 10 Hz'de 2 saat çalkalayın.</li>
	<li>4 °C'de 10 dakika boyunca 10.000 x g'da santrifüjleyin. Elde edilen süpernatanı tutun, steril bir mikrosantrifüj tüpüne ekleyin ve 4 °C'de döner bir çalkalayıcıda saklayın.</li>
	<li>Artık pelete 30 μL/mg 4 M NaOH +% 0.1 (a/h) NaBH4 ekleyin. DİKKAT: NaBH4 yutulduğunda toksiktir. Kişisel koruyucu ekipman (KKD) kullanın. Çeker ocak altında tutun. Toz oluşumundan kaçının. Toz solumaktan kaçının. Ürünün su ile temas etmesine izin vermeyin.</li>
	<li>3.2'den 3.3'e kadar olan adımları tekrarlayın. Kalan NaOH'yi çıkarmak için kalan peleti iki veya üç kez dH2O ile yıkayın.</li>
	<li>Peletlere 30 μL/mg selülaz (tercihen GH5 endo-1,4-β-glukanaz, uygun enzim tamponunda, üretici tarafından önerildiği gibi; Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin ve enzim optimum sıcaklığında 16 saat inkübe edin.</li>
	<li>Numuneleri 10.000 x g'da 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı tutun, temiz mikrosantrifüj tüplerine aktarın ve döner bir çalkalayıcıda 4 °C'de saklayın. Numuneler çıkarıldıktan sonra mümkün olan en kısa sürede basılmalıdır.</li>
	<li>Saklanan tüm ekstraktları tekrar 10.000 x g'da 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin. NOT: Numunelerde partikül ve kalıntı bulunmamalıdır. Gerekirse mikrodizi baskıdan önce 0,2 μm döndürme filtresinden geçirin. Özellikle viskoz numuneler, mikroarrayer kılcal damarları ve yazıcı kafası kolayca tıkanabileceğinden, mikroarray analizi ile uyumsuzdur. Genel bir kural olarak, kullanıcılar yazdırmak için tasarlanan tüm numuneleri standart bir düşük hacimli pipetle pipetleyebilmelidir.</li>
</ol>4. Standartların hazırlanması
<ol><li>SterildH 2O'da tanımlanmış glikan standartlarının (Tablo 1) 1 mg / mL çözeltilerini hazırlayın. Standart olarak pachyman kullanılıyorsa, bunun yerine 4 M NaOH içinde çözün ve çözündürmeyi takiben buzlu asetik asit ile nötralize edin.</li>
	<li>Hazırlanan standartları, tam çözünmeye izin vermek için gece boyunca 4 °C'de döner bir çalkalayıcı üzerinde saklayın.</li>
	<li>Herhangi bir kalıntıyı pelet haline getirmek için tüm standartları 10.000 x g'de 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin. Elde edilen süpernatant, sonraki baskı için kullanılır.</li>
</ol>5. Mikrodizi baskı
<ol><li>Gliserol sistemi tamponunda siyah Hint mürekkebi/çizim mürekkebinin 1:20 (h/h) seyreltmesini hazırlayın (GSB; %47 gliserol, %52.9dH2O, %0.06 Triton X-100 ve %0.04 biyosit [suda %0.15-%0.17 bakır nitrat ve %1.4-%2.0 magnezyum nitrat] ve filtre sterilize edin) (Malzeme Tablosuna bakın) ve 15.000 x g'da (oda sıcaklığında) 10 dakika santrifüjleyin. NOT: Yazdırılan mikrodizilerin membran üzerinde görsel olarak algılanabilmesi için, yazdırılan numunelerin etrafında bir üst ve alt kenarlık oluşturmak için mürekkep çözeltisi gereklidir. Bununla birlikte, mürekkep çözeltisinin tortu içermesi muhtemeldir. Baskı için tüm solüsyonlarda partikül bulunmamalıdır, bu nedenle pipetleme sırasında tortuyu bozmaktan kaçının. Artık mümkün olmadığında atın ve taze hazırlayın. Çözelti, partikülleri gidermek için kolayca filtrelenemez.</li>
	<li>İlk 384 oyuklu plakanın ilk bölümüne 40 μL mürekkep çözeltisi ve GSB ekleyin (Şekil 2).</li>
	<li>Tüm seyreltme 1 (D1) kuyucuklarına 25 μL GSB ekleyin. Tüm seyreltme 2, 3 ve 4 (D2-D4) kuyucuklarına 40 μL GSB ekleyin.</li>
	<li>Ekstrakte edilen glikan örneklerini ve tanımlanmış glikan substratlarını sırasıyla D1 kuyucuklarına 25 μL ekstrakte edilmiş glikan örneği ekleyerek GSB ile 1:1 (h/v) seyreltin.</li>
	<li>D1 kuyucuğundan 10 μL numune alarak ve D2 kuyucuğuna ekleyerek her numuneyi dört kez seri olarak seyreltin. Karıştırmak için bir pipetle hafifçe aspire edin.</li>
	<li>D2 kuyusundan 10 μL numune alıp D3 kuyucuğuna ilave ederek işlemi tekrarlayın.</li>
	<li>D4 kuyusu için tekrarlayın. Karıştırdıktan sonra, her bir kuyucuğun 40 μL'lik bir nihai hacmi içermesi için D4 kuyucuğundan 10 μL atın.</li>
	<li>Son plakanın son bloğuna 40 μL mürekkep çözeltisi ve GSB ekleyin.</li>
	<li>Plakaları yapışkan bir plaka kapağıyla örtün ve 3.000 x g'da (oda sıcaklığı) 10 dakika santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra kabarcık kalmadığından emin olun ve gerekirse tekrarlayın.</li>
	<li>Temassız bir piezoelektrik mikrodizi baskı robotu kullanarak, aşağıdaki adımları izleyerek numuneleri nitroselüloz membran üzerine yazdırın (Malzeme Tablosuna bakın). NOT: Optimum baskı kalitesi için önerilen işlemler aşağıdadır; Bununla birlikte, gerekli olan spesifik parametreler nihayetinde kullanılan cihaza bağlı olacaktır. Kullanıcıların, cihazları için gereken uygun özelleştirmeleri ve yazdırma ayarlarını görüşmek üzere cihaz üreticisiyle iletişime geçmelerini öneririz.<ol><li>Yazdırmadan önce, atık tampon haznesini boşaltın ve temiz tampon haznesini gerektiği gibi temiz GSB ile doldurun. Cihazı açın ve entegre bir nem ve sıcaklık kontrol sistemine sahipse >10 dakika stabilize olmasına izin verin. Mikroarrayer'ı açın ve sistemi başlatın. NOT: Cihazın iç basıncını belirlemek için bir test yapılması önerilir. Basınç çok düşükse, yüksek basınçlı bir temizleme yapılması gerekebilir. Yine, belirli bir cihazın özel çalışmasını görüşmek için cihaz üreticisiyle iletişime geçin.</li>
		<li>Kalıntıları ve olası kirleticileri temizlemek için yazıcı kafasını ve kılcal damarları GSB ile birkaç kez temizleyin. Tek başına bir GSB plakası yükleyerek veya cihazı, yüklü bir plakadan numune aspirasyonunu atlayarak doğrudan temiz tampon haznesinden yazdıracak şekilde ayarlayarak bir test baskısı çalıştırması gerçekleştirin. NOT: Test baskısının bir nitroselüloz membran kullanılarak gerçekleştirilmesi gerekli değildir; Temiz mikroskop lamları yeterlidir ve spot boyutunun, şeklinin ve kalitesinin numune baskısından önce görsel olarak değerlendirilebilmesi avantajını sunar.</li>
		<li>Ekstrakte edilmiş glikan numunelerini yazdırırken, sistemi her numune arasında temiz GSB ile yıkanacak şekilde programlayın. NOT: Tipik olarak, yazdırılan nokta başına numune hacmi 100 pL ila 10 nL'dir ve seçilen numune hacmine bağlı olarak spot boyutu 20 μm ila 100 μm arasında değişir. Bir kaynak 384 oyuklu plakadan 100 mikrodizi yazdırmak, sistem yıkama dahil olmak üzere yaklaşık 40 dakika sürer. Ortaya çıkan mikrodiziler yaklaşık 1cm2 boyutunda olacaktır. Ek plakalar, dizinin uzunluğunu plaka başına yaklaşık 1 cm artıracaktır. Basılı mikrodizi tasarımının bir şeması Şekil 3'te gösterilmektedir. Mikrodiziler yazdırıldıktan sonra hemen kullanıma hazırdır ve birkaç yıl saklanabilir. Baskı sırasında numunelerin potansiyel buharlaşması nedeniyle herhangi bir nedenle baskı işinin tekrarlanması gerekirse, yeni bir numune plakasının yüklenmesi ve orijinal plakanın atılması önerilir.</li>
		<li>Haftada bir kez, yazıcı kafasını ve kılcal damarları iyice temizleyin. Bunu, GSB'de 1:20 oranında seyreltilmiş konsantre NaOH içeren 384 oyuklu bir madde yükleyerek yapın ve mikroskop slaytları üzerine 40 dakika ila 1 saat arasında bir baskı işlemi gerçekleştirin. Kullanıcılar, devam etmeden önce bu temizleme solüsyonunun cihazlarıyla uyumlu olduğundan emin olmalıdır.</li>
	</ol></li>
	<li>Yazdırılan mikrodizi için üretilen benzersiz ızgara dosyasını (.gal dosyası) aşağı akış analizi için hazır olarak kaydedin.</li>
</ol>6. Mikrodizi problama
<ol><li>Nitroselüloz membrandan tek, özdeş basılı mikrodizileri kesin ve bunları sondalama için uygun boyutta bir kaba yerleştirin (örneğin, 12 veya 24 oyuklu bir mikrotitre plakası) (bkz. Dizi, kabın tabanında düz durmalıdır. Prob başına bir mikrodizi gereklidir ve bir teknik kopyayı temsil eder.</li>
	<li>Spesifik olmayan bağlanmayı azaltmak için, mikrodizileri MP-TBST bloke edici tamponda (1x Tris tamponlu salin, pH 7.5, +% 0.1 [v / v] TWEEN 20 [TBST] ve %5 [a / h] yağsız süt tozu ile desteklenmiş 1 saat inkübe edin. Birimin tüm diziyi suya batırmak için yeterli olduğundan emin olun.</li>
	<li>İnkübasyonun ardından, MP-TBST'yi çıkarın ve yeni bir MP-TBST hacmi ile değiştirin.</li>
	<li>Dizileri monoklonal antikorlar (mAb'ler) veya His etiketli CBM'ler veya diğer GRMP'ler (örn., lektinler), 1:10-1:1,000 oranında seyreltilmiş (üretici tarafından belirtildiği gibi; Malzeme Tablosuna bakınız) MP-TBST'de 2 saat boyunca dönen/sallanan bir çalkalayıcı üzerinde.</li>
	<li>İnkübasyonun ardından, moleküler prob çözeltisini çıkarın ve dizileri temiz TBST ile kaplayarak dizilerin tamamen suya daldırıldığından emin olun. Artık prob çözeltisini çıkarmak için TBST'yi hemen çıkarın ve yeni bir hacimle değiştirin. Dizileri 5 dakika boyunca dönen/sallanan bir çalkalayıcıya yerleştirin. 5 dakika sonra TBST'yi çıkarın, yeni bir hacimle değiştirin ve 5 dakika boyunca dönen/sallanan bir çalkalayıcıya yerleştirin. NOT: Bu işlem, TBST'nin ilk eklenmesi ve hemen çıkarılması dahil olmak üzere üç kez tekrarlanmalıdır.</li>
	<li>Dizileri, sallanan/dönen bir çalkalayıcı üzerinde 2 saat boyunca MP-TBST'de 1:1.000 oranında seyreltilmiş alkalin-fosfataz konjuge ikincil antikorlarla (fare önleyici, sıçan önleyici, tavşan önleyici, anti-His; Malzeme Tablosuna bakınız) inkübe edin. NOT: Yaban turpu peroksidaz konjuge ikincil antikorları da uygundur, renk gelişimi için tetrametil benzidin (TMB) / hidrojen peroksit substratı ile birlikte kullanılır.</li>
	<li>İnkübasyondan sonra, spesifik olarak bağlanmamış ikincil antikorları çıkarmak için adım 6.5'e göre yıkama prosedürünü tekrarlayın.</li>
	<li>Antikor bağlanmasının kromojenik tespiti için dizileri nitro-mavi tetrazolyum (NBT) / 5-bromo-4-kloro-3-indolil-fosfat (BCIP) renk geliştirme solüsyonunda ( Malzeme Tablosuna bakınız) örtün. Antijen bağlanma bölgelerinde mor çökelti lekeleri oluşana kadar bırakın (tipik olarak 5-30 dakika, ancak reaksiyon hızlı bir şekilde gerçekleşebileceğinden aşırı doygunluğu önlemek için diziler yakından izlenmelidir). DİKKAT: BCIP cilt ile temasında zararlıdır ve solunum yolu tahrişine neden olabilir. KKD kullanın. Toz oluşumundan kaçının. Toz solumaktan kaçının.</li>
	<li>Reaksiyonu sonlandırmak için dizileri temiz musluk suyuna batırın ve iyice yıkayın.</li>
	<li>Dizileri kuruması için ortam sıcaklığında gece boyunca kurutma kağıdı arasına yerleştirin.</li>
	<li>Belirgin kusurları olan dizileri atın ve bu gibi durumlarda yoklama protokolünü tekrarlayın (Şekil 4).</li>
</ol>7. Analiz ve niceleme
<ol><li>Geliştirilen dizileri bir masaüstü tarayıcı kullanarak inç başına 2.400 nokta (dpi) çözünürlükte tarayın. Görüntüleri TIFF dosyalarına ve ardından negatiflere dönüştürün.</li>
	<li>Mikrodizi analiz yazılımını kullanarak (Malzeme Tablosuna bakın), her bir antijen bağlanma bölgesinde üretilen noktanın renk yoğunluğunu hesaplamak ve yerel arka planı çıkarmak için benzersiz .gal ızgara dosyasını her bir mikrodizi görüntüsünün üzerine yerleştirin.</li>
	<li>Izgara verilerini .txt dosyası olarak dışa aktarın. Bunlar daha sonra analiz için manuel olarak bir Excel sayfasına aktarılabilir.</li>
	<li>Önce her bir numune seyreltmesinde ve ardından dahil edilen herhangi bir biyolojik kopyada spot yoğunluğunun ortalamasını alarak her numune için ortalama bir spot sinyal yoğunluğu değeri oluşturun.</li>
	<li>En yüksek ortalama nokta sinyali yoğunluğuna 100 değeri atayın ve kalan verileri buna göre normalleştirin. NOT: Normalleştirilmiş ortalama nokta sinyal yoğunlukları daha sonra Excel33'teki koşullu biçimlendirme işlevi kullanılarak veya R ggplot2 paketi40,41'deki geom_tile işlevi kullanılarak bağıl glikan epitop bolluğunun bir ısı haritası olarak sunulabilir.</li>
</ol>

Mikroarray Polimer Profilleme Kullanılarak Glikan Yapısının ve Oluşumunun Açıklanması

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmezler.

Burada açıklanan MAPP tekniği artık glikan analizi için iyi kurulmuş bir yöntemdir. Temel ilkeler ilk olarak 2007'detanımlanmıştır 11, ancak teknik, mikroarray teknolojisindeki en son yeniliklerden, moleküler prob geliştirmeden ve glikan biyokimyası anlayışımızdaki ilerlemelerden yararlanmak için sürekli bir gelişim sürecinden geçmiştir. Genel olarak, glikanlar, özellikle polisakkaritler, yapısal karmaşıklıkları ve heterojenlikleri45 ve ayrıca kolayca dizilenememeleri veya sentezlenememeleri nedeniyle proteinlerden ve nükleotidlerden daha zordur1. Çoğu durumda, tek bir teknik glikan karmaşıklığını kesin olarak deşifre edemez; bu nedenle, MAPP genellikle diğer yöntemlerle birlikte kullanılır. AIR, diğer glikan analiz yöntemlerininçoğuyla 34 uyumlu olduğundan, veri kümelerinin daha sonra karşılaştırılmasını kolaylaştırdığından, AIR hazırlığının genellikle MAPP için bir başlangıç noktası olarak seçilmesinin nedenlerinden biri de budur.
AIR hazırlığından önce numunenin homojenleştirilmesi nedeniyle, bazı uzamsal bilgiler her zaman kaybolur. Bununla birlikte, polisakkaritler numunelerden sırayla salındığından, elde edilen fraksiyonlarda epitopların varlığı, o numunenin moleküler mimarisi ve bileşimi hakkında bilgi sağlar17. Bu nedenle, uygun bir ekstraksiyon rejiminin seçilmesi, yöntemin başarısı için kritik öneme sahiptir. Ekstraksiyon yönteminin uygunluğunu birden fazla parametre belirler: hücresel yapı, zaman, sıcaklık, pH, basınç, çözücünün iyonik kuvveti ve katı partikül numunesinin inceliği49. Kurucu glikanları başarılı bir şekilde ekstrakte etme ve numunenin temsili bir bileşim resmini oluşturma olasılığını en üst düzeye çıkarmak için giderek daha agresif çözücülerin kullanılması önerilir. Çoğu numune için, CDTA, NaOH ve selülaz, bitki kaynaklı depolama ve hücre duvarı polisakkaritlerini uzaklaştırmak için yeterlidir 33,50,51,52. Bazı doku örnekleri için,CaCl2, HCl ve Na2CO3'ü de içeren bir hibrit ekstraksiyonrejiminin başarılı olduğu gösterilmiştir53, deniz mikroalg örnekleri ise etilendiamintetraasetik asit (EDTA) eklenmesini gerektirebilir10.
Mikrodiziler, pozitif kontroller olarak kullanılacak bir dizi saf, tanımlanmış glikan standardı içermelidir5. Dahil edilen standartlar, numunenin niteliğine göre değiştirilmelidir. Yazdırıldıktan sonra uygun GRMP'lerin seçilmesi gerekir. Hibridoma mAb'lerinin polisakkarit yapılara dönüşmesi zordur54; Glikan bağlayıcı antikorların yükseltilmesi zordur ve düşük afiniteye sahip olabilir55. Neyse ki, CBM'ler için gen dizisi bilgisi, rekombinant ekspresyon4 ve bağlanma özgüllüklerinin mühendisliği için göreceli kolaylıkla elde edilebilir56,57. Etkileyici bir GRMP kataloğu geliştirilmiş olsa da, çoğu artık ticari kaynaklardan elde edilebilirken, doğada var olan glikan yapılarının çeşitliliğine göre, sadece küçük bir kısmı üretilmiş ve başarılı bir şekilde karakterize edilmiştir58. Bu, belirli yapıları algılama ve ayırt etme yeteneğini sınırlayabilir. Bağlanma özgüllüğünün iyi karakterize edildiği, mevcut olması beklenen her bir ana glikan yapısını temsil eden bir veya iki prob kullanılarak bir ilk sondalama deneyi yapılması tavsiye edilir. Sonraki sondalama deneylerinde, prob listesi daha geniş bir glikan yelpazesini kapsayacak ve ince yapılara daha derine inecek şekilde genişletilebilir.
Sıradan olmasına rağmen, her inkübasyon adımından sonra mikrodizilerin iyice yıkanmasını sağlamak, problama prosedürünün başarısı için esastır. Spesifik olarak bağlı olmayan probların etkisiz bir şekilde çıkarılması, renk gelişimini takiben yüksek bir arka plan sinyaline neden olarak sonucu gizleyebilir. Bu durumda, yeni bir mikrodizi ile başlayarak sondalama prosedürünü tekrarlamak gerekir. Ayrıca, dizilere az miktarda ve sadece kenarları forseps ile tutularak dokunulmalıdır; Nitroselüloz membran kırılgandır ve kolayca zarar görebilir. Renk geliştirme çözümü, çatlaklarda ve kırışıklıklarda toplanarak aşırı doygunluğa neden olur ve bu da dizi analizini engeller.
MAPP hızlı, uyarlanabilir ve kullanışlıdır. Bu yöntem, herhangi bir biyolojik veya endüstriyel sistemden türetilen hayvansal, mikrobiyal veya bitki glikanları ile uyumludur, ekstrakte edilebildikleri ve nitroselüloz üzerinde hareketsiz hale getirilebildikleri ve uygun moleküler problara sahip oldukları sürece. Üretilen veriler, diğer glikan analiz yöntemleriyle kolayca elde edilemeyen ayrıntılı, yarı kantitatif, bileşimsel içgörü sağlar.

Glikanlar yaşamın her alanında her yerde bulunur ve diğer makromoleküllere kıyasla yapı ve işlev açısından benzersiz bir çeşitlilik sergiler1. Bununla birlikte, karmaşıklıkları, biyosentez ve glikozidik bağlardaki değişkenlikleri ve glikan yapılarını incelemek için uygun yöntemlerin azlığı nedeniyle, yapılardaki ve işlevlerdeki bu çeşitliliğe ilişkin anlayışımız nispeten sınırlıdır2.
Birçok glikan analiz tekniği yıkıcıdır ve glikanların, ilgili üç boyutlu ve biyolojik bağlamları gizleyebilen kurucu monosakkaritlerine parçalanmasını gerektirir3. Tersine, topluca glikan tanıyan moleküler problar (GRMP'ler) olarak bilinen monoklonal antikorlar (mAb'ler), karbonhidrat bağlama modülleri (CBM'ler), lektinler, viral aglütininler ve mikrobiyal adezinler4, spesifik epitopları tanır ve bunlara bağlanır ve karmaşık çoklu glikan matrisleri içindeki glikanları tespit etmek ve ayırt etmek için araçlar olarak kullanılabilir 5,6.
Burada, geniş bir biyolojik numune yelpazesine uygulanabilen glikan analizi için hızlı, çok yönlü ve tahribatsız bir yöntem olan mikrodizi polimer profilleme (MAPP) sunuyoruz. Yöntem, çeşitli biyolojik ve endüstriyel/ticari sistemlerden glikanları analiz etmek için sağlam ve yüksek verimli bir teknoloji sağlamayı amaçlamaktadır. MAPP, binlerce moleküler etkileşimin paralel olarak profillenmesine izin vermek için glikanla yönlendirilmiş moleküler probların tanıma özgüllüğünü tekrarlanabilir, yüksek performanslı mikrodizi tarama teknolojisi ile birleştirir. Bu yaklaşımın çıktısı, ilgilenilen bir numune veya doku içindeki glikanların bileşimi ve nispi bolluğu hakkında tanısal içgörüdür.
MAPP, bağımsız, bağımsız bir yöntem olarak veya immünofloresan mikroskobu 7,8,9 ve monosakkarit veya bağlantı analizi10,11 gibi diğer biyokimyasal tekniklerle birlikte kullanılabilir. Bu teknik ayrıca, saf ve yapısal olarak iyi tanımlanmış oligosakkarit standartları12 ile basılmış dizileri kullanarak, yeni GRMP'lerin epitop özgüllüklerini haritalamak için de kullanılabilir. MAPP'nin enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) gibi diğer yöntemlere göre önemli bir avantajı, küçük numune hacimleri13,14 ile uyumluluğudur. Ayrıca, MAPP önemli ölçüde daha yüksek verimli analiz15 sunar ve basılı numuneler nitroselüloz16 üzerine hareketsiz hale getirildiğinde kuru ve stabil olduğundan etkili bir numune koruma şekli sağlar.
GRMP'lerin bağlanması genellikle, belirli bir polisakkarit sınıfına (ksilan, mannan, ksiloglukan, vb.) özgü bir bağlanma bölgesi (epitop) oluşturan bir dizi bitişik şeker kalıntısının varlığına bağlıdır. 17. Buna karşılık, çoğu biyokimyasal teknik, örneğin monosakkarit bileşimi veya metilasyon analizi kullanılarak ölçülen bireysel şeker kalıntıları (ksiloz, mannoz, glikoz), çoklu polisakkarit sınıflarının bileşenleri olabilir ve bu nedenle atanması zorolabilir 18.
MAPP, bir teknoloji boşluğuna, yani az miktarda malzeme kullanarak çeşitli kaynaklardan birden fazla glikanı hızlı bir şekilde analiz etme yeteneğine yanıt olarak geliştirilmiştir. MAPP, son otuz yılda geliştirilen ve karakterize edilen GRMP'lerin kapsamlı repertuarından yararlanır: 12,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32. MAPP'nin geliştirilmesi, tekniğin sürekli olarak iyileştirilmesi ve optimize edilmesiyle yinelemeli bir süreç olmuştur. Şu anda MAPP'nin glikanların merkezi rol oynadığı çeşitli doğal ve endüstriyel sistemlere uygulanmasını açıklayan önemli bir literatür var 5,6,9,10,21,33,34,35,36,37,38,39. Burada, MAPP için mevcut son teknolojiyi açıklıyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,3:1,4-&#946;-D-Glucan, Lichenan (icelandic moss)</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>P-LICHN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,4-&#946;-D-Mannan</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>P-MANCB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well microtiter plate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>M1686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP)</td>
			<td>Melford</td>
			<td>B74100-1.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>270725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline Phosphatase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-055-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline Phosphatase AffiniPure Goat Anti-Rat IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>112-055-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline Phosphatase AffiniPure Rabbit Anti-His Tag</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>300-055-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arabinoxylan (wheat)</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>P-WAXYL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Array-Pro Analyzer Software</td>
			<td>Media Cybernetics</td>
			<td>Version 6.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacillus sp. Cellulase 5A (BCel5A)</td>
			<td>NZYTech</td>
			<td>CZ0564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BAM antibodies</td>
			<td>SeaProbes</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black drawing ink (indian ink)</td>
			<td>Winsor &#38; Newton</td>
			<td>GWD030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbohydrate binding modules</td>
			<td>NZYTech</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCRC antibodies</td>
			<td>CarboSource</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>319945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PHR1552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1.11727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galactan (potato)</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>P-GALPOT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galactomannan (carob)</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>P-GALML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>49781-5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gum tragacanth (legumes)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>INCh antibodies</td>
			<td>INRA</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LM and JIM antibodies</td>
			<td>PlantProbes</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marathon Argus Microarray Printer</td>
			<td>ArrayJet</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibodies</td>
			<td>Biosupplies Australia</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaBH4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>452882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitro-blue tetrazolium (NBT)</td>
			<td>Melford</td>
			<td>N66000-1.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membrane</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pectin (degree of methyl esterification 46%)</td>
			<td>Danisco</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProClin 200</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>48171-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhamnogalacturonan (soybean pectic fibre)</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>P-RHAGN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotating mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>88-861-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotating/rocking Shaker</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skimmed milk powder</td>
			<td>Marvel</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin filter</td>
			<td>Costar Spin-X</td>
			<td>8160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel beads</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69989</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TissueLyser II</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>85300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylan (beechwood)</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>P-XYLNBE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xyloglucan (tamarind)</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>P-XYGLN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Glucan (oat)</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>P-BGOM</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microarray polymer profiling (mapp) for high-throughput glycan analysis

Mikrodizi polimer profilleme (MAPP), bitki ve alg dokuları, gıda malzemeleri ve insan, hayvan ve mikrobiyal numuneler dahil olmak üzere çeşitli biyolojik numunelerdeki glikanların ve glikokonjugatların bileşimini ve nispi bolluğunu sistematik olarak belirlemek için sağlam ve tekrarlanabilir bir yaklaşımdır. Mikroarray teknolojisi, minyatürleştirilmiş, yüksek verimli bir tarama platformu sağlayarak, glikanlar ve yüksek oranda spesifik glikana yönelik moleküler problar arasındaki binlerce etkileşimin, yalnızca az miktarda analit kullanılarak eşzamanlı olarak karakterize edilmesine izin vererek bu yöntemin etkinliğini destekler. Bileşen glikanlar, numuneden sırayla ekstrakte edilmeden ve doğrudan nitroselüloz membranlar üzerine hareketsiz hale getirilmeden önce kimyasal ve enzimatik olarak fraksiyone edilir. Glikan bileşimi, spesifik glikan tanıyan moleküler probların gasp edilmiş ve basılmış moleküllere bağlanmasıyla belirlenir. MAPP, monosakkarit ve bağlantı analizi ve kütle spektrometrisi gibi geleneksel glikan analiz tekniklerini tamamlayıcı niteliktedir. Bununla birlikte, glikan tanıyan moleküler problar, biyolojik etkileşimlerin ve fonksiyonel rollerin aydınlatılmasına yardımcı olabilecek glikanların yapısal konfigürasyonları hakkında fikir verir.

Glycans are ubiquitous in all domains of life and exhibit unparalleled diversity in structure and function compared to other macromolecules1. However, due to their complexity, variability in biosynthesis and glycosidic linkages, and the paucity of appropriate methods for dissecting glycan structures, our understanding of this diversity in structures and functions is relatively limited2.
Many glycan analysis techniques are destructive and necessitate the breakdown of glycans into their constituent monosaccharides, which can obscure relevant three-dimensional and biological contexts3. Conversely, monoclonal antibodies (mAbs), carbohydrate binding modules (CBMs), lectins, viral agglutinins, and microbial adhesins, known collectively as glycan-recognizing molecular probes (GRMPs)4, recognize and bind to specific epitopes and can be used as tools to detect and discriminate between glycans within complex multi-glycan matrices5,6.
Here, we present microarray polymer profiling (MAPP), a rapid, versatile, and nondestructive method for glycan analysis that is applicable to a broad spectrum of biological samples. The method aims to provide a robust and high-throughput technology for analyzing glycans from diverse biological and industrial/commercial systems. MAPP unites the recognition specificity of glycan-directed molecular probes with reproducible, high-performance microarray screening technology to allow thousands of molecular interactions to be profiled in parallel. The output of this approach is diagnostic insight into the composition and relative abundance of glycans within a sample or tissue of interest.
MAPP can be used as an independent, stand-alone method, or in conjunction with other biochemical techniques, such as immunofluorescence microscopy7,8,9 and monosaccharide or linkage analysis10,11. The technique can also be used to map epitope specificities of novel GRMPs, using arrays printed with pure and structurally well-defined oligosaccharide standards12. A major advantage of MAPP over other methods, such as enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), is its compatibility with small sample volumes13,14. Moreover, MAPP offers significantly higher-throughput analysis15 and provides an effective form of sample preservation, as printed samples are dry and stable when immobilized onto nitrocellulose16.
The binding of GRMPs is generally dependent on the presence of a number of contiguous sugar residues that collectively form a binding site (epitope) that is unique to a particular polysaccharide class (xylan, mannan, xyloglucan, etc.)17. In contrast, the individual sugar residues (xylose, mannose, glucose) that are quantified using most biochemical techniques, for example monosaccharide composition or methylation analysis, can be components of multiple polysaccharide classes and thus difficult to assign18.
MAPP has been developed in response to a technology gap, namely the ability to rapidly analyze multiple glycans from a variety of sources using small amounts of material. MAPP capitalizes on the extensive repertoire of GRMPs that have been developed and characterized over the last three decades12,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32. The development of MAPP has been an iterative process, with the technique being steadily refined and optimized. There is now a substantial body of literature describing the application of MAPP to various natural and industrial systems where glycans play central roles 5,6,9,10,21,33,34,35,36,37,38,39. Here, we describe the current state of the art for MAPP.

Yazar Spotlight: MAPP Protokolü – Glikan Analizini Geliştirme 

Yüksek Verimli Glikan Analizi için Mikroarray Polimer Profilleme (MAPP)

Our research focuses on the occurrence functions and structures of complex glycans within diverse domestic, industrial, and commercial systems. Further refinements to non-contact microarray technology and our ability to rapidly access sequence information for carbohydrate binding modules is increasing our capacity to both print and interrogate glycan microarrays. Glycans are challenging to study due to their structural heterogeneity, complexity, and variability in biosynthesis.Many glycan analysis methods necessitate the breakdown of glycans into their constituent monosaccharides. MAPP offers a versatile glycan analysis platform which retains a lot of the important structural 3D information.

MAPP, birkaç kuzey Tayland çeşidinden mango kabukları, Coffea arabica kiraz posası ve kahve çekirdeği işleme atıkları ve Tayland siyah sarımsağı, Allium sativum var. ophioscorodon'dan kök, gövde ve yaprak dokusundan oluşan tarımsal biyokütle atığının glikan bileşimini belirlemek için uygulandı. Gıda endüstrisinde fonksiyonel bileşenler olarak çeşitli bitki kaynaklı polisakkaritler kullanılmaktadır42,43. Bu nedenle, bu deneyin amacı, bu bol ve şu anda az kullanılan tarımsal-endüstriyel atık malzemelerin katma değerli saf polisakkaritler için bir kaynak sağlayıp sağlayamayacağını çıkarmaktı.
AIR malzemesi, glikan analizine yönelik numuneleri hazırlamak için rutin olarak kullanılır44. AIR kullanmanın çeşitli avantajları vardır; çözücülerle muamele, endojen CAZyme'leri, metabolitleri, küçük sakkaritleri, lipitleri ve pigmentleri etkili bir şekilde uzaklaştırır, bu da polisakkaritler ve yapısal proteinlerle zenginleştirilmiş numunelerle sonuçlanır34. Ayrıca, AIR üretmek, ısıya dayanıklı olduğu ve birkaç yıl saklanabildiği için numune ömrünü uzatmanın hızlı ve etkili bir yoludur.
Kurucu glikanların üç karışık fraksiyonu, CDTA, NaOH ve selülaz kullanılarak bitki AIR materyalinden sırayla ekstrakte edildi. CDTA, Ca2+ çapraz bağlı de-esterifiye pektinlerin bitki hücre duvarlarından çıkarılmasına izin veren Ca2+ iyonlarını şelatlar45. Alkali koşullar, hidrojen bağının bozulması ve selüloz mikrofibrilleri ile hemiselüloz arasındaki ester bağlarının sabunlaşması ve lignin ve hemiselüloz arasındaki sabunlaşması nedeniyle mannan, ksilan ve β-glukan gibi ağırlıklı olarak hemiselülozların salınmasına izin verir46. Bacillus spp.'den rekombinant bir endo-1,4-β-glukanaz, yapısal selüloz mikrofibrillerinin amorf bölgelerini parçalamak için kullanıldı ve hücre duvarları içinde selüloza bağlı kalıntı glikanları serbest bıraktı47. Bu yöntem, glikanları etkili bir şekilde bu üç geniş gruba ayırsa da, numunelerin saf olmadığına dikkat edilmelidir; ekstraksiyon yönteminin doğası gereği, numunede mevcutsa, hemiselüloz kaçınılmaz olarak ekstrakte edilecek ve daha sonra CDTA ve selülaz fraksiyonlarında değişen derecelerde tespit edilecektir. Benzer şekilde, numunede mevcutsa, NaOH ekstraksiyonunda bir miktar pektin tespit edilecektir.
Ekstrakte edilmiş glikan fraksiyonlarını kovalent olmayan bağlantı11 yoluyla nitroselüloz üzerine hareketsiz hale getirmek için temassız, piezoelektrik bir mikrodizi baskı robotu kullanıldı ve 300 özdeş mikrodizi oluşturuldu. Tanımlanmış glikan standartları (Tablo 1) de basılı mikrodizilere pozitif kontroller olarak dahil edildi (Şekil 5). Seçilen glikan standartları için elde edilen MAPP bağlanma profili, daha önce bildirilen epitop özgüllüklerine karşılık gelir. Örneğin, LM21 çoklu mannan polisakkaritlere (galaktomannan ve glukomannan) güçlü bağlanma sergilerken, LM22 galaktomannan25'e sadece zayıf bağlanma sergiledi. Benzer şekilde, LM19 tercihen esterden arındırılmış homogalakturonan48'e ve LM15 demirhindi tohumu ksiloglucan23'e bağlıdır.
Selülozik olmayan bitki hücre duvarı polisakkaritlerinin teşhisi olan 16 epitopun nispi bolluğu, glikana yönelik monoklonal antikorların (Tablo 2) basılı ekstraktlara bağlanmasıyla tespit edildi (Şekil 6). Ekstrakte edilen glikanların çoğunluğu alkalin NaOH fraksiyonu içinde tespit edildi. Test edilen tüm mango çeşitlerinin kabuklarında ksilan / arabinoksilanı temsil eden mAbs LM10 ve LM11 için güçlü bağlanma sinyalleri kaydedildi. Sarımsak örnekleri içinde, LM10 ve LM11 tercihen kök dokusu ekstraktına (Sarımsak R) bağlandı ve yaprak dokusu ekstraktına (Sarımsak L) sadece zayıf bağlanma sergiledi. Kısmen metil-esterlenmiş veya esterleştirilmemiş homogalakturonanı temsil eden LM19, bazı mango çeşidi ekstraktlarına (Aokrong ve Talabnak) güçlü bir şekilde bağlanmış, ancak diğer çeşitlerde (Chokanan, Mamkamdang, Mahachanok ve Nga) sadece zayıf bağlanmıştır veya bağlanması tespit edilememiştir. Ek olarak, LM19 sadece kahve hamuru fraksiyonlarına bağlandı ve daha önce yarı saflaştırılmış kahve pektininden oluştuğu düşünülen kahve çekirdeği işleme atık malzemesine bağlanmadı (yayınlanmamış veriler).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65443/65443fig01.jpg"> Şekil 1: MAPP yöntemindeki başlıca deneysel adımlar. (A) Numuneler ince tozlar oluşturmak üzere homojenize edilir. (B) Homojenize edilmiş numuneler, AIR'lerini izole etmek için işlenir. (C) Kurucu glikanlar, özel bir ekstraksiyon rejimi kullanılarak sırayla ekstrakte edilir. (D) Ekstrakte edilen glikan fraksiyonları, mürekkep ve GSB, nitroselüloz üzerine baskı için plaka düzenine göre 384 oyuklu plakalara aktarılır. (E) Basılı mikrodiziler, seçilen GRMP'lerle incelenir. (F) Basılı glikan fraksiyonlarına GRMP bağlanması, veriler bir ısı haritası olarak sunulmadan önce ölçülür ve analiz edilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65443/65443fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65443/65443fig02.jpg"> Şekil 2: Ekstrakte edilen glikan numunesi/standardı başına dört seyreltme ile numune, mürekkep ve GSB yüklemesi için 384 oyuklu bir plaka düzeni örneği. Farklı renkler, farklı ekstraksiyon reaktiflerinden kaynaklanan numuneleri belirtirken, farklı tonlar seri seyreltmeleri temsil eder. Koddaki ilk sayı numune numarasını temsil ederken, bitiş numarası seyreltme numarasını temsil eder (D1 seyreltme bir, D2 seyreltme iki vb. anlamına gelir). Örneğin, iyi etiketlenmiş bir '12D3', glikan numunesi 12, seyreltme üç'ü temsil eder. Kuyu plakaları, altı sütun ve sekiz sıradan oluşan sekiz özdeş bölüme ayrılmalıdır. İlk kalıbın ilk bölümü yalnızca mürekkep ve tampon içermeli ve örnek kalıp düzenine benzemelidir. Ekstrakte edilen glikan numuneleri daha sonra plaka düzenine göre sonraki plaka bölümlerine yüklenebilir. Aynı plaka bölümüne farklı ekstraksiyon reaktifleri yüklenmemelidir. Bir bölümün tamamını doldurmak için yeterli numune yoksa, o bölümdeki kalan tüm kuyucukları tamponla doldurun; Boş kuyu bırakmayın. Birden fazla kalıp gerekiyorsa, tüm numuneler yüklendikten sonraki bölüm üç alternatif mürekkep sütunu içermelidir ve GSB - bu, yazdırılan numune sayısına bağlı olarak sekizinci bölüm olmayabilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65443/65443fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65443/65443fig03.jpg"> Şekil 3: Basılı mikrodizi tasarımının şematik gösterimi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65443/65443fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65443/65443fig04.jpg"> Şekil 4: Temsili mikrodiziler. (A) Bağlayıcı değil. (B) Bağlama sinyali, yüksek arka plan sinyali tarafından engellenir. (C) NBT / BIP ile aşırı doygunluk nedeniyle genelleştirilmiş mavi / mor boyama. (D) Yüksek substrat konsantrasyonu nedeniyle kusurlu problama. (E) Temiz olmayan yazıcı kafası nedeniyle hatalı baskı. (F) Birkaç numuneye güçlü bağlanma. (G) Birçok numuneye güçlü bağlanma. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65443/65443fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65443/65443fig05.jpg"> Şekil 5: Tanımlanmış glikan standartlarına monoklonal antikor bağlanması, baskı ve sondalama işlemini doğrulamak için dahil edilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65443/65443fig05large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65443/65443fig06.jpg"> Şekil 6: Tarımsal biyokütle atıklarından ekstrakte edilen glikanların MAPP'si. Örnekler arasında kahve posası atıkları (kahve posası ve kahve pektini), çeşitli Tayland çeşitlerinden mango kabukları (AO, Aokrong; KO, Kam; RD, Rad; CH, Chokanan; MA, Mamkamdang; TL, Talabnak; MH, Mahachanok; CDTA, NaOH ve selülaz (Bacillus spp. selülaz 5A) kullanılarak NG, Nga) ve siyah sarımsak yaprakları (Sarımsak L), gövde (Sarımsak S), ampul (Sarımsak BG) ve kökler (Sarımsak R). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65443/65443fig06large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Tablo 1: MAPP analizinde pozitif kontroller olarak kullanılan tanımlanmış ticari polisakkarit standartları. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65443/65443_Table%201.xlsx" target="_blank">Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Tablo 2: Ekstrakte edilmiş bitki glikan mikrodizilerinin sorgulanması için seçilen glikana yönelik monoklonal antikorlar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65443/65443_Table%202.xlsx" target="_blank">Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about MAPP Protocol – Advancing Glycan Analysis at JoVE.com

Mikroarray polimer profilleme (MAPP), biyolojik numunelerdeki glikanların bileşimsel analizi için yüksek verimli bir tekniktir.

Microarray polymer profiling (MAPP) is a robust and reproducible approach to systematically determine the composition and relative abundance of glycans ...

Araştırmamız, çeşitli evsel, endüstriyel ve ticari sistemlerde kompleks glikanların oluşum işlevlerine ve yapılarına odaklanmaktadır. Temassız mikroarray teknolojisinde daha fazla iyileştirme ve karbonhidrat bağlama modülleri için sekans bilgilerine hızlı bir şekilde erişme yeteneğimiz, glikan mikrodizilerini hem yazdırma hem de sorgulama kapasitemizi artırıyor. Glikanlar, yapısal heterojenlikleri, karmaşıklıkları ve biyosentezdeki değişkenlikleri nedeniyle incelenmesi zordur.Birçok glikan analiz yöntemi, glikanların kurucu monosakkaritlerine parçalanmasını gerektirir. MAPP, birçok önemli yapısal 3D bilgiyi tutan çok yönlü bir glikan analiz platformu sunar.

microarray-polymer-profiling-mapp-for-high-throughput-glycan-analysis

Research

JoVE Journal

Biology

Microarray Polymer Profiling (MAPP) for High-Throughput Glycan Analysis

1.0K Görüntüleme.  Newcastle University. Araştırmamız, çeşitli evsel, endüstriyel ve ticari sistemlerde kompleks glikanların oluşum işlevlerine ve yapılarına odaklanmaktadır. Temassız mikroarray teknolojisinde daha fazla iyileştirme ve karbonhidrat bağlama modülleri için sekans bilgilerine hızlı bir şekilde erişme yeteneğimiz, glikan mikrodizilerini hem yazdırma hem de sorgulama kapasitemizi artırıyor. Glikanlar, yapısal heterojenlikleri, karmaşıklıkları ve biyosentezdeki değişkenlikleri nedeniyle inc...

Video: Yazar Spotlight: MAPP Protokolü – Glikan Analizini Geliştirme 

Microarray polymer profiling (MAPP) is a robust and reproducible approach to systematically determine the composition and relative abundance of glycans and glycoconjugates within a variety of biological samples, including plant and algal tissues, food materials, and human, animal, and microbial samples. Microarray technology underpins the efficacy of this method by providing a miniaturized, high-throughput screening platform, allowing thousands of interactions between glycans and highly specific glycan-directed molecular probes to be characterized concomitantly, using only small amounts of analytes. Constituent glycans are chemically and enzymatically fractionated, before being sequentially extracted from the sample and directly immobilized onto nitrocellulose membranes. The glycan composition is determined by the attachment of specific glycan-recognizing molecular probes to the extorted and printed molecules. MAPP is complementary to conventional glycan analysis techniques, such as monosaccharide and linkage analysis and mass spectrometry. However, glycan-recognizing molecular probes provide insight into the structural configurations of glycans, which can aid in elucidating biological interactions and functional roles.

Microarray polymer profiling (MAPP) is a high-throughput technique for compositional analysis of glycans in biological samples.

Biyoloji

Extraction of Glycan from Alcohol Insoluble Residue

To begin, use a mechanical TissueLyser to shake previously prepared AIR CDTA mixture at 27 hertz for two minutes, followed by 10 hertz for two hours. Next, centrifuge the mixture at 10, 000 G for 10 minutes at four degree Celsius. Transfer the supernatant to a sterile micro centrifuge tube.Finally, add sodium hydroxide and sodium borohydride mixture to the residual pellet. After shaking and centrifuging the pellet, wash the residual pellet two to three times with distilled water. Add 30 microliters per milligram of cellulase to the pellet, then incubate the tubes in a heat block at the enzyme's optimal temperature for 16 hours.Centrifuge the samples and store the supernatant on a rotary shaker. Centrifuge all stored extracts again at 10, 000 G for 10 minutes at four degrees Celsius.

Alkolde Çözünmeyen Kalıntıdan Glikan Ekstraksiyonu

Microarray Printing for Glycan Analysis

Begin by preparing a 1 to 20 dilution of black Indian ink and glycerol system buffer, then centrifuge for 10 minutes at 15, 000g at room temperature. Add 40 microliters of ink solution and glycerol system buffer to the first section of the 384 well plate. Now add 25 microliters of glycerol system buffer to all dilution one wells and 40 microliters to all dilution two, three, and four wells.Add 25 microliters of extracted glycan sample to the dilution one wells to dilute the samples in a one-to-one ratio. Serially dilute each sample four times by transferring 10 microliters from the dilution one to the dilution two well, then gently mix using a pipette. Repeat the process by transferring 10 microliters of the sample from the dilution two to the dilution three well.After repeating the process for the dilution four well, discard 10 microliters from it so that all wells have a final volume of 40 microliters. Add 40 microliters of ink solution and glycerol system buffer to the final plate. Then cover the plate with an adhesive cover before centrifuging it for 10 minutes at 3000g at room temperature.To print the samples on the nitrocellulose membrane, start by purging the print head and capillaries multiple times with glycerol system buffer. Initiate a test print run by loading a plate with the buffer alone. To configure the instrument to print directly from the clean buffer reservoir, click on File, followed by New, then choose Print Run.Choose the microplate type and change the slide settings accordingly. Next, change the mini array settings before editing the spot property settings. Click on the Overview tab to view the plate.Finally, under the Options tab, select Using buffer and calculate printing time before allocating file locations to save the file. After saving the location, press on Start Print Run to proceed with the run. While printing extracted glycan samples, program the system as before.Under the Options tab, click on Using source microplates. Finally, save the unique grid file generated for the printed microarray for downstream analysis. Defined glycan standards were also included in the printed microarrays as positive controls.The map binding profile obtained for the selected glycan standards corresponds to previously reported epitope specificities.

Glikan Analizi için Mikroarray Baskı

Microarray Probing for Glycan Recognition

Begin by cutting out identical printed microarrays from the nitrocellulose membrane and placing them in a suitable vessel for probing. To reduce non-specific binding, add MP-TBST blocking buffer to the microarrays and incubate for one hour on a rotating shaker. After incubation, replace the buffer with fresh MP-TBST.Incubate the arrays with monoclonal antibodies and MP-TBST for two hours on a rotating shaker. After incubation, remove the molecular probe solution. Submerge the arrays fully in clean TBST.Immediately replace the buffer with a fresh volume to remove the residual probe solution. Place the arrays on a rotating shaker for five minutes. Replace the TBST with a fresh buffer volume and place the arrays on the shaker for another five minutes.Next, incubate the arrays with alkaline phosphatase conjugated antibodies for two hours on a rotating shaker. Once incubation is complete and the microarrays have been washed, cover them in nitro blue tetrazolium, and BCIP color development solution to chromogenically detect the antibody binding. Terminate the reaction by immersing the array in clean tap water.Then place the arrays to dry between blotting paper overnight at ambient temperature. The relative abundance of 16 epitopes diagnostic of non-cellulosic plant cell wall polysaccharides were detected by attaching glycan-directed monoclonal antibodies to printed extracts. Most of the extracted glycans were detected within the alkaline sodium hydroxide fraction.Strong binding signals were recorded for LM-10 and LM-11 representing xylan and arabinoxylan within the peels of all the mango varieties tested. LM-10 and LM-11 displayed preferential binding to the garlic root tissue extract, and weak binding to the leaf tissue extract. LM-19 representing partially methylesterified or unesterified homogalacturonan bound strongly to some mango variety extracts and only to the coffee pulp fractions.