Yazarlar ifşa gerek yok.

1. büyüme orta hazırlama Not: en az orta M63 kimyasal bileşimi gibidir: 62 mM K 2 HPO 4, 39 mM KH 2 PO 4, 15 mM (NH 4) 2 SO 4, 1.8 µM FeSO 4, 15 µM tiamin-HCl, 0.2 mM MgSO 4 ve 22 mM glikoz. M63 üç hisse senedi çözümleri karıştırılarak yapılır: beş X çözüm, % 20 glikoz ve MgSO 4 tiamin çözüm. Saat 4'te tüm çözümler depolamak ° C.
<ol><li><ol><li>5 X çözüm FeSO 4 çözüm, hazırlamak için hazırlanıyor bir elektrik pipet ve tek kullanımlık serolojik pipet GKD 2 O 50 mL santrifüj tüpü eklemek için kullanın. Bir P-200 0,06 mL HCl 0.01 M HCl. ekleyin 36 mg FeSO 4-7 H 2 O elde edilir ve iyice karıştırın eklemek için kullanın.</li>
		<li>160 mL GKD 2 O ölçüm silindir ölçmek ve 500 mL kabı için ekleyin. Bu sırada aşağıdakileri ekleyin: 10,72 g K 2 HPO 4, 5,24 g KH 2 PO 4, 2.0 g (NH 4) 2 SO 4 ve 0.5 mL (1.1.1. adımda hazırlanan) FeSO 4 çözüm.</li>
		<li>Hassas pH metre, kullanarak, 7.0 pH 2 M KOH ekleyerek ayarlayın. GKD 2 O toplam hacmi 200 mL için eklemek ve bir ölçüm silindir çözüm dökün. 250 mL filtrasyon ünitesi (PVDF, 0,22 µM) kullanarak çözüm sterilize.</li>
	</ol></li> <li>% 20 glikoz çözüm hazırlama <ol><li>200 mL GKD 2 O ölçüm silindir ölçüp 500 mL kabı dök. Manyetik karıştırıcı kullanarak karıştırma sırasında 50 gr şekeri ekleyin. Bir ölçüm silindir 250 mL toplam hacmiyle çözümde sulandırmak. 1.1.3. adımda açıklandığı gibi çözüm sterilize.</li>
	</ol></li> <li>MgSO 4 tiamin çözüm hazırlama <ol><li>150 mL GKD 2 O 500 mL kabı için ekleyin. Manyetik karıştırıcı ile karıştırma sırasında 1.0 g tiamin-HCL ve MgSO 4-7 H 2 O. Dilute çözüm 10 g toplam hacmi 200 mL için bir ölçüm silindir ekleyin. 1.1.3. adımda açıklandığı gibi çözüm sterilize.</li>
	</ol></li> <li>En az orta M63 hazırlama <ol><li>5 X çözüm, % 20 glikoz çözüm, MgSO 4 tiamin çözüm, elektronik bir pipet, P-200 pipet ve 200-µL pipet ipuçları temiz bir bankta yerleştirin.</li>
		<li>Ölçmek 155.8 mL GKD 2 O ölçüm bir silindir ve 500 mL kabı dökün.</li>
		<li>Elektronik pipet ve tek kullanımlık serolojik pipet, kullanarak Ekle beş X çözüm ve 4 mL % 20 glikoz çözüm 40 mL ölçülen GKD 2 için O. Daha sonra 0.2 mL MgSO 4 tiamin çözüm P-200 ile ekleyin. 1.1.3. adımda açıklandığı gibi çözüm sterilize.</li>
	</ol></li></ol> 2. Gliserol stok hazırlanması <ol><li>hücre kültür Not: bakteri suşları (örneğin, W3110 ve onun azaltılmış genleri) yük banka kuruluşlardan mevcuttur. Suşlarının agar plakaları koloniler şeklinde genellikle elde edilir.
	<ol><li>Silikon kauçuk Stoper, elektronik bir pipet, P-1,000, 1.000-µL pipet ipuçları, P-200, 200-µL pipet ipuçları ve temiz bir Bank üzerinde hedef suşları (kolonileri plakaları) ile beş steril cam tüplerin yerleştirin.</li>
		<li>Cam tüp Bunsen Burner ağız silikon kauçuk tıpa açmadan önce ortaya çıkarmak. Tüp açıldıktan sonra silikon kauçuk tıpa aleve maruz ve hafifçe kap cam tüp geri yerleştirin.</li>
		<li>5 mL M63 bir cam tüpler ve diğer dört tüpler için 4.5 mL M63 eklemek için elektronik pipet ve tek kullanımlık serolojik pipet kullanın.</li>
		<li>Bir koloni alıp 5 mL M63 içeren cam tüpte aşılamak için P-200 ipucu kullanın.</li>
		<li>Bir süspansiyon yapmak için girdap tüp. O zaman, çözüm 10 kat seyreltik tarafından Bu çözümün 0.5 mL 4.5 mL M63 içeren dört tüpler birine transfer.</li>
		<li>Kalan tüpler 2.1.5. adımda açıklanan işlemi yineleyin. Beş farklı konsantrasyonları ile seyreltme serisi (dilutions 1, 10, 100, 1000 ve 10.000) şimdi hazırdır.</li>
		<li>Cam tüp ve 2.1.2. adımda açıklandığı gibi silikon kauçuk stoper ağızlarını sterilize. Stoper tüplerini kap. Kontaminasyon silikon kauçuk stoper kırışıklıklar değil.</li>
		<li>Önceden ısıtılmış sallayarak kuluçka 37 ° C'de beş tüpler yerleştirin ve 200 devir / dakikada sallamak. Kültür gecede veya 10-30 h. için kuluçkaya</li>
	</ol></li> <li>Seçimi gliserol hisse senedi için kültür <ol><li>Önceden ısıtılmış oda sıcaklığında M63 orta, P-1,000, 1.000-µL pipet ipuçları ve tek kullanımlık bir küvet temiz bir bankta yerleştirin.</li>
		<li>Ekle 1000 µL M63 tek kullanımlık bir küvet için bir P-1, 000 ile. Tek kullanımlık küvet bir Spektrofotometre yerleştirin, sabit bir dalga boyu 600 adlı programını başlatmak nm ve ölçü birimi boş.</li>
		<li>Beş cam tüpler temiz kürsüye sallayarak kuluçka taşımak.</li>
		<li>Atmak M63 tek kullanımlık küvet gelen ve aynı tek kullanımlık küvet bir P-1, 000 ile 1.000 µL kültür ekleyin. 2.2.2. adımda açıklandığı gibi hücre kültürü (OD 600) optik bulanıklık ölçmek. 
		Not: herhangi bir kontaminasyon ve hassas bir ölçüm elde etmek için cam boru ve açıklandığı gibi alev ve girdap kültür önce örnekleme stoppers maruz. Özellikle hücre yoğunluğu düşük olduğu zamanlarda güvenilir sonuçlar alabilmek için tekrarlanan ölçüler, tavsiye edilir.</li>
		<li>Beş hücre kültürleri, erken üstel büyüme aşamasında birini (OD 600 = 0,01 - 0,05) gliserol hisse senedi için. 
		Not: birden çok kültürü yoğunlukları optimum menzili içinde varsa, 0,05 en yakın yaygın olarak seçili.</li>
	</ol></li> <li>Tekrarlanan testleri için gliserol hisse senedi olun. 
	Not: Bu on hisse senetleri hazırlamak için tanımlanır. Daha büyük veya daha küçük miktarlarda deneysel gereksinimlerine göre yapılabilir.
	<ol><li>Steril % 60 gliserol çözüm getirin, on 1.5 mL mikrotüpler, P-1,000 sterilize ve P-200, 1000 ve 200 µL pipet ipuçları ve bir microtube stand temiz bir bankta.</li>
		<li>Ekleyin 250 µL sterilize % 60 gliserol çözüm ve 1.5 mL microtube ve mix için seçili hücre kültürünün 750 µL tarafından pipetting. 
		Not: Stok birimi değişkendir, ancak her zaman % 60 gliserol hücre kültürü için 1:3 oranını korumak; Bu % 15 gliserol son bir konsantrasyon sonuçlanır.</li>
		<li>Kalan dokuz mikrotüpler microtube tribünde yer ve her tüpün 2.3.2. adımda hazırlanan karışımı 100 µL dağıtmak. Şimdi ileride kullanmak için on aynı gliserol hisse senedi vardır.</li>
		<li>Derin dondurucu-80, hisse senetleri depolamak ° C.</li>
	</ol></li></ol> 3. Büyüme eğrileri elde <ol><li>yukarıya Mikroplaka okuyucu ayarlama. 
	Not: (bkz: malzemeler tablo) plaka okuyucu kullanılan belirli phrasing burada kullanılan tırnak işaretleri gösterisinde gösterilen koşulları.
	<ol><li>Açık belgili tanımlık bilgisayar yazılımı. Açık &#34; iletişim kuralları &#34; içinde &#34; Görev Yöneticisi &#34; ve seçin &#34; Yeni Oluştur &#34;. Seçin &#34; standart protokol &#34;.</li>
		<li>Aç &#34; yordam &#34; ve ayarlarını yapın. Açık &#34; sıcaklık ayarla &#34; ve seçin &#34; kuluçka makinesi üzerinde &#34;. Ayarla &#34; sıcaklık &#34; 37 ° c ve &#34; degrade &#34; 0 ° C. onay &#34; Onceden &#34; sonraki adımla devam etmeden önce. Açık &#34; başlatmak Kinetik &#34;, set &#34; çalışma zamanı &#34; için 24:00:00 ya da 48:00:00, ve &#34; aralığı &#34; 00:30:00 ve 01:00:00 için. 
		Not: Tüm 96 de plaka okumak için yaklaşık 1 dakika sürer.</li>
		<li>Aç &#34; sallamak &#34; ve &#34; sallamak modu &#34; olarak &#34; lineer &#34;. Kontrol &#34; Constitution sallamak &#34; ve &#34; frekans &#34; 567 BGBM. Açık &#34; okuma &#34;, kontrol &#34; Absorbans &#34;, &#34; son nokta/Kinetik &#34;, ve &#34; Monochromators. &#34; ayarla &#34; dalga boyu &#34; 600.</li>
		<li>Tıklama &#34; doğrula &#34; yordam doğru olduğunu onaylamak için. ' I tıklatın &#34; kurtarmak &#34; ileride kullanmak üzere yeni bir program olarak kaydetmeyi.</li>
	</ol></li> <li>Gerçek zamanlı büyüme kayıt <ol><li>aşısını kültür örnekleri 96-şey plaka üzerinde konumlarını belirtmek için bir 96-şey plaka sembol (8 × 12 tablo) çizin. Tablo baskı ve deneme için bir başvuru olarak kullanın. 
		Not: Mikroplaka kenarlarında bulunan kuyu yalnızca buharlaşma nedeniyle boş orta içermelidir.</li>
		<li>Yer sterilize edilmiş bir 96-şey düz alt Mikroplaka kapak, P-1000, 1000-µL pipet ipuçları, P-200, 200-µL pipet ipuçları, birkaç 1.5 mL mikrotüpler, bir 8-çok kanallı pipet, steril reaktif su deposu, oda sıcaklığında M63 ve gliserol ile temiz bir banka hisse senetleri (2.3 adımda hazırlanan).</li>
		<li>Yaklaşık 25 mL M63 reaktif havzanın ekleyin. Bu depo stok için aşağıdaki adımların tümünü kullanın.</li>
		<li>Ekleyin 900 µL M63 mikrotüpler seri dilutions yapmak için hazırlık için.</li>
		<li>Gliserol stok oda sıcaklığında erimek. 900 µL eklemek M63 çözdürülen gliserol hisse senedi ve girdap. Bu orijinal gliserol hisse senedi 10 kat bir seyreltme içinde sonuç.</li>
		<li>900 µL M63 ve girdap içeren başka bir microtube için 10 kat seyreltme transfer 100 µL. Bu 100-fold bir seyreltme olur.</li>
		<li>Tekrarlama adım dilutions için istediğiniz sayıyı elde kadar 3.2.6.</li>
		<li>Doldurmak wells 200 µL M63 kullanarak Mikroplaka kenarında bir 8 kanallı pipet (P-200). 
		Not: Bu kuyu boş kullanılabilir.</li>
		<li>Yük 200 µL her adımda 3.2.4 - 3.2.7 başvuru tablosu (Adım 3.2.1) göre Mikroplaka wells için hazırlanan örnek seyreltilmiş. Girdap seyreltilmiş numune önceden yükleme ve yük aynı örnek birden çok Wells için çeşitli konumları plaka üzerinde.</li>
		<li>96-şey Mikroplaka plaka okuyucu üzerinde yerleştirin.</li>
		<li>Aç &#34; okunur Şimdi &#34; içinde &#34; Görev Yöneticisi &#34; ve program (Bölüm 3.1) seçin. ' I tıklatın &#34; Tamam &#34; ölçümünü başlatmak için. Veri analizi (Bölüm 4) için yeni bir deneysel dosya kaydı saklamak.</li>
	</ol></li></ol> 4. Veri analizi <ol><li>verme bir USB bellek için gerçek zamanlı büyüme hızında veri (Bölüm 3.2) sonuçlarını bir metin dosyası olarak sopa. 
	Not: Bir 96-iyi biçimlendirilmiş sonuçlar (eğriler) plaka okuyucu gerçek zamanlı olarak görüntülenir. Saatlik kayıtları (OD değerleri) bir tablo olarak verilebilir; satır ve sütunları iyi numarası (örneğin, A1, B1) ve ölçüm saat (örneğin, 00:00:59) temsil sırasıyla.</li>
	<li>Elektronik tablo yazılımı ile metin dosyası açın.</li>
	<li>Saatlik OD 600 okur 96-şey Mikroplaka sayısı daha fazla çözümleme için yeni bir çalışma sayfasına kopyalayın.</li>
	<li>Arka plan okur, çıkarma zaman her örneğinin saatlik okuma sıfırdan de. 
	Not: kolaylık sağlamak için boş ortalama değerini içeren M63 kuyuları (Adım 3.2.8)-ebilmek var olmak kullanılmış ile arka plan değeri.</li>
	<li>Maksimal nüfus yoğunluğu tahmin etmek için beş ardışık OD 600 okuma ortalamasını hesaplamak. 
	Not: Maksimal OD 600 karşılık gelen büyüme eğrisi beş ardışık OD 600 okuma en büyük ortalama değeri tanımlanır.</li>
	<li>Hesaplamak büyüme oranı, μ (s -1), tüm çift ardışık değerleri aşağıdaki denklemi OD 600 uygulayarak: 
	<img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56197/56197eq1.jpg" /> Not: Bu denklemde ben C ve C ı + 1 herhangi iki ardışık zaman nokta (Ben t ve t ı + 1, OD 600 değerleri temsil sırasıyla). Doğal logaritma LN gösterir.</li>
	<li>Zamanla büyüme oranı değişiklikleri saatlik OD 600 dayalı Calculate adım 4,6 göre okur. Ortalama ve standart sapma maksimum büyüme oranı tahmin etmek için beş ardışık büyüme oranları hesaplamak. 
	Not: En büyük ortalama en küçük standart sapma ile ilgili büyüme eğrisi maksimal büyüme oranı tanımlanır.</li>
</ol> 5. 96-iyi okur (isteğe bağlı) genel önyargı teyit Not: her iki plaka okuyucu ve tüketim 96-şey plaka önyargılı ölçümleri neden olabilir. Son derece hassas ve tekrarlanabilir sayısal sonuçlar elde etmek için genel önyargı 96-şey plaka teyit önerilir.
<ol><li>96-şey plaka ve plaka okuyucu için önyargı testi 3.2.2 bölümünde açıklandığı şekilde hazırlayın.</li>
	<li>Ekle 20 mL steril 50 mL santrifüj tüpü M63. Gliserol stok aynı santrifüj tüpü ve girdap ekleyin. Askıya alınmış çözüm bir steril reaktif rezervuar transfer.</li>
	<li>Askıya alınmış çözüm 200 µL 96-şey plakasına aktarmak için bir 8 kanallı pipet kullanın.</li>
	<li>96-şey plaka plaka okuyucu üzerinde yerleştirin ve ölçüm başlar.</li>
	<li>Kayıt OD 600 saatlik okur ve 4 bölümde açıklandığı gibi analiz. 96-iyi okur gerektirebileceği önyargı belirlemek için her şey hesaplanan maksimal büyüme oranı ve nüfus yoğunluğu karşılaştırın.</li>
</ol>

<ol><li>Kovarova-Kovar, K., Egli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+kinetics+of+suspended+microbial+cells%3A+from+single-substrate-controlled+growth+to+mixed-substrate+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Growth kinetics of suspended microbial cells: from single-substrate-controlled growth to mixed-substrate kinetics.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 62 (3), 646-666 (1998).</li>
<li>Soupene, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+studies+of+Escherichia+coli+strain+MG1655%3A+growth+defects+and+apparent+cross-regulation+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Physiological studies of Escherichia coli strain MG1655: growth defects and apparent cross-regulation of gene expression.</a> J Bacteriol. 185 (18), 5611-5626 (2003).</li>
<li>Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D'Ari, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+physiology+in+Luria-Bertani+broth%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth.</a> J Bacteriol. 189 (23), 8746-8749 (2007).</li>
<li>Egli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+growth+and+physiology%3A+a+call+for+better+craftsmanship%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Microbial growth and physiology: a call for better craftsmanship.</a> Front Microbiol. 6, 287(2015).</li>
<li>Kurokawa, M., Seno, S., Matsuda, H., Ying, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+between+genome+reduction+and+bacterial+growth%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Res%22%5BJournal%5D)">Correlation between genome reduction and bacterial growth.</a> DNA Res. 23 (6), 517-525 (2016).</li>
<li>Matsumoto, Y., Murakami, Y., Tsuru, S., Ying, B. W., Yomo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+rate-coordinated+transcriptome+reorganization+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Growth rate-coordinated transcriptome reorganization in bacteria.</a> BMC Genomics. 14, 808(2013).</li>
<li>Nahku, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+growth+rate+dependent+transcriptome+profiling+of+Escherichia+coli+K12+MG1655+in+accelerostat+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Specific growth rate dependent transcriptome profiling of Escherichia coli K12 MG1655 in accelerostat cultures.</a> J Biotechnol. 145 (1), 60-65 (2010).</li>
<li>Dai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+translating+ribosomes+enables+Escherichia+coli+to+maintain+elongation+rates+during+slow+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Reduction of translating ribosomes enables Escherichia coli to maintain elongation rates during slow growth.</a> Nat Microbiol. 2, 16231(2016).</li>
<li>Madrid, R. E., Felice, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+biomass+estimation%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Microbial biomass estimation.</a> Crit Rev Biotechnol. 25 (3), 97-112 (2005).</li>
<li>Harris, C. M., Kell, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+estimation+of+microbial+biomass%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors%22%5BJournal%5D)">The estimation of microbial biomass.</a> Biosensors. 1 (1), 17-84 (1985).</li>
<li>Yates, G. T., Smotzer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+lag+phase+and+initial+decline+of+microbial+growth+curves%5BTitle%5D)+AND+%22J+Theor+Biol%22%5BJournal%5D)">On the lag phase and initial decline of microbial growth curves.</a> J Theor Biol. 244 (3), 511-517 (2007).</li>
<li>Kargi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-interpretation+of+the+logistic+equation+for+batch+microbial+growth+in+relation+to+Monod+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Lett+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Re-interpretation of the logistic equation for batch microbial growth in relation to Monod kinetics.</a> Lett Appl Microbiol. 48 (4), 398-401 (2009).</li>
<li>Peleg, M., Corradini, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+growth+curves%3A+what+the+models+tell+us+and+what+they+cannot%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Food+Sci+Nutr%22%5BJournal%5D)">Microbial growth curves: what the models tell us and what they cannot.</a> Crit Rev Food Sci Nutr. 51 (10), 917-945 (2011).</li>
<li>Sprouffske, K., Wagner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growthcurver%3A+an+R+package+for+obtaining+interpretable+metrics+from+microbial+growth+curves%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Growthcurver: an R package for obtaining interpretable metrics from microbial growth curves.</a> BMC Bioinformatics. 17, 172(2016).</li>
<li>Hall, B. G., Acar, H., Nandipati, A., Barlow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+rates+made+easy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Evol%22%5BJournal%5D)">Growth rates made easy.</a> Mol Biol Evol. 31 (1), 232-238 (2014).</li>
<li>Hermsen, R., Okano, H., You, C., Werner, N., Hwa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+growth-rate+composition+formula+for+the+growth+of+E.coli+on+co-utilized+carbon+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">A growth-rate composition formula for the growth of E.coli on co-utilized carbon substrates.</a> Mol Syst Biol. 11 (4), 801(2015).</li>
<li>Engen, S., Saether, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((r-+and+K-selection+in+fluctuating+populations+is+determined+by+the+evolutionary+trade-off+between+two+fitness+measures%3A+Growth+rate+and+lifetime+reproductive+success%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution%22%5BJournal%5D)">r- and K-selection in fluctuating populations is determined by the evolutionary trade-off between two fitness measures: Growth rate and lifetime reproductive success.</a> Evolution. 71 (1), 167-173 (2017).</li>
</ol>

Kohei Tsuchiya CFU tahlil örnek verdiğiniz için teşekkür ederiz. Bu eser kısmen maddi bir Grant-in-Aid tarafından bilimsel araştırma (C) No 26506003 için (BWY) Milli Eğitim Bakanlığı, kültür, spor, bilim ve teknoloji, Japonya desteklenmiştir.

Kritik adımlar protokolündeki hücreleri ve çeşitli pozisyonlarda Mikroplaka üzerinde birden fazla Wells aynı örnekleri çoğaltmasını katlanarak büyüyen bir hisse senedi hazırlanması içerir. Daha önce microbiologists bir gece öncesi Kültür Kültür başladı. Bu yöntem Bakteriyel büyüme gecikme süresini azaltmak iken, tekrarlanabilir büyüme eğrileri elde etmek zordur. Şekil 2' de gösterildiği gibi ortak gliserol hisse senetleri kullanarak bağımsız ölçüleri ...

Mikrobiyolojik çalışmalar genellikle bakteriyel hücre kültürü ve bakteri fizyolojisi1,2,3temel bir fenomen temsil Bakteriyel büyüme eğrileri değerlendirilmesi ile başlar. Bakteri kültürü bir temel metodoloji olduğundan temel kültür ilkeleri yaygın olarak Yayınlanan araştırma edebiyat ve ders kitapları mevcuttur. Tezgah düzeyinde önemli dikkat geleneksel büyüme medya en iyi duruma getirme ve koşullar kültür üzerinde yoğunlaştı ancak büyüme hızını denetleme, hangi büyük olasılıkla mikrobiyal fizyoloji, daha büyük anlayış sağlayacak olmamıştır 4yaygın olarak okudu. Katlanarak bakteri için hücresel devlet anahtar parametresini genom, transcriptome ve Proteom5,6,7,8 ile koordineli olduğu bildirilen büyüme oranı büyüyor . Böylece, Bakteriyel büyüme kantitatif değerlendirilmesi mikrobiyal Fizyoloji anlamak için önemlidir.
Bakteriyel büyüme değerlendirmek için biyokütle tahmin etmek için kullanılan deneysel yöntemleri de kurulan9,10 ve optik bulanıklık gibi biyokimyasal, fiziksel veya biyolojik parametreleri algılama temel alır. Buna ek olarak, büyüme değişiklikleri dinamik özelliklerini yakalamak için kullanılan analitik yöntemleri yaygın olarak kurulan doğrusal olmayan modelleri11,12,13, örneğin, lojistik denklemler temel alır. Büyüme dinamikleri genellikle hücre büyüme kültür zamanlanmış örnekleme tarafından optik bulanıklık ölçüm veya koloni oluşturan birim (CFU) deneyleri performans elde edilir. Bu kültür ve algılama yöntemleri sınırlandırılması veri noktaları nüfus dinamikleri gerçek bir yansımasıdır ölçüm aralıkları genellikle saat içinde olduğu için ve çünkü değildir kültür durumu (örneğin, sıcaklık değişiklikleri ve Havalandırma) örnekleme anda bozulmuştur. Kültür ve analiz teknikleri teknoloji ve anlayış son gelişmeler kullanarak güncelleştirilmiş olması gerekir. Mikroplaka Okuyucular son gelişmeler bakterilerin büyüme gerçek zamanlı gözlem izin ve işçilik maliyetleri önemli ölçüde azaltabilirsiniz. Bu gelişmiş cihazlar kullanarak, Bakteriyel büyüme üzerinde son çalışmaları için yüksek üretilen iş ölçümleri14,15analitik yöntemleri bildirdi.
Bu iletişim kuralı, hassas büyüme dinamikleri sonuçta nasıl büyüme oranı belirlenir ve büyüme oranı ne etken etkiler sorular adresi nicel çalışmalar için değerli olacaktır yüksek üretilen iş bir şekilde değerlendirmek için amaçtır. Protokol bakterilerin büyüme tekrarlanabilir ve hassas Nefelometri için dikkate alınması gereken tüm faktörler ele alır. Deneysel yöntem ve analiz ana metin ayrıntılarıyla açıklanmıştır. Bu yöntem Bakteriyel büyüme kesin ve tekrarlanabilir analizini bir yüksek-den geçerek şekilde izin verir. Microbiologists bu iletişim kuralı ek nicel sonuçları onların deneysel kanıt türetmek için kullanabilirsiniz. Bu iletişim kuralı kavramsal sonuçlara ulaşmak için veya büyüme teorik bir bakış elde etmek için çalışan sistemleri Biyoloji çalışmaları için de kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Wako</td><td>164-04295</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Wako</td><td>166-04255</td><td></td></tr><tr><td>(NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Wako</td><td>019-03435</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;-7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Wako</td><td>138-00415</td><td></td></tr><tr><td>Thiamine-HCl</td><td>Wako</td><td>201-00852</td><td></td></tr><tr><td>glucose</td><td>Wako</td><td>049-31165</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Wako</td><td>080-01066</td><td></td></tr><tr><td>Iron (II) sulfate heptahydrate (FeSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;-7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Wako</td><td>094-01082</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Wako</td><td>168-21815</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Wako</td><td>075-00611</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge tube (50 mL, sterilized)</td><td>WATSON</td><td>1342-050S</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Tips, 200 &amp;micro;L</td><td>WATSON</td><td>110-705Y</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Tips, 1,000 &amp;micro;L</td><td>WATSON</td><td>110-8040</td><td></td></tr><tr><td>Microtube (1.5 mL)</td><td>WATSON</td><td>131-715C</td><td></td></tr><tr><td>8 multichannel-pipette</td><td>WATSON</td><td>NT-8200</td><td></td></tr><tr><td>PASORINA STIRRER</td><td>AS ONE</td><td>2-4990-02</td><td></td></tr><tr><td>Glass cylinder (200 mL)</td><td>AS ONE</td><td>1-8562-07</td><td></td></tr><tr><td>Precision pH mater</td><td>AS ONE</td><td>AS800 / 1-054-01</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P-200</td><td>GILSON</td><td>1-6855-05</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P-1000</td><td>GILSON</td><td>1-6855-06</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Serolocical Pipettes (10 mL)</td><td>SANPLATEC</td><td>SAN27014</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Serolocical Pipettes (25 mL)</td><td>SANPLATEC</td><td>SAN27015</td><td></td></tr><tr><td>Microtube stand</td><td>BM Bio</td><td>801-02Y</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>BM Bio</td><td>BM-V1</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar 96-well microplate with lid (Flat bottom, Clear)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Corning, 3370</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar reagent reservoir (50 mL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Corning, 4870</td><td></td></tr><tr><td>Stericup GV PVDF (250 mL, 0.22 &amp;micro;M)</td><td>Merck Millipore</td><td>SCGVU02RE</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Aid XP</td><td>DRUMMOND</td><td>4-000-101</td><td></td></tr><tr><td>Bioshaker (BR-23UM MR)</td><td>TAITEC</td><td>0053778-000</td><td></td></tr><tr><td>Disposal cell (1.5 mL)</td><td>Kartell</td><td>1938 / 2-478-02</td><td></td></tr><tr><td>DU 730 Life Science UV/Vis Spectrophotometer</td><td>Beckman Coulter</td><td>A23616</td><td></td></tr><tr><td>EPOCH2</td><td>BioTek</td><td>2014-EP2-002 / EPOCH2T</td><td></td></tr><tr><td>Beaker (500 mL)</td><td>IWAKI</td><td>82-0008</td><td></td></tr><tr><td>BIO clean bench</td><td>Panasonic</td><td>MCV-B131F</td><td></td></tr><tr><td>Glass tubes</td><td>NICHIDEN RIKA GLASS</td><td>P-10M~P-30 /101019</td><td></td></tr><tr><td>Silicone rubber stoppers</td><td>ShinEtsu Polymer</td><td>T-19</td><td></td></tr><tr><td>Bacterial strains</td><td>Strain bank organization; National Bio Resource Project (NBRP) in Japan</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

precise, high-throughput analysis of bacterial growth

Bakteriyel büyüme, modern mikrobiyal Fizyoloji geliştirilmesi, hem de sistem düzeyinde hücre dinamiği soruşturma merkezi bir kavramdır. Son yıllarda yapılan çalışmalarda bakterilerin büyüme ve genom azaltma ve transcriptome yeniden yapılanma gibi genom-wide olaylar arasındaki ilişkiler bildirdin. Bakteriyel büyüme doğru analiz büyüme bağımlı koordinasyon gen fonksiyonları ve hücresel bileşenleri anlamak için önemlidir. Buna göre bir yüksek-den geçerek şekilde Bakteriyel büyüme kesin kantitatif değerlendirilmesi gereklidir. Ortaya çıkan teknolojik gelişmeler Bakteriyel büyüme çalışmak için kullanılan yöntemlerin güncelleştirmelere izin yeni deneysel araçları sunar. Burada sunulan Protokolü Mikroplaka okuyucu dağlık iyimserlik deneysel bir işlem tekrarlanabilir ve hassas değerlendirme bakterilerin büyüme ile istihdam etmektedir. Bu iletişim kuralı birkaç büyüme değerlendirmek için kullanılan daha önce açıklanan Escherichia coli suşları. Protokol ana adımları aşağıdaki gibidir: çok sayıda küçük şişeleri hisselerinde hücre hazırlık tekrarlanabilir sonuçlar, 96-şey plakaları kullanım için yüksek üretilen iş büyüme değerlendirme ve iki büyük el ile hesaplama ile tekrarlanan testler için parametreleri (örneğin, maksimal büyüme oranı ve nüfus yoğunluğu) büyüme dinamikleri temsil eden. İle karşılaştırıldığında hangi cam tüplerde bitti Ağar kaplamalar zamanında kültürlü hücreleri sayar, geleneksel koloni oluşturan birim (CFU) tahlil, mevcut yöntemi daha etkilidir ve büyüme değişiklikleri daha ayrıntılı geçici kayıt sağlar, ancak bir daha sıkı sahiptir düşük nüfus yoğunluğu algılama limitte. Özet olarak, açıklanan yöntemi kesin ve tekrarlanabilir yüksek üretilen iş analizi kavramsal sonuçlara ulaşmak için veya teorik gözlemler yapmak için kullanılabilir Bakteriyel büyüme için avantajlıdır.

Açıklanan yöntemi dinamik Bakteriyel büyüme sürekli, yüksek üretilen iş bir şekilde çeşitli zaman aralıkları (dakikadan gün saat) birden fazla optik yoğunluk ölçümleri alır bir 96-şey biçimi okuyucu kullanarak yakalamak için bir yol sağlar. E. coli suşlarının çeşitli genleri ifade bir ürün yelpazesine büyüme eğrileri tam olarak tek bir deneyi (şekil 1A) elde edilebilir. Açıklanan yöntemi ile karşılaştırıldı...

Watch this Scientific Journal Video about Precise, High-throughput Analysis of Bacterial Growth at JoVE.com

Precise, High-throughput Analysis of Bacterial Growth

Bakteriyel büyüme kesin, yüksek üretilen iş analizi

Bakteriyel büyüme kantitatif değerlendirilmesi mikrobiyal Fizyoloji bir sistemleri-düzey olgu olarak anlamak için gerekli. Deneysel manipülasyon ve analitik bir yaklaşım için bir protokol bırakmak kesin, yüksek üretilen iş analizi anahtar sistemleri Biyoloji ilgi konusu bakterilerin büyüme için sunulmaktadır.

Bacterial growth is a central concept in the development of modern microbial physiology, as well as in the investigation of cellular dynamics at the ...

precise-high-throughput-analysis-of-bacterial-growth

Research

JoVE Journal

Biology

23.9K Görüntüleme.  University of Tsukuba. Bakteriyel büyüme kantitatif değerlendirilmesi mikrobiyal Fizyoloji bir sistemleri-düzey olgu olarak anlamak için gerekli. Deneysel manipülasyon ve analitik bir yaklaşım için bir protokol bırakmak kesin, yüksek üretilen iş analizi anahtar sistemleri Biyoloji ilgi konusu bakterilerin büyüme için sunulmaktadır.

Video: Precise, High-throughput Analysis of Bacterial Growth

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding of an RNA binding protein (RBP) to the initiation region of the mRNA, which interferes with ribosome binding. In the presented method, we utilize this blocking phenomenon to quantify the binding affinity of RBPs to their cognate and non-cognate binding sites. To do this, we insert a test binding site in the initiation region of a reporter mRNA and induce the expression of the test RBP. In the case of RBP-RNA binding, we observed a sigmoidal repression of the reporter expression as a function of RBP concentration. In the case of no-affinity or very low affinity between binding site and RBP, no significant repression was observed. The method is carried out in live bacterial cells, and does not require expensive or sophisticated machinery. It is useful for quantifying and comparing between the binding affinities of different RBPs that are functional in bacteria to a set of designed binding sites. This method may be inappropriate for binding sites with high structural complexity. This is due to the possibility of repression of ribosomal initiation by complex mRNA structure in the absence of RBP, which would result in lower basal reporter gene expression, and thus less-observable reporter repression upon RBP binding.

In this method, we quantify the binding affinity of RNA binding proteins (RBPs) to cognate and non-cognate binding sites using a simple, live, reporter assay in bacterial cells. The assay is based on repression of a reporter gene.

Bakterilerde protein RNA bağlayıcı ölçümü için bir tahlil

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

Genetik

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to perform and its ability to standardize the fitness of many strains to a wild-type organism. The technique is limited, however, by available phenotypic markers and the number of strains that can be assessed simultaneously, creating the need for a great number of replicate experiments. Concurrent with large numbers of experiments, the labor and material costs for quantifying bacteria based on phenotypic markers are not insignificant. To overcome these negative aspects while retaining the positive aspects, we have developed a molecular-based approach to directly quantify microorganisms after engineering genetic markers onto bacterial chromosomes. Unique, 25 base pair DNA barcodes were inserted at an innocuous locus on the chromosome of wild-type and mutant strains of Salmonella. In vitro competition experiments were performed using inocula consisting of pooled strains. Following the competition, the absolute numbers of each strain were quantified using digital PCR and the competitive indices for each strain were calculated from those values. Our data indicate that this approach to quantifying Salmonella is extremely sensitive, accurate, and precise for detecting both highly abundant (high fitness) and rare (low fitness) microorganisms. Additionally, this technique is easily adaptable to nearly any organism with chromosomes capable of modification, as well as to various experimental designs that require absolute quantification of microorganisms.

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

This molecular-based approach for determining bacterial fitness facilitates precise and accurate detection of microorganisms using unique genomic DNA barcodes that are quantified via digital PCR. The protocol describes calculating the competitive index for Salmonella strains; however, the technology is readily adaptable to protocols requiring absolute quantification of any genetically-malleable organism.

Salmonella Fitness yüksek verimlilik analizi için dijital PCR tabanlı rekabetçi endeksi

A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to ...

Enhanced Reproducibility and Precision of High-Throughput Quantification of Bacterial Growth Data Using a Microplate Reader

This study aimed to develop a repeatable, reliable, high-throughput protocol to monitor bacterial growth in 96-well plates and analyze the maximum growth rate. The growth curves and maximum growth rates of two bacterial species were determined. Issues including (i) lid condensation, (ii) pathlength correction, (iii) inoculation size, (iv) sampling time interval, and (v) spatial bias were investigated. The repeatability of the protocol was assessed with three independent technical replications, with a standard deviation of 0.03 between the runs. The maximum growth rates of Bacillus mycoides and Paenibacillus tundrae were determined to be&#160;(mean&#160;&#177; SD) 0.99 h&#8722;1 &#177;&#160; 0.03 h&#8722;1 and 0.85 h&#8722;1 &#177; 0.025 h&#8722;1, respectively. These bacteria are more challenging to monitor optically due to their affinity to clump together. This study demonstrates the critical importance of inoculation size, path length correction, lid warming, sampling time intervals, and well-plate spatial bias to obtain reliable, accurate, and reproducible data on microplate readers. The developed protocol and its verification steps can be expanded to other methods using microplate readers and high-throughput protocols, reducing the researchers&#39; innate errors and material costs.

<meta charset="utf8"></head><body>Bir mikroplaka okuyucu kullanarak bakteri üreme verilerinin yüksek verimli nicelleştirilmesinin gelişmiş tekrarlanabilirliği ve hassasiyeti

Here, a high-throughput protocol is presented to measure growth data, including growth curves, growth rate, and maximum growth rate. The protocol was verified and validated using two biofilm-producing bacteria. The results and approach applied in this study can be expanded to other high-throughput protocols using microplate readers.

Bir mikroplaka okuyucu kullanarak bakteri üreme verilerinin yüksek verimli nicelleştirilmesinin gelişmiş tekrarlanabilirliği ve hassasiyeti

This study aimed to develop a repeatable, reliable, high-throughput protocol to monitor bacterial growth in 96-well plates and analyze the maximum growth ...

Çevre

ScanLag: High-throughput Quantification of Colony Growth and Lag Time

Growth dynamics are fundamental characteristics of microorganisms. Quantifying growth precisely is an important goal in microbiology. Growth dynamics are affected both by the doubling time of the microorganism and by any delay in growth upon transfer from one condition to another, the lag. The ScanLag method enables the characterization of these two independent properties at the level of colonies originating each from a single cell, generating a two-dimensional distribution of the lag time and of the growth time. In ScanLag, measurement of the time it takes for colonies on conventional nutrient agar plates to be detected is automated on an array of commercial scanners controlled by an in house application. Petri dishes are placed on the scanners, and the application acquires images periodically. Automated analysis of colony growth is then done by an application that returns the appearance time and growth rate of each colony. Other parameters, such as the shape, texture and color of the colony, can be extracted for multidimensional mapping of sub-populations of cells. Finally, the method enables the retrieval of rare variants with specific growth phenotypes for further characterization. The technique could be applied in bacteriology for the identification of long lag that can cause persistence to antibiotics, as well as a general low cost technique for phenotypic screens.

ScanLag is a high-throughput method for measuring the delay in growth, namely lag time, as well as the growth rate of colonies for thousands of cells in parallel. Screening using ScanLag enables the discrimination between long lag-time and slow growth at the level of a single variant.

ScanLag: Yüksek verim Colony Büyüme niceliksel ve Zaman Lag

Growth dynamics are fundamental characteristics of microorganisms. Quantifying growth precisely is an important goal in microbiology. Growth dynamics are ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Phage Phenomics: Physiological Approaches to Characterize Novel Viral Proteins

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage sequences share no homology to current annotated proteins. As a result, a large proportion of phage genes are annotated as hypothetical. This reality heavily affects the annotation of both structural and auxiliary metabolic genes. Here we present phenomic methods designed to capture the physiological response(s) of a selected host during expression of one of these unknown phage genes. Multi-phenotype Assay Plates (MAPs) are used to monitor the diversity of host substrate utilization and subsequent biomass formation, while metabolomics provides bi-product analysis by monitoring metabolite abundance and diversity. Both tools are used simultaneously to provide a phenotypic profile associated with expression of a single putative phage open reading frame (ORF). Representative results for both methods are compared, highlighting the phenotypic profile differences of a host carrying either putative structural or metabolic phage genes. In addition, the visualization techniques and high throughput computational pipelines that facilitated experimental analysis are presented.

Here, we present phenomic approaches for the functional characterization of putative phage genes. Techniques include a developed assay capable of monitoring host anabolic metabolism, the Multi-phenotype Assay Plates (MAPs), in addition to the established method of metabolomics, capable of measuring effects to catabolic metabolism.

Faj Phenomics: Fizyolojik Yaklaşımlar Roman Viral Proteinler karakterize etmek

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage ...

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

The protocol developed here offers a tool to enable computer tracking of Escherichia coli division and fluorescent levels over several hours. The process starts by screening for colonies that survive on minimal media, assuming that only Escherichia coli harboring the correct plasmid will be able to thrive in the specific conditions. Since the process of building large genetic circuits, requiring the assembly of many DNA parts, is challenging, circuit components are often distributed between multiple plasmids at different copy numbers requiring the use of several antibiotics. Mutations in the plasmid can destroy transcription of the antibiotic resistance genes and interject with resources management in the cell leading to necrosis. The selected colony is set on a glass-bottom Petri dish and a few focus planes are selected for microscopy tracking in both bright field and fluorescent domains. The protocol maintains the image focus for more than 12 hours under initial conditions that cannot be regulated, creating a few difficulties. For example, dead cells start to accumulate in the lenses' field of focus after a few hours of imaging, which causes toxins to buildup and the signal to blur and decay. Depletion of nutrients introduces new metabolic processes and hinder the desired response of the circuit. The experiment's temperature lowers the effectivity of inducers and antibiotics, which can further damage the reliability of the signal. The minimal media gel shrinks and dries, and as a result the optical focus changes over time. We developed this method to overcome these challenges in Escherichia coli, similar to previous works developing analogous methods for other micro-organisms. In addition, this method offers an algorithm to quantify the total stochastic noise in unaltered and altered cells, finding that the results are consistent with flow analyzer predictions as shown by a similar coefficient of variation (CV).

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

This work presents a microscopy method that allows live imaging of a single cell of Escherichia coli for analysis and quantification of the stochastic behavior of synthetic gene circuits.

Zaman Atlamalı Mikroskopi Kullanılarak Escherichia Coli'de Biyolojik Gürültünün Sürekli Ölçümü

The protocol developed here offers a tool to enable computer tracking of Escherichia coli division and fluorescent levels over several hours. The process ...

Biyomühendislik

Multi-scale Analysis of Bacterial Growth Under Stress Treatments

Analysis of the bacterial ability to grow and survive under stress conditions is essential for a wide range of microbiology studies. It is relevant to characterize the response of bacterial cells to stress-inducing treatments such as exposure to antibiotics or other antimicrobial compounds, irradiation, non-physiological pH, temperature, or salt concentration. Different stress treatments might disturb different cellular processes, including cell division, DNA replication, protein synthesis, membrane integrity, or cell cycle regulation. These effects are usually associated with specific phenotypes at the cellular scale. Therefore, understanding the extent and causality of stress-induced growth or viability deficiencies requires a careful analysis of several parameters, both at the single-cell and at the population levels. The experimental strategy presented here combines traditional optical density monitoring and plating assays with single-cell analysis techniques such as flow cytometry and real time microscopy imaging in live cells. This multiscale framework allows a time-resolved description of the impact of stress conditions on the fate of a bacterial population.

This protocol allows a time-resolved description of bacterial growth under stress conditions at the single-cell and the cell population levels.

Stres Tedavileri Altında Bakteriyel Büyümenin Çok Ölçekli Analizi

Analysis of the bacterial ability to grow and survive under stress conditions is essential for a wide range of microbiology studies. It is relevant to ...

Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

Microfluidic technology overcomes many of the limitations to traditional analytical methods in microbiology. Unlike bulk-culture methods, it offers single-cell resolution and long observation times spanning hundreds of generations; unlike agarose pad-based microscopy, it has uniform growth conditions that can be tightly controlled. Because the continuous flow of growth medium isolates the cells in a microfluidic device from unpredictable variations in the local chemical environment caused by cell growth and metabolism, authentic changes in gene expression and cell growth in response to specific stimuli can be more confidently observed. Bacillus subtilis is used here as a model bacterial species to demonstrate a &#34;mother machine&#34;-type method for cellular analysis. We show how to construct and plumb a microfluidic device, load it with cells, initiate microscopic imaging, and expose cells to a stimulus by switching from one growth medium to another. A stress-responsive reporter is used as an example to reveal the type of data that may be obtained by this method. We also briefly discuss further applications of this method for other types of experiments, such as analysis of bacterial sporulation.

Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

We present a method for the microfluidic analysis of individual bacterial cell lineages using Bacillus subtilis as an example. The method overcomes shortcomings of traditional analytical methods in microbiology by allowing observation of hundreds of cell generations under tightly controllable and uniform growth conditions.

Bacillus subtilis tek hücreli mikrosıvısal analizi

Microfluidic technology overcomes many of the limitations to traditional analytical methods in microbiology. Unlike bulk-culture methods, it offers ...

Biyoloji

Using Microtiter Dish Radiolabeling for Multiple In Vivo Measurements Of Escherichia coli (p)ppGpp Followed by Thin Layer Chromatography

The (p)ppGpp nucleotide functions as a global regulator in bacteria in response to a variety of physical and nutritional stress. It has a rapid onset, in seconds, which leads to accumulation of levels that approach or exceed those of GTP pools. Stress reversal occasions a rapid disappearance of (p)ppGpp, often with a half-life of less than a minute. The presence of (p)ppGpp results in alterations of cellular gene expression and metabolism that counter the damaging effects of stress. Gram-negative and Gram-positive bacteria have different response mechanisms, but both depend on (p)ppGpp concentration. In any event, there is a need to simultaneously monitor many radiolabeled bacterial cultures at time intervals that may vary from 10 seconds to hours during critical stress transition periods. This protocol addresses this technical challenge. The method takes advantage of temperature- and shaker-controlled microtiter dish incubators that allow parallel monitoring of growth (absorbance) and rapid sampling of uniformly phosphate-radiolabeled cultures to resolve and quantitate nucleotide pools by thin-layer chromatography on PEI-cellulose. Small amounts of sample are needed for multiple technical and biological replicates of analyses. Complex growth transitions, such as diauxic growth and rapid (p)ppGpp turnover rates can be quantitatively assessed by this method.

Using Microtiter Dish Radiolabeling for Multiple In Vivo Measurements Of Escherichia coli pppGpp Followed by Thin Layer Chromatography

The growth of radiolabeled bacterial cultures in microtiter dishes facilitates high throughput sampling that allows multiple technical and biological replicate assays of nucleotide pool abundance, including that of (p)ppGpp. The effects of growth transitions provoked by sources of physiological stress as well as recovery from stress can be monitored.

Ince katman Kromatografi takip Escherichia coli (p) ppGpp çoklu In vivo ölçümleri Için mikrotiter bulaşık Radiolabeling kullanma

The (p)ppGpp nucleotide functions as a global regulator in bacteria in response to a variety of physical and nutritional stress. It has a rapid onset, in ...

Bakteriyel büyüme kesin, yüksek üretilen iş analizi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bakterilerde protein RNA bağlayıcı ölçümü için bir tahlil

Salmonella Fitness yüksek verimlilik analizi için dijital PCR tabanlı rekabetçi endeksi

Bir mikroplaka okuyucu kullanarak bakteri üreme verilerinin yüksek verimli nicelleştirilmesinin gelişmiş tekrarlanabilirliği ve hassasiyeti

Bir mikroplaka okuyucu kullanarak bakteri üreme verilerinin yüksek verimli nicelleştirilmesinin gelişmiş tekrarlanabilirliği ve hassasiyeti

ScanLag: Yüksek verim Colony Büyüme niceliksel ve Zaman Lag

Faj Phenomics: Fizyolojik Yaklaşımlar Roman Viral Proteinler karakterize etmek

Zaman Atlamalı Mikroskopi Kullanılarak Escherichia Coli'de Biyolojik Gürültünün Sürekli Ölçümü

Stres Tedavileri Altında Bakteriyel Büyümenin Çok Ölçekli Analizi

Bacillus subtilis tek hücreli mikrosıvısal analizi

Ince katman Kromatografi takip Escherichia coli (p) ppGpp çoklu In vivo ölçümleri Için mikrotiter bulaşık Radiolabeling kullanma