Name: precise, high-throughput analysis of bacterial growth
Uploaded: 2017-09-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Precise, High-throughput Analysis of Bacterial Growth at JoVE.com

Yazarlar ifşa gerek yok.

1. büyüme orta hazırlama Not: en az orta M63 kimyasal bileşimi gibidir: 62 mM K 2 HPO 4, 39 mM KH 2 PO 4, 15 mM (NH 4) 2 SO 4, 1.8 µM FeSO 4, 15 µM tiamin-HCl, 0.2 mM MgSO 4 ve 22 mM glikoz. M63 üç hisse senedi çözümleri karıştırılarak yapılır: beş X çözüm, % 20 glikoz ve MgSO 4 tiamin çözüm. Saat 4'te tüm çözümler depolamak ° C.
<ol><li><ol><li>5 X çözüm FeSO 4 çözüm, hazırlamak için hazırlanıyor bir elektrik pipet ve tek kullanımlık serolojik pipet GKD 2 O 50 mL santrifüj tüpü eklemek için kullanın. Bir P-200 0,06 mL HCl 0.01 M HCl. ekleyin 36 mg FeSO 4-7 H 2 O elde edilir ve iyice karıştırın eklemek için kullanın.</li>
		<li>160 mL GKD 2 O ölçüm silindir ölçmek ve 500 mL kabı için ekleyin. Bu sırada aşağıdakileri ekleyin: 10,72 g K 2 HPO 4, 5,24 g KH 2 PO 4, 2.0 g (NH 4) 2 SO 4 ve 0.5 mL (1.1.1. adımda hazırlanan) FeSO 4 çözüm.</li>
		<li>Hassas pH metre, kullanarak, 7.0 pH 2 M KOH ekleyerek ayarlayın. GKD 2 O toplam hacmi 200 mL için eklemek ve bir ölçüm silindir çözüm dökün. 250 mL filtrasyon ünitesi (PVDF, 0,22 µM) kullanarak çözüm sterilize.</li>
	</ol></li> <li>% 20 glikoz çözüm hazırlama <ol><li>200 mL GKD 2 O ölçüm silindir ölçüp 500 mL kabı dök. Manyetik karıştırıcı kullanarak karıştırma sırasında 50 gr şekeri ekleyin. Bir ölçüm silindir 250 mL toplam hacmiyle çözümde sulandırmak. 1.1.3. adımda açıklandığı gibi çözüm sterilize.</li>
	</ol></li> <li>MgSO 4 tiamin çözüm hazırlama <ol><li>150 mL GKD 2 O 500 mL kabı için ekleyin. Manyetik karıştırıcı ile karıştırma sırasında 1.0 g tiamin-HCL ve MgSO 4-7 H 2 O. Dilute çözüm 10 g toplam hacmi 200 mL için bir ölçüm silindir ekleyin. 1.1.3. adımda açıklandığı gibi çözüm sterilize.</li>
	</ol></li> <li>En az orta M63 hazırlama <ol><li>5 X çözüm, % 20 glikoz çözüm, MgSO 4 tiamin çözüm, elektronik bir pipet, P-200 pipet ve 200-µL pipet ipuçları temiz bir bankta yerleştirin.</li>
		<li>Ölçmek 155.8 mL GKD 2 O ölçüm bir silindir ve 500 mL kabı dökün.</li>
		<li>Elektronik pipet ve tek kullanımlık serolojik pipet, kullanarak Ekle beş X çözüm ve 4 mL % 20 glikoz çözüm 40 mL ölçülen GKD 2 için O. Daha sonra 0.2 mL MgSO 4 tiamin çözüm P-200 ile ekleyin. 1.1.3. adımda açıklandığı gibi çözüm sterilize.</li>
	</ol></li></ol> 2. Gliserol stok hazırlanması <ol><li>hücre kültür Not: bakteri suşları (örneğin, W3110 ve onun azaltılmış genleri) yük banka kuruluşlardan mevcuttur. Suşlarının agar plakaları koloniler şeklinde genellikle elde edilir.
	<ol><li>Silikon kauçuk Stoper, elektronik bir pipet, P-1,000, 1.000-µL pipet ipuçları, P-200, 200-µL pipet ipuçları ve temiz bir Bank üzerinde hedef suşları (kolonileri plakaları) ile beş steril cam tüplerin yerleştirin.</li>
		<li>Cam tüp Bunsen Burner ağız silikon kauçuk tıpa açmadan önce ortaya çıkarmak. Tüp açıldıktan sonra silikon kauçuk tıpa aleve maruz ve hafifçe kap cam tüp geri yerleştirin.</li>
		<li>5 mL M63 bir cam tüpler ve diğer dört tüpler için 4.5 mL M63 eklemek için elektronik pipet ve tek kullanımlık serolojik pipet kullanın.</li>
		<li>Bir koloni alıp 5 mL M63 içeren cam tüpte aşılamak için P-200 ipucu kullanın.</li>
		<li>Bir süspansiyon yapmak için girdap tüp. O zaman, çözüm 10 kat seyreltik tarafından Bu çözümün 0.5 mL 4.5 mL M63 içeren dört tüpler birine transfer.</li>
		<li>Kalan tüpler 2.1.5. adımda açıklanan işlemi yineleyin. Beş farklı konsantrasyonları ile seyreltme serisi (dilutions 1, 10, 100, 1000 ve 10.000) şimdi hazırdır.</li>
		<li>Cam tüp ve 2.1.2. adımda açıklandığı gibi silikon kauçuk stoper ağızlarını sterilize. Stoper tüplerini kap. Kontaminasyon silikon kauçuk stoper kırışıklıklar değil.</li>
		<li>Önceden ısıtılmış sallayarak kuluçka 37 ° C'de beş tüpler yerleştirin ve 200 devir / dakikada sallamak. Kültür gecede veya 10-30 h. için kuluçkaya</li>
	</ol></li> <li>Seçimi gliserol hisse senedi için kültür <ol><li>Önceden ısıtılmış oda sıcaklığında M63 orta, P-1,000, 1.000-µL pipet ipuçları ve tek kullanımlık bir küvet temiz bir bankta yerleştirin.</li>
		<li>Ekle 1000 µL M63 tek kullanımlık bir küvet için bir P-1, 000 ile. Tek kullanımlık küvet bir Spektrofotometre yerleştirin, sabit bir dalga boyu 600 adlı programını başlatmak nm ve ölçü birimi boş.</li>
		<li>Beş cam tüpler temiz kürsüye sallayarak kuluçka taşımak.</li>
		<li>Atmak M63 tek kullanımlık küvet gelen ve aynı tek kullanımlık küvet bir P-1, 000 ile 1.000 µL kültür ekleyin. 2.2.2. adımda açıklandığı gibi hücre kültürü (OD 600) optik bulanıklık ölçmek. 
		Not: herhangi bir kontaminasyon ve hassas bir ölçüm elde etmek için cam boru ve açıklandığı gibi alev ve girdap kültür önce örnekleme stoppers maruz. Özellikle hücre yoğunluğu düşük olduğu zamanlarda güvenilir sonuçlar alabilmek için tekrarlanan ölçüler, tavsiye edilir.</li>
		<li>Beş hücre kültürleri, erken üstel büyüme aşamasında birini (OD 600 = 0,01 - 0,05) gliserol hisse senedi için. 
		Not: birden çok kültürü yoğunlukları optimum menzili içinde varsa, 0,05 en yakın yaygın olarak seçili.</li>
	</ol></li> <li>Tekrarlanan testleri için gliserol hisse senedi olun. 
	Not: Bu on hisse senetleri hazırlamak için tanımlanır. Daha büyük veya daha küçük miktarlarda deneysel gereksinimlerine göre yapılabilir.
	<ol><li>Steril % 60 gliserol çözüm getirin, on 1.5 mL mikrotüpler, P-1,000 sterilize ve P-200, 1000 ve 200 µL pipet ipuçları ve bir microtube stand temiz bir bankta.</li>
		<li>Ekleyin 250 µL sterilize % 60 gliserol çözüm ve 1.5 mL microtube ve mix için seçili hücre kültürünün 750 µL tarafından pipetting. 
		Not: Stok birimi değişkendir, ancak her zaman % 60 gliserol hücre kültürü için 1:3 oranını korumak; Bu % 15 gliserol son bir konsantrasyon sonuçlanır.</li>
		<li>Kalan dokuz mikrotüpler microtube tribünde yer ve her tüpün 2.3.2. adımda hazırlanan karışımı 100 µL dağıtmak. Şimdi ileride kullanmak için on aynı gliserol hisse senedi vardır.</li>
		<li>Derin dondurucu-80, hisse senetleri depolamak ° C.</li>
	</ol></li></ol> 3. Büyüme eğrileri elde <ol><li>yukarıya Mikroplaka okuyucu ayarlama. 
	Not: (bkz: malzemeler tablo) plaka okuyucu kullanılan belirli phrasing burada kullanılan tırnak işaretleri gösterisinde gösterilen koşulları.
	<ol><li>Açık belgili tanımlık bilgisayar yazılımı. Açık &#34; iletişim kuralları &#34; içinde &#34; Görev Yöneticisi &#34; ve seçin &#34; Yeni Oluştur &#34;. Seçin &#34; standart protokol &#34;.</li>
		<li>Aç &#34; yordam &#34; ve ayarlarını yapın. Açık &#34; sıcaklık ayarla &#34; ve seçin &#34; kuluçka makinesi üzerinde &#34;. Ayarla &#34; sıcaklık &#34; 37 ° c ve &#34; degrade &#34; 0 ° C. onay &#34; Onceden &#34; sonraki adımla devam etmeden önce. Açık &#34; başlatmak Kinetik &#34;, set &#34; çalışma zamanı &#34; için 24:00:00 ya da 48:00:00, ve &#34; aralığı &#34; 00:30:00 ve 01:00:00 için. 
		Not: Tüm 96 de plaka okumak için yaklaşık 1 dakika sürer.</li>
		<li>Aç &#34; sallamak &#34; ve &#34; sallamak modu &#34; olarak &#34; lineer &#34;. Kontrol &#34; Constitution sallamak &#34; ve &#34; frekans &#34; 567 BGBM. Açık &#34; okuma &#34;, kontrol &#34; Absorbans &#34;, &#34; son nokta/Kinetik &#34;, ve &#34; Monochromators. &#34; ayarla &#34; dalga boyu &#34; 600.</li>
		<li>Tıklama &#34; doğrula &#34; yordam doğru olduğunu onaylamak için. ' I tıklatın &#34; kurtarmak &#34; ileride kullanmak üzere yeni bir program olarak kaydetmeyi.</li>
	</ol></li> <li>Gerçek zamanlı büyüme kayıt <ol><li>aşısını kültür örnekleri 96-şey plaka üzerinde konumlarını belirtmek için bir 96-şey plaka sembol (8 × 12 tablo) çizin. Tablo baskı ve deneme için bir başvuru olarak kullanın. 
		Not: Mikroplaka kenarlarında bulunan kuyu yalnızca buharlaşma nedeniyle boş orta içermelidir.</li>
		<li>Yer sterilize edilmiş bir 96-şey düz alt Mikroplaka kapak, P-1000, 1000-µL pipet ipuçları, P-200, 200-µL pipet ipuçları, birkaç 1.5 mL mikrotüpler, bir 8-çok kanallı pipet, steril reaktif su deposu, oda sıcaklığında M63 ve gliserol ile temiz bir banka hisse senetleri (2.3 adımda hazırlanan).</li>
		<li>Yaklaşık 25 mL M63 reaktif havzanın ekleyin. Bu depo stok için aşağıdaki adımların tümünü kullanın.</li>
		<li>Ekleyin 900 µL M63 mikrotüpler seri dilutions yapmak için hazırlık için.</li>
		<li>Gliserol stok oda sıcaklığında erimek. 900 µL eklemek M63 çözdürülen gliserol hisse senedi ve girdap. Bu orijinal gliserol hisse senedi 10 kat bir seyreltme içinde sonuç.</li>
		<li>900 µL M63 ve girdap içeren başka bir microtube için 10 kat seyreltme transfer 100 µL. Bu 100-fold bir seyreltme olur.</li>
		<li>Tekrarlama adım dilutions için istediğiniz sayıyı elde kadar 3.2.6.</li>
		<li>Doldurmak wells 200 µL M63 kullanarak Mikroplaka kenarında bir 8 kanallı pipet (P-200). 
		Not: Bu kuyu boş kullanılabilir.</li>
		<li>Yük 200 µL her adımda 3.2.4 - 3.2.7 başvuru tablosu (Adım 3.2.1) göre Mikroplaka wells için hazırlanan örnek seyreltilmiş. Girdap seyreltilmiş numune önceden yükleme ve yük aynı örnek birden çok Wells için çeşitli konumları plaka üzerinde.</li>
		<li>96-şey Mikroplaka plaka okuyucu üzerinde yerleştirin.</li>
		<li>Aç &#34; okunur Şimdi &#34; içinde &#34; Görev Yöneticisi &#34; ve program (Bölüm 3.1) seçin. ' I tıklatın &#34; Tamam &#34; ölçümünü başlatmak için. Veri analizi (Bölüm 4) için yeni bir deneysel dosya kaydı saklamak.</li>
	</ol></li></ol> 4. Veri analizi <ol><li>verme bir USB bellek için gerçek zamanlı büyüme hızında veri (Bölüm 3.2) sonuçlarını bir metin dosyası olarak sopa. 
	Not: Bir 96-iyi biçimlendirilmiş sonuçlar (eğriler) plaka okuyucu gerçek zamanlı olarak görüntülenir. Saatlik kayıtları (OD değerleri) bir tablo olarak verilebilir; satır ve sütunları iyi numarası (örneğin, A1, B1) ve ölçüm saat (örneğin, 00:00:59) temsil sırasıyla.</li>
	<li>Elektronik tablo yazılımı ile metin dosyası açın.</li>
	<li>Saatlik OD 600 okur 96-şey Mikroplaka sayısı daha fazla çözümleme için yeni bir çalışma sayfasına kopyalayın.</li>
	<li>Arka plan okur, çıkarma zaman her örneğinin saatlik okuma sıfırdan de. 
	Not: kolaylık sağlamak için boş ortalama değerini içeren M63 kuyuları (Adım 3.2.8)-ebilmek var olmak kullanılmış ile arka plan değeri.</li>
	<li>Maksimal nüfus yoğunluğu tahmin etmek için beş ardışık OD 600 okuma ortalamasını hesaplamak. 
	Not: Maksimal OD 600 karşılık gelen büyüme eğrisi beş ardışık OD 600 okuma en büyük ortalama değeri tanımlanır.</li>
	<li>Hesaplamak büyüme oranı, μ (s -1), tüm çift ardışık değerleri aşağıdaki denklemi OD 600 uygulayarak: 
	<img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56197/56197eq1.jpg" /> Not: Bu denklemde ben C ve C ı + 1 herhangi iki ardışık zaman nokta (Ben t ve t ı + 1, OD 600 değerleri temsil sırasıyla). Doğal logaritma LN gösterir.</li>
	<li>Zamanla büyüme oranı değişiklikleri saatlik OD 600 dayalı Calculate adım 4,6 göre okur. Ortalama ve standart sapma maksimum büyüme oranı tahmin etmek için beş ardışık büyüme oranları hesaplamak. 
	Not: En büyük ortalama en küçük standart sapma ile ilgili büyüme eğrisi maksimal büyüme oranı tanımlanır.</li>
</ol> 5. 96-iyi okur (isteğe bağlı) genel önyargı teyit Not: her iki plaka okuyucu ve tüketim 96-şey plaka önyargılı ölçümleri neden olabilir. Son derece hassas ve tekrarlanabilir sayısal sonuçlar elde etmek için genel önyargı 96-şey plaka teyit önerilir.
<ol><li>96-şey plaka ve plaka okuyucu için önyargı testi 3.2.2 bölümünde açıklandığı şekilde hazırlayın.</li>
	<li>Ekle 20 mL steril 50 mL santrifüj tüpü M63. Gliserol stok aynı santrifüj tüpü ve girdap ekleyin. Askıya alınmış çözüm bir steril reaktif rezervuar transfer.</li>
	<li>Askıya alınmış çözüm 200 µL 96-şey plakasına aktarmak için bir 8 kanallı pipet kullanın.</li>
	<li>96-şey plaka plaka okuyucu üzerinde yerleştirin ve ölçüm başlar.</li>
	<li>Kayıt OD 600 saatlik okur ve 4 bölümde açıklandığı gibi analiz. 96-iyi okur gerektirebileceği önyargı belirlemek için her şey hesaplanan maksimal büyüme oranı ve nüfus yoğunluğu karşılaştırın.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Kovarova-Kovar, K., Egli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+kinetics+of+suspended+microbial+cells:+from+single-substrate-controlled+growth+to+mixed-substrate+kinetics.">Growth kinetics of suspended microbial cells: from single-substrate-controlled growth to mixed-substrate kinetics.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 62 (3), 646-666 (1998).</li><li>Soupene, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+studies+of+Escherichia+coli+strain+MG1655:+growth+defects+and+apparent+cross-regulation+of+gene+expression.">Physiological studies of Escherichia coli strain MG1655: growth defects and apparent cross-regulation of gene expression.</a> J Bacteriol. 185 (18), 5611-5626 (2003).</li><li>Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D'Ari, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+physiology+in+Luria-Bertani+broth.">Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth.</a> J Bacteriol. 189 (23), 8746-8749 (2007).</li><li>Egli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+growth+and+physiology:+a+call+for+better+craftsmanship.">Microbial growth and physiology: a call for better craftsmanship.</a> Front Microbiol. 6, 287 (2015).</li><li>Kurokawa, M., Seno, S., Matsuda, H., Ying, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+genome+reduction+and+bacterial+growth.">Correlation between genome reduction and bacterial growth.</a> DNA Res. 23 (6), 517-525 (2016).</li><li>Matsumoto, Y., Murakami, Y., Tsuru, S., Ying, B. W., Yomo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+rate-coordinated+transcriptome+reorganization+in+bacteria.">Growth rate-coordinated transcriptome reorganization in bacteria.</a> BMC Genomics. 14, 808 (2013).</li><li>Nahku, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+growth+rate+dependent+transcriptome+profiling+of+Escherichia+coli+K12+MG1655+in+accelerostat+cultures.">Specific growth rate dependent transcriptome profiling of Escherichia coli K12 MG1655 in accelerostat cultures.</a> J Biotechnol. 145 (1), 60-65 (2010).</li><li>Dai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+translating+ribosomes+enables+Escherichia+coli+to+maintain+elongation+rates+during+slow+growth.">Reduction of translating ribosomes enables Escherichia coli to maintain elongation rates during slow growth.</a> Nat Microbiol. 2, 16231 (2016).</li><li>Madrid, R. E., Felice, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+biomass+estimation.">Microbial biomass estimation.</a> Crit Rev Biotechnol. 25 (3), 97-112 (2005).</li><li>Harris, C. M., Kell, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+estimation+of+microbial+biomass.">The estimation of microbial biomass.</a> Biosensors. 1 (1), 17-84 (1985).</li><li>Yates, G. T., Smotzer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+lag+phase+and+initial+decline+of+microbial+growth+curves.">On the lag phase and initial decline of microbial growth curves.</a> J Theor Biol. 244 (3), 511-517 (2007).</li><li>Kargi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-interpretation+of+the+logistic+equation+for+batch+microbial+growth+in+relation+to+Monod+kinetics.">Re-interpretation of the logistic equation for batch microbial growth in relation to Monod kinetics.</a> Lett Appl Microbiol. 48 (4), 398-401 (2009).</li><li>Peleg, M., Corradini, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+growth+curves:+what+the+models+tell+us+and+what+they+cannot.">Microbial growth curves: what the models tell us and what they cannot.</a> Crit Rev Food Sci Nutr. 51 (10), 917-945 (2011).</li><li>Sprouffske, K., Wagner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growthcurver:+an+R+package+for+obtaining+interpretable+metrics+from+microbial+growth+curves.">Growthcurver: an R package for obtaining interpretable metrics from microbial growth curves.</a> BMC Bioinformatics. 17, 172 (2016).</li><li>Hall, B. G., Acar, H., Nandipati, A., Barlow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+rates+made+easy.">Growth rates made easy.</a> Mol Biol Evol. 31 (1), 232-238 (2014).</li><li>Hermsen, R., Okano, H., You, C., Werner, N., Hwa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+growth-rate+composition+formula+for+the+growth+of+E.coli+on+co-utilized+carbon+substrates.">A growth-rate composition formula for the growth of E.coli on co-utilized carbon substrates.</a> Mol Syst Biol. 11 (4), 801 (2015).</li><li>Engen, S., Saether, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=r-+and+K-selection+in+fluctuating+populations+is+determined+by+the+evolutionary+trade-off+between+two+fitness+measures:+Growth+rate+and+lifetime+reproductive+success.">r- and K-selection in fluctuating populations is determined by the evolutionary trade-off between two fitness measures: Growth rate and lifetime reproductive success.</a> Evolution. 71 (1), 167-173 (2017).</li></ol>

Kohei Tsuchiya CFU tahlil örnek verdiğiniz için teşekkür ederiz. Bu eser kısmen maddi bir Grant-in-Aid tarafından bilimsel araştırma (C) No 26506003 için (BWY) Milli Eğitim Bakanlığı, kültür, spor, bilim ve teknoloji, Japonya desteklenmiştir.

Kritik adımlar protokolündeki hücreleri ve çeşitli pozisyonlarda Mikroplaka üzerinde birden fazla Wells aynı örnekleri çoğaltmasını katlanarak büyüyen bir hisse senedi hazırlanması içerir. Daha önce microbiologists bir gece öncesi Kültür Kültür başladı. Bu yöntem Bakteriyel büyüme gecikme süresini azaltmak iken, tekrarlanabilir büyüme eğrileri elde etmek zordur. Şekil 2' de gösterildiği gibi ortak gliserol hisse senetleri kullanarak bağımsız ölçüleri tekrarlanabilir ve kesin sonuçlar sağlar hemen hemen aynı büyüme eğrileri, sonuçlandı. Şekil 3' te gösterildiği gibi kuyu çeşitli yerlerinde biraz farklı okuma, ölçümlerin küresel arka plan kabul edileceği ver. Bakteriyel büyüme kantitatif değerlendirilmesi için bu arka plan düşünülmelidir. Örnekleri çeşitli plaka yerlerde deneysel çoğaltma için birden çok kuyu için aşı için küresel eğilimler hesap önerilir.
Hataları işleme ek olarak, değişiklik ve deneysel cihazları ve malzemeleri elde sorun giderme düşünülmelidir. Birkaç gelişmiş Mikroplaka Okuyucular ticari olarak kullanılabilir. Onlar ışık dalga boyu, Isıtma veya soğutma, modunu ayarlama yöntemi gibi özellikleri ve şekilde ve sallayarak frekans geniş bir varyasyon göstermektedir. Sıvı cilt değişiklikleri büyük ölçüde OD600 okuma etkiler çünkü bizim deneyime dayalı, buharlaşma yüksek üretilen iş çalışmalarda ele alınmalıdır. Buharlaşma Mikroplaka Okuyucular ve Mikroplaka Mimarlık tarafından kullanılan Isıtma yöntemi nedeniyle oluşur. Isıtma yaygın olarak uygulanan ticari Mikroplaka Okuyucular iki mod tarafından sıcak hava ısıtma ve sıcak bir tabak ile Isıtma. Bu protokol için kullanılan Mikroplaka okuyucu sıcak plaka Mikroplaka ortamda hızla esen sıcak hava kadar kuru çünkü buharlaşma azaltmak için bir Isıtma yöntemi olarak kullanılır. Mikroplaka da dikkatle seçilmesi gerekir. Farklı 96-şey Mikroplaka (ile kapakları) farklı düzeylerde buharlaşma neden. Açıklanan yöntemi buharlaşma azaltır derin bir kapalı kapak ile plaka biçimi kullanır.
Çalışma durağan faz analiz büyüme eğrisi gerektiriyorsa, Ayrıca, sonra bir şekilde ve Mikroplaka okuyucu sallayarak frekans dikkate alınmalıdır. Kültür sırasında sallayarak büyüyen hücreler aynı şekilde medyada askıya sağlar. Uygunsuz sallayarak veya düşük frekans etrafında iyi kenar veya daha düşük ya da yüksek--dan gerçek okuma yanlış okuma sonuçlanan bir yüksek yoğunluklu merkezde yığmak hücre neden olabilir. Sallayarak açıklanan yöntemi kullanır doğrusal, çift yönlü. 8 şeklinde sallayarak modu muhtemelen yeterli olsa da, biz sallayarak dairesel modu önermiyoruz.
Önemli Bu yöntem hücre kültür orta buharlaşma kısıtlamasıdır. Maksimal kültür hacmi küçük olduğu için Yani, 200 µL, kuluçka 37 ° C'de önemli buharlaşma neden olur. Bu nedenle, bu yöntem 48 h. daha uzun süre Ayrıca kültür için uygun değildir, optik algılama (OD600) bu yoğunluğu sınırlı olduğundan düşük yoğunluklu hücre kültürleri kaçınılmalıdır. Onlar daha uzun zaman gerektirir ve OD600algılama sınırın altına birlikte düşünüldüğünde, çok yavaş büyüyen hücreler/suşları veya çok düşük başlangıç konsantrasyonu kültürler tercih edilen, etkilenmez.
Bu yöntem için sistematik araştırmalar son derece avantajlı olan hassas, yüksek üretilen iş ölçümler verir. Temsil edici bir sonuç olarak, kolayca ve tekrarlanarak E. coli suşlarının çeşitli genom dizileri ve/veya orta ile bir ürün yelpazesine değerlendirmek için bu yöntem sağlar5. Tüplerde kültür ve el ile örnekleri farklı zaman noktalarda ölçüm geleneksel yöntemlerle karşılaştırıldığında, açıklanan daha az emek ve zaman yoğun yöntemidir. Gelecekteki uygulamaları ve geliştirme yöntemi otomasyon deneysel manipülasyon ve sayısal analiz dahil kabul edilir. Otomatik ölçüm ve robotik uygulama olan hücre büyümesini değerlendirilmesi ve bakteriyel ve memeli hücreleri kullanarak hayatta kalma testleri son derece verimli ve güvenilir bir yönteme yol açacaktır.

Mikrobiyolojik çalışmalar genellikle bakteriyel hücre kültürü ve bakteri fizyolojisi1,2,3temel bir fenomen temsil Bakteriyel büyüme eğrileri değerlendirilmesi ile başlar. Bakteri kültürü bir temel metodoloji olduğundan temel kültür ilkeleri yaygın olarak Yayınlanan araştırma edebiyat ve ders kitapları mevcuttur. Tezgah düzeyinde önemli dikkat geleneksel büyüme medya en iyi duruma getirme ve koşullar kültür üzerinde yoğunlaştı ancak büyüme hızını denetleme, hangi büyük olasılıkla mikrobiyal fizyoloji, daha büyük anlayış sağlayacak olmamıştır 4yaygın olarak okudu. Katlanarak bakteri için hücresel devlet anahtar parametresini genom, transcriptome ve Proteom5,6,7,8 ile koordineli olduğu bildirilen büyüme oranı büyüyor . Böylece, Bakteriyel büyüme kantitatif değerlendirilmesi mikrobiyal Fizyoloji anlamak için önemlidir.
Bakteriyel büyüme değerlendirmek için biyokütle tahmin etmek için kullanılan deneysel yöntemleri de kurulan9,10 ve optik bulanıklık gibi biyokimyasal, fiziksel veya biyolojik parametreleri algılama temel alır. Buna ek olarak, büyüme değişiklikleri dinamik özelliklerini yakalamak için kullanılan analitik yöntemleri yaygın olarak kurulan doğrusal olmayan modelleri11,12,13, örneğin, lojistik denklemler temel alır. Büyüme dinamikleri genellikle hücre büyüme kültür zamanlanmış örnekleme tarafından optik bulanıklık ölçüm veya koloni oluşturan birim (CFU) deneyleri performans elde edilir. Bu kültür ve algılama yöntemleri sınırlandırılması veri noktaları nüfus dinamikleri gerçek bir yansımasıdır ölçüm aralıkları genellikle saat içinde olduğu için ve çünkü değildir kültür durumu (örneğin, sıcaklık değişiklikleri ve Havalandırma) örnekleme anda bozulmuştur. Kültür ve analiz teknikleri teknoloji ve anlayış son gelişmeler kullanarak güncelleştirilmiş olması gerekir. Mikroplaka Okuyucular son gelişmeler bakterilerin büyüme gerçek zamanlı gözlem izin ve işçilik maliyetleri önemli ölçüde azaltabilirsiniz. Bu gelişmiş cihazlar kullanarak, Bakteriyel büyüme üzerinde son çalışmaları için yüksek üretilen iş ölçümleri14,15analitik yöntemleri bildirdi.
Bu iletişim kuralı, hassas büyüme dinamikleri sonuçta nasıl büyüme oranı belirlenir ve büyüme oranı ne etken etkiler sorular adresi nicel çalışmalar için değerli olacaktır yüksek üretilen iş bir şekilde değerlendirmek için amaçtır. Protokol bakterilerin büyüme tekrarlanabilir ve hassas Nefelometri için dikkate alınması gereken tüm faktörler ele alır. Deneysel yöntem ve analiz ana metin ayrıntılarıyla açıklanmıştır. Bu yöntem Bakteriyel büyüme kesin ve tekrarlanabilir analizini bir yüksek-den geçerek şekilde izin verir. Microbiologists bu iletişim kuralı ek nicel sonuçları onların deneysel kanıt türetmek için kullanabilirsiniz. Bu iletişim kuralı kavramsal sonuçlara ulaşmak için veya büyüme teorik bir bakış elde etmek için çalışan sistemleri Biyoloji çalışmaları için de kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Wako</td><td>164-04295</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Wako</td><td>166-04255</td><td></td></tr><tr><td>(NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Wako</td><td>019-03435</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;-7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Wako</td><td>138-00415</td><td></td></tr><tr><td>Thiamine-HCl</td><td>Wako</td><td>201-00852</td><td></td></tr><tr><td>glucose</td><td>Wako</td><td>049-31165</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Wako</td><td>080-01066</td><td></td></tr><tr><td>Iron (II) sulfate heptahydrate (FeSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;-7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Wako</td><td>094-01082</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Wako</td><td>168-21815</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Wako</td><td>075-00611</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge tube (50 mL, sterilized)</td><td>WATSON</td><td>1342-050S</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Tips, 200 &amp;micro;L</td><td>WATSON</td><td>110-705Y</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Tips, 1,000 &amp;micro;L</td><td>WATSON</td><td>110-8040</td><td></td></tr><tr><td>Microtube (1.5 mL)</td><td>WATSON</td><td>131-715C</td><td></td></tr><tr><td>8 multichannel-pipette</td><td>WATSON</td><td>NT-8200</td><td></td></tr><tr><td>PASORINA STIRRER</td><td>AS ONE</td><td>2-4990-02</td><td></td></tr><tr><td>Glass cylinder (200 mL)</td><td>AS ONE</td><td>1-8562-07</td><td></td></tr><tr><td>Precision pH mater</td><td>AS ONE</td><td>AS800 / 1-054-01</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P-200</td><td>GILSON</td><td>1-6855-05</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P-1000</td><td>GILSON</td><td>1-6855-06</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Serolocical Pipettes (10 mL)</td><td>SANPLATEC</td><td>SAN27014</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Serolocical Pipettes (25 mL)</td><td>SANPLATEC</td><td>SAN27015</td><td></td></tr><tr><td>Microtube stand</td><td>BM Bio</td><td>801-02Y</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>BM Bio</td><td>BM-V1</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar 96-well microplate with lid (Flat bottom, Clear)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Corning, 3370</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar reagent reservoir (50 mL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Corning, 4870</td><td></td></tr><tr><td>Stericup GV PVDF (250 mL, 0.22 &amp;micro;M)</td><td>Merck Millipore</td><td>SCGVU02RE</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Aid XP</td><td>DRUMMOND</td><td>4-000-101</td><td></td></tr><tr><td>Bioshaker (BR-23UM MR)</td><td>TAITEC</td><td>0053778-000</td><td></td></tr><tr><td>Disposal cell (1.5 mL)</td><td>Kartell</td><td>1938 / 2-478-02</td><td></td></tr><tr><td>DU 730 Life Science UV/Vis Spectrophotometer</td><td>Beckman Coulter</td><td>A23616</td><td></td></tr><tr><td>EPOCH2</td><td>BioTek</td><td>2014-EP2-002 / EPOCH2T</td><td></td></tr><tr><td>Beaker (500 mL)</td><td>IWAKI</td><td>82-0008</td><td></td></tr><tr><td>BIO clean bench</td><td>Panasonic</td><td>MCV-B131F</td><td></td></tr><tr><td>Glass tubes</td><td>NICHIDEN RIKA GLASS</td><td>P-10M~P-30 /101019</td><td></td></tr><tr><td>Silicone rubber stoppers</td><td>ShinEtsu Polymer</td><td>T-19</td><td></td></tr><tr><td>Bacterial strains</td><td>Strain bank organization; National Bio Resource Project (NBRP) in Japan</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

precise, high-throughput analysis of bacterial growth

Bakteriyel büyüme, modern mikrobiyal Fizyoloji geliştirilmesi, hem de sistem düzeyinde hücre dinamiği soruşturma merkezi bir kavramdır. Son yıllarda yapılan çalışmalarda bakterilerin büyüme ve genom azaltma ve transcriptome yeniden yapılanma gibi genom-wide olaylar arasındaki ilişkiler bildirdin. Bakteriyel büyüme doğru analiz büyüme bağımlı koordinasyon gen fonksiyonları ve hücresel bileşenleri anlamak için önemlidir. Buna göre bir yüksek-den geçerek şekilde Bakteriyel büyüme kesin kantitatif değerlendirilmesi gereklidir. Ortaya çıkan teknolojik gelişmeler Bakteriyel büyüme çalışmak için kullanılan yöntemlerin güncelleştirmelere izin yeni deneysel araçları sunar. Burada sunulan Protokolü Mikroplaka okuyucu dağlık iyimserlik deneysel bir işlem tekrarlanabilir ve hassas değerlendirme bakterilerin büyüme ile istihdam etmektedir. Bu iletişim kuralı birkaç büyüme değerlendirmek için kullanılan daha önce açıklanan Escherichia coli suşları. Protokol ana adımları aşağıdaki gibidir: çok sayıda küçük şişeleri hisselerinde hücre hazırlık tekrarlanabilir sonuçlar, 96-şey plakaları kullanım için yüksek üretilen iş büyüme değerlendirme ve iki büyük el ile hesaplama ile tekrarlanan testler için parametreleri (örneğin, maksimal büyüme oranı ve nüfus yoğunluğu) büyüme dinamikleri temsil eden. İle karşılaştırıldığında hangi cam tüplerde bitti Ağar kaplamalar zamanında kültürlü hücreleri sayar, geleneksel koloni oluşturan birim (CFU) tahlil, mevcut yöntemi daha etkilidir ve büyüme değişiklikleri daha ayrıntılı geçici kayıt sağlar, ancak bir daha sıkı sahiptir düşük nüfus yoğunluğu algılama limitte. Özet olarak, açıklanan yöntemi kesin ve tekrarlanabilir yüksek üretilen iş analizi kavramsal sonuçlara ulaşmak için veya teorik gözlemler yapmak için kullanılabilir Bakteriyel büyüme için avantajlıdır.

Açıklanan yöntemi dinamik Bakteriyel büyüme sürekli, yüksek üretilen iş bir şekilde çeşitli zaman aralıkları (dakikadan gün saat) birden fazla optik yoğunluk ölçümleri alır bir 96-şey biçimi okuyucu kullanarak yakalamak için bir yol sağlar. E. coli suşlarının çeşitli genleri ifade bir ürün yelpazesine büyüme eğrileri tam olarak tek bir deneyi (şekil 1A) elde edilebilir. Açıklanan yöntemi ile karşılaştırıldığında geleneksel yöntem (CFU tahlil) genellikle daha uzun örnekleme zaman aralıkları (şekil 1B) gerektirir ve birden çok kültür gerekli ise emek yoğun olur. Buna ek olarak, her kültür örnekleme zaman CFU tahlil için tekrarlanan ölçümleri için kullanılan hücre kültürünün küçük bir birim kullanımını gerektirir. Ayrıca, zaman Puan algılama için sınırlı sayıda büyüme oranı ve maksimal OD600doğru hesaplanması için gerekli olan örnekleme noktaları kaçırabilir. Ancak, bir alt algılama sınırı 10 CFU tahlil vardır3 - 104 hücre/mL, en az iki büyüklük daha fazla hassas optik bulanıklık tahlil daha yapma (OD600yaklaşık 10 algılama sınırlaması vardır 0,001 =5 -106 hücre/mL). Açıklanan yöntemi büyüme dynamics sistemleri düzeyi çalışmaları için pratik ve verimli deneysel aracını sağlar.
Bu protokol önemli bir avantajı, bir ortak gliserol stoktan tekrarlanan ölçüler götürüyor. Araştırmacılar herhangi bir zaman ölçeği kültür anda belirlemek için izin verir ve kültürler öngörülemeyen olaylar nedeniyle doymuş engeller nedeniyle birden çok hücre kültürleri çeşitli seyreltme oranlarda erken üstel büyüme aşamasında olması son derece yararlı olduğunu. Kültür ve ölçümler bir büyüme son derece benzer sonuçları sunulan protokolünde Bölüm 2.2 (şekil 2A), açıklandığı gibi farklı seyreltme oranları kullanılarak başlatılan beş kültürlerin hazırlanmıştır ortak stoklarının tekrarladı Dynamics analizi. De üst üste birden fazla büyüme eğrileri tekrarlanan ve bağımsız ölçümleri (N = 6) (şekil 2Büst panel), küçük farkı (2B şekilalt panel), özellikle sırasında veya üssel faz ( ile Şekil 2B, gölgeli alan). Bu sonuçları açıklanan yöntemi son derece tekrarlanabilir sonuçlar sunar öneririz.
96-iyi okur genel önyargı tahmin önerilir. Mevcut yönteminde vahşi tipi E. coli büyüme izleme tarafından küresel önyargı tahmin edilmektedir Bölüm 5 iletişim kuralında tanımlandığı gibi W3110 süzün. Örneğin, veri işleme ve aygıt hataları'küresel dalgalanma temsil eden önemli varyasyon 96 wells (şekil 3A), arasında gösterdi büyüme eğrileri büyüme oranları hesaplanan. Bu hatalar plaka üzerinde çeşitli yerlerde birden fazla kuyu içine aynı örnek yükleyerek maskelenebilir. Yavaş yavaş değişiklikler düşey yönde gözlendi gibi buna karşılık, maksimal OD600 sonuçları için açık konumu bağımlı eğilimler gösterdi, maksimal OD600 yavaş yavaş sütun 2 kuyulardan bu birine arttı sütun 11 96-şey plaka (şekil 3B) üzerinde. Önyargılı sonuçları önlemek için aynı örnek 96-şey plaka tekrarlanan ölçümler için her iki tarafında bulunan kuyu içine yüklenecek tavsiye edilir. Maksimal OD600 değerleri içinde gerektirebileceği önyargı hem Isıtma ve verimliliği mühürleme tarafından belirlenir buharlaşma oranlarındaki değişim sonucu kabul edilir. 96-şey Mikroplaka ortasında wells ile karşılaştırıldığında, kenarlarında bulunan kuyu Mikroplaka mühürleme etkisinden kaynaklanan çeşitli buharlaşma oranlarını yansıtan nispeten daha yüksek değerler göstermek eğiliminde. Buna ek olarak, aynı önyargı testine tabi diğer 96-şey Mikroplaka nerede iyi plaka üzerinde yer oldu üzerinde göre benzer yön değişiklikleri gösterdi beri önyargı ölçüde plaka okuyucu üzerinde bağlı olabilir. Böylece, 96-iyi okur ise maksimal nüfus yoğunluğu belirleme çalışmaları genel önyargı değerlendirmek önemlidir. Tüm Isıtma ve sallayarak verimliliği ve 96-şey Mikroplaka neden onların belirli genel önyargı var piyasada bulunan plaka okuyucu büyük ölçüde verimlilik mühürleme tarafından ayrıştırılan.
Bu yöntem Bakteriyel büyüme sistematik analizi için tasarlanmıştır ve iki önemli parametre, örneğin, genellikle çok çeşitli sistemleri biyoloji, evrim, gibi alanlarda uygulanır, büyüme oranı ve hücre yoğunluk analiz etmek için kullanılabilir ve Ekoloji16,17. Elektronik tablo kullanarak el ile hesaplama büyüme oranı ve hücre yoğunluğu değerlendirilmiş parametrelerinin üretmek için ham okuma işlenmesi göstermek için sunulmuştur. Saatlik büyüme oranları ilk ham okuma Protokolü bölümünde 4.6 bir veri kümesi olarak sıralı değişiklikleri büyüme oranları (şekil 4B) göre büyüme eğrisi (şekil 4A) üzerinden hesaplanır. Anlamına gelir ve standart sapmalar her beş ardışık büyüme oranları sırayla iktisap (şekil 4 c-D), ve en büyük ortalama büyüme oranı en küçük standart sapma ile büyüme maksimal büyüme oranı tanımlanır eğri (şekil 4 c-D, vurgulanan). Maksimal hücre yoğunluğu (OD600) benzer şekilde analiz edilir (şekil 4E-F). Hesaplanan büyüme oranı ve hücre yoğunluğu daha sonra daha fazla çözümleme için tabi. Açıklanan hesaplamaları otomatik olarak kullanarak hesaplama platformları (programlama dilleri), gerçekleştirilebileceğini unutmayın örneğin, R ve Python.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56197/56197fig1.jpg"> 
Şekil 1 büyüme eğrileri ile çeşitli yöntemleri satın aldı. (A) büyüme eğrilerinin çoklu alım. Dört farklı büyüme eğrileri E. coli suşlarının çeşitli genleri ifade bir yüksek-den geçerek şekilde elde. E. coli hücreleri içinde en az orta M63 yetiştirilmiştir ve OD600 okuma değişimler 1-h aralıklarla Mikroplaka okuyucu tarafından kaydedildi. Soldan suşları (sayı 0) doğru olan E. coli W3110 vahşi türü için ve onun azaltılmış genleri numaraları 1, 10 ve 18 (daha önce5, sırasıyla açıklanmıştır). (B) büyüme eğrisi CFU tahlil kullanılarak elde edilebilir. Vahşi türü E. coli hücreleri (sayı 0) kültürlü ve belirtilen süre noktalarda birkaç saat içinde örnek. Büyüme değişiklikleri CFU tahlil kullanarak tahmin edilmiştir. Açık dairelerden kayıt veya örnekleme noktaları gösteriyor. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56197/56197fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56197/56197fig2.jpg"> 
Şekil 2. Tekrarlanabilir ölçümler tekrarladı. (A) çeşitli seyreltme oranı gecede kültürleris. E. coli hücreleri tüpler 1-10,000-fold belirtildiği gibi çeşitli çoklu seyreltme hesaplı aşılanmış. Hücreleri 37 ° C'de yaklaşık 12 h için 200 devirde sallayarak ile kültürlü. Son OD600 değerleri (soldan sağa) beş hücre kültürleri 1,51, 0,74, 0,05, 0.008 0.001, idi. Kültür OD600 0,05 ile ortak gliserol hisse senedi için kullanıldı. (B) son derece tekrarlanabilir ölçümler. Altı bağımsız büyüme eğrileri (üst, gri çizgiler) aynı E. coli baskı satın aldı ve altı pozisyonlardan Mikroplaka ve ortak gliserol stokunun iki şişeleri üzerinde hesaplanan. Siyah çizgi altı büyüme eğrileri ortalamasını temsil eder. Hesaplanan (alt) varyasyon altı tekrarlanan ölçüler (CV) katsayıları vardı ve sürekli düşük puan pembe gölgeli. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56197/56197fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56197/56197fig3.jpg"> 
Şekil 3 96-şey biçiminin Genel önyargı. (A) büyüme oranları ısı haritası. E. coli hücre hisse senedi en az orta M63 askıya ve eşit (12 × 8 tablo olarak temsil edilen) Mikroplaka 96 Wells yüklendi. OD600 değişimler Mikroplaka okuyucu kullanarak iletişim kuralı 5 bölümde açıklandığı gibi elde edilmiştir. Kırmızı beyaz geçiş 0,7 0.9 h-1büyüme oranlarını gösterir. (B) ısı haritası maksimal OD600. Kırmızı beyaz geçiş 1.2 den 0,9 maksimal OD600 değerleri gösterir. Büyüme oranı ve maksimal OD600 için şekil 4' te açıklandığı gibi olacaktır. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56197/56197fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56197/56197fig4.jpg"> 
Şekil 4 analizi büyüme eğrileri. (A) büyüme eğrilerinin ham veri. Saatlik OD600 okuma karşı kültür zaman çizilir. Açık dairelerden örnekleme zamanları gösterir. (B) Temporal büyüme oranları değiştirir. Saatlik büyüme oranları arasında iki ardışık OD600 okuma 4,6 içinde açıklanan denklem göre hesaplanır. (C) büyüme oranları demek. Beş ardışık büyüme oranları ortalaması pürüzsüz büyüme oranları vermek için hesaplanır. (D) standart sapma ortalama büyüme oranları. Standart sapma aynı beş ardışık büyüme oranları hesaplanır. Maksimal büyüme oranı en küçük standart sapma ile kırmızı ile vurgulanacaktır. (E) OD600demek. Beş ardışık OD600 değerlerin ortalamasını pürüzsüz OD600belirlemek için hesaplanır. (F) OD600 değerleri standart sapmalarının demek. Aynı beş ardışık OD600 değerlerin standart sapmasını hesaplar. En küçük standart sapma ile maksimal OD600 kırmızıyla vurgulanır. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56197/56197fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Precise, High-throughput Analysis of Bacterial Growth at JoVE.com

Precise, High-throughput Analysis of Bacterial Growth

Bakteriyel büyüme kesin, yüksek üretilen iş analizi

Bakteriyel büyüme kantitatif değerlendirilmesi mikrobiyal Fizyoloji bir sistemleri-düzey olgu olarak anlamak için gerekli. Deneysel manipülasyon ve analitik bir yaklaşım için bir protokol bırakmak kesin, yüksek üretilen iş analizi anahtar sistemleri Biyoloji ilgi konusu bakterilerin büyüme için sunulmaktadır.

Bacterial growth is a central concept in the development of modern microbial physiology, as well as in the investigation of cellular dynamics at the ...

precise-high-throughput-analysis-of-bacterial-growth

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

23.7K Görüntüleme.  University of Tsukuba. Bakteriyel büyüme kantitatif değerlendirilmesi mikrobiyal Fizyoloji bir sistemleri-düzey olgu olarak anlamak için gerekli. Deneysel manipülasyon ve analitik bir yaklaşım için bir protokol bırakmak kesin, yüksek üretilen iş analizi anahtar sistemleri Biyoloji ilgi konusu bakterilerin büyüme için sunulmaktadır.

Video: Precise, High-throughput Analysis of Bacterial Growth

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding of an RNA binding protein (RBP) to the initiation region of the mRNA, which interferes with ribosome binding. In the presented method, we utilize this blocking phenomenon to quantify the binding affinity of RBPs to their cognate and non-cognate binding sites. To do this, we insert a test binding site in the initiation region of a reporter mRNA and induce the expression of the test RBP. In the case of RBP-RNA binding, we observed a sigmoidal repression of the reporter expression as a function of RBP concentration. In the case of no-affinity or very low affinity between binding site and RBP, no significant repression was observed. The method is carried out in live bacterial cells, and does not require expensive or sophisticated machinery. It is useful for quantifying and comparing between the binding affinities of different RBPs that are functional in bacteria to a set of designed binding sites. This method may be inappropriate for binding sites with high structural complexity. This is due to the possibility of repression of ribosomal initiation by complex mRNA structure in the absence of RBP, which would result in lower basal reporter gene expression, and thus less-observable reporter repression upon RBP binding.

In this method, we quantify the binding affinity of RNA binding proteins (RBPs) to cognate and non-cognate binding sites using a simple, live, reporter assay in bacterial cells. The assay is based on repression of a reporter gene.

Bakterilerde protein RNA bağlayıcı ölçümü için bir tahlil

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

Genetik

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to perform and its ability to standardize the fitness of many strains to a wild-type organism. The technique is limited, however, by available phenotypic markers and the number of strains that can be assessed simultaneously, creating the need for a great number of replicate experiments. Concurrent with large numbers of experiments, the labor and material costs for quantifying bacteria based on phenotypic markers are not insignificant. To overcome these negative aspects while retaining the positive aspects, we have developed a molecular-based approach to directly quantify microorganisms after engineering genetic markers onto bacterial chromosomes. Unique, 25 base pair DNA barcodes were inserted at an innocuous locus on the chromosome of wild-type and mutant strains of Salmonella. In vitro competition experiments were performed using inocula consisting of pooled strains. Following the competition, the absolute numbers of each strain were quantified using digital PCR and the competitive indices for each strain were calculated from those values. Our data indicate that this approach to quantifying Salmonella is extremely sensitive, accurate, and precise for detecting both highly abundant (high fitness) and rare (low fitness) microorganisms. Additionally, this technique is easily adaptable to nearly any organism with chromosomes capable of modification, as well as to various experimental designs that require absolute quantification of microorganisms.

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

This molecular-based approach for determining bacterial fitness facilitates precise and accurate detection of microorganisms using unique genomic DNA barcodes that are quantified via digital PCR. The protocol describes calculating the competitive index for Salmonella strains; however, the technology is readily adaptable to protocols requiring absolute quantification of any genetically-malleable organism.

Salmonella Fitness yüksek verimlilik analizi için dijital PCR tabanlı rekabetçi endeksi

A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to ...

Enhanced Reproducibility and Precision of High-Throughput Quantification of Bacterial Growth Data Using a Microplate Reader

This study aimed to develop a repeatable, reliable, high-throughput protocol to monitor bacterial growth in 96-well plates and analyze the maximum growth rate. The growth curves and maximum growth rates of two bacterial species were determined. Issues including (i) lid condensation, (ii) pathlength correction, (iii) inoculation size, (iv) sampling time interval, and (v) spatial bias were investigated. The repeatability of the protocol was assessed with three independent technical replications, with a standard deviation of 0.03 between the runs. The maximum growth rates of Bacillus mycoides and Paenibacillus tundrae were determined to be&#160;(mean&#160;&#177; SD) 0.99 h&#8722;1 &#177;&#160; 0.03 h&#8722;1 and 0.85 h&#8722;1 &#177; 0.025 h&#8722;1, respectively. These bacteria are more challenging to monitor optically due to their affinity to clump together. This study demonstrates the critical importance of inoculation size, path length correction, lid warming, sampling time intervals, and well-plate spatial bias to obtain reliable, accurate, and reproducible data on microplate readers. The developed protocol and its verification steps can be expanded to other methods using microplate readers and high-throughput protocols, reducing the researchers&#39; innate errors and material costs.

Here, a high-throughput protocol is presented to measure growth data, including growth curves, growth rate, and maximum growth rate. The protocol was verified and validated using two biofilm-producing bacteria. The results and approach applied in this study can be expanded to other high-throughput protocols using microplate readers.

This study aimed to develop a repeatable, reliable, high-throughput protocol to monitor bacterial growth in 96-well plates and analyze the maximum growth ...

Çevre

ScanLag: High-throughput Quantification of Colony Growth and Lag Time

Growth dynamics are fundamental characteristics of microorganisms. Quantifying growth precisely is an important goal in microbiology. Growth dynamics are affected both by the doubling time of the microorganism and by any delay in growth upon transfer from one condition to another, the lag. The ScanLag method enables the characterization of these two independent properties at the level of colonies originating each from a single cell, generating a two-dimensional distribution of the lag time and of the growth time. In ScanLag, measurement of the time it takes for colonies on conventional nutrient agar plates to be detected is automated on an array of commercial scanners controlled by an in house application. Petri dishes are placed on the scanners, and the application acquires images periodically. Automated analysis of colony growth is then done by an application that returns the appearance time and growth rate of each colony. Other parameters, such as the shape, texture and color of the colony, can be extracted for multidimensional mapping of sub-populations of cells. Finally, the method enables the retrieval of rare variants with specific growth phenotypes for further characterization. The technique could be applied in bacteriology for the identification of long lag that can cause persistence to antibiotics, as well as a general low cost technique for phenotypic screens.

ScanLag is a high-throughput method for measuring the delay in growth, namely lag time, as well as the growth rate of colonies for thousands of cells in parallel. Screening using ScanLag enables the discrimination between long lag-time and slow growth at the level of a single variant.

ScanLag: Yüksek verim Colony Büyüme niceliksel ve Zaman Lag

Growth dynamics are fundamental characteristics of microorganisms. Quantifying growth precisely is an important goal in microbiology. Growth dynamics are ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. Regulatory systems that utilize intracellular cyclic di-GMP (c-di-GMP) as a second messenger are one such class of target. c-di-GMP is a signaling molecule found in almost all bacteria that acts to regulate an extensive range of processes including antibiotic resistance, biofilm formation and virulence. The understanding of how c-di-GMP signaling controls aspects of antibiotic resistant biofilm development has suggested approaches whereby alteration of the cellular concentrations of the nucleotide or disruption of these signaling pathways may lead to reduced biofilm formation or increased susceptibility of the biofilms to antibiotics. We describe a simple high-throughput bioreporter protocol, based on green fluorescent protein (GFP), whose expression is under the control of the c-di-GMP responsive promoter cdrA, to rapidly screen for small molecules with the potential to modulate c-di-GMP cellular levels in Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). This simple protocol can screen upwards of 3,500 compounds within 48 hours and has the ability to be adapted to multiple microorganisms.

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

This article describes the high-throughput assay that has been successfully established to screen large libraries of small molecules for their potential ability to manipulate cellular levels of cyclic di-GMP in Pseudomonas aeruginosa, providing a new powerful tool for antibacterial drug discovery and compound testing.

Modüle c-di-GMP sinyal İşte Küçük Moleküller Tarama için Yüksek verim Kur kurulması<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

High Throughput, Real-time, Dual-readout Testing of Intracellular Antimicrobial Activity and Eukaryotic Cell Cytotoxicity

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require several additional experimental steps prior to readout, such as cell lysis, colony forming unit determination, or reagent addition. When performing thousands of assays, for example, during high-throughput screening, the downstream effort required for these types of assays is considerable. Therefore, to facilitate high-throughput antimicrobial discovery, we developed a real-time assay to simultaneously identify inhibitors of intracellular bacterial growth and assess eukaryotic cell cytotoxicity. Specifically, real-time intracellular bacterial growth detection was enabled by marking bacterial screening strains with either a bacterial lux operon (1st generation assay) or fluorescent protein reporters (2nd generation, orthogonal assay). A non-toxic, cell membrane-impermeant, nucleic acid-binding dye was also added during initial infection of macrophages. These dyes are excluded from viable cells. However, non-viable host cells lose membrane integrity permitting entry and fluorescent labeling of nuclear DNA (deoxyribonucleic acid). Notably, DNA binding is associated with a large increase in fluorescent quantum yield that provides a solution-based readout of host cell death. We have used this combined assay to perform a high-throughput screen in microplate format, and to assess intracellular growth and cytotoxicity by microscopy. Notably, antimicrobials may demonstrate synergy in which the combined effect of two or more antimicrobials when applied together is greater than when applied separately. Testing for in vitro synergy against intracellular pathogens is normally a prodigious task as combinatorial permutations of antibiotics at different concentrations must be assessed. However, we found that our real-time assay combined with automated, digital dispensing technology permitted facile synergy testing. Using these approaches, we were able to systematically survey action of a large number of antimicrobials alone and in combination against the intracellular pathogen, Legionella pneumophila.

A high throughput, real-time assay was developed to simultaneously identify (1) eukaryotic cell-penetrant antimicrobials targeting an intracellular bacterial pathogen, and (2) assess eukaryotic cell cytotoxicity. A variation on the same technology was thereafter combined with digital dispensing technology to enable facile, high-resolution, dose-response, and two- and three-dimensional synergy studies.

Yüksek Verimli, gerçek zamanlı, Hücre içi Antimikrobiyal Aktiviteleri Çift okuma Test ve Ökaryotik Hücre Sitotoksisite

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require ...

Multi-scale Analysis of Bacterial Growth Under Stress Treatments

Analysis of the bacterial ability to grow and survive under stress conditions is essential for a wide range of microbiology studies. It is relevant to characterize the response of bacterial cells to stress-inducing treatments such as exposure to antibiotics or other antimicrobial compounds, irradiation, non-physiological pH, temperature, or salt concentration. Different stress treatments might disturb different cellular processes, including cell division, DNA replication, protein synthesis, membrane integrity, or cell cycle regulation. These effects are usually associated with specific phenotypes at the cellular scale. Therefore, understanding the extent and causality of stress-induced growth or viability deficiencies requires a careful analysis of several parameters, both at the single-cell and at the population levels. The experimental strategy presented here combines traditional optical density monitoring and plating assays with single-cell analysis techniques such as flow cytometry and real time microscopy imaging in live cells. This multiscale framework allows a time-resolved description of the impact of stress conditions on the fate of a bacterial population.

This protocol allows a time-resolved description of bacterial growth under stress conditions at the single-cell and the cell population levels.

Stres Tedavileri Altında Bakteriyel Büyümenin Çok Ölçekli Analizi

Analysis of the bacterial ability to grow and survive under stress conditions is essential for a wide range of microbiology studies. It is relevant to ...

Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

Microfluidic technology overcomes many of the limitations to traditional analytical methods in microbiology. Unlike bulk-culture methods, it offers single-cell resolution and long observation times spanning hundreds of generations; unlike agarose pad-based microscopy, it has uniform growth conditions that can be tightly controlled. Because the continuous flow of growth medium isolates the cells in a microfluidic device from unpredictable variations in the local chemical environment caused by cell growth and metabolism, authentic changes in gene expression and cell growth in response to specific stimuli can be more confidently observed. Bacillus subtilis is used here as a model bacterial species to demonstrate a &#34;mother machine&#34;-type method for cellular analysis. We show how to construct and plumb a microfluidic device, load it with cells, initiate microscopic imaging, and expose cells to a stimulus by switching from one growth medium to another. A stress-responsive reporter is used as an example to reveal the type of data that may be obtained by this method. We also briefly discuss further applications of this method for other types of experiments, such as analysis of bacterial sporulation.

Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

We present a method for the microfluidic analysis of individual bacterial cell lineages using Bacillus subtilis as an example. The method overcomes shortcomings of traditional analytical methods in microbiology by allowing observation of hundreds of cell generations under tightly controllable and uniform growth conditions.

Bacillus subtilis tek hücreli mikrosıvısal analizi

Microfluidic technology overcomes many of the limitations to traditional analytical methods in microbiology. Unlike bulk-culture methods, it offers ...

Biyoloji

Using Microtiter Dish Radiolabeling for Multiple In Vivo Measurements Of Escherichia coli (p)ppGpp Followed by Thin Layer Chromatography

The (p)ppGpp nucleotide functions as a global regulator in bacteria in response to a variety of physical and nutritional stress. It has a rapid onset, in seconds, which leads to accumulation of levels that approach or exceed those of GTP pools. Stress reversal occasions a rapid disappearance of (p)ppGpp, often with a half-life of less than a minute. The presence of (p)ppGpp results in alterations of cellular gene expression and metabolism that counter the damaging effects of stress. Gram-negative and Gram-positive bacteria have different response mechanisms, but both depend on (p)ppGpp concentration. In any event, there is a need to simultaneously monitor many radiolabeled bacterial cultures at time intervals that may vary from 10 seconds to hours during critical stress transition periods. This protocol addresses this technical challenge. The method takes advantage of temperature- and shaker-controlled microtiter dish incubators that allow parallel monitoring of growth (absorbance) and rapid sampling of uniformly phosphate-radiolabeled cultures to resolve and quantitate nucleotide pools by thin-layer chromatography on PEI-cellulose. Small amounts of sample are needed for multiple technical and biological replicates of analyses. Complex growth transitions, such as diauxic growth and rapid (p)ppGpp turnover rates can be quantitatively assessed by this method.

Using Microtiter Dish Radiolabeling for Multiple In Vivo Measurements Of Escherichia coli pppGpp Followed by Thin Layer Chromatography

The growth of radiolabeled bacterial cultures in microtiter dishes facilitates high throughput sampling that allows multiple technical and biological replicate assays of nucleotide pool abundance, including that of (p)ppGpp. The effects of growth transitions provoked by sources of physiological stress as well as recovery from stress can be monitored.

Ince katman Kromatografi takip Escherichia coli (p) ppGpp çoklu In vivo ölçümleri Için mikrotiter bulaşık Radiolabeling kullanma

The (p)ppGpp nucleotide functions as a global regulator in bacteria in response to a variety of physical and nutritional stress. It has a rapid onset, in ...

High-Throughput Live Imaging of Microcolonies to Measure Heterogeneity in Growth and Gene Expression

Precise measurements of between- and within-strain heterogeneity in microbial growth rates are essential for understanding genetic and environmental inputs into stress tolerance, pathogenicity, and other key components of fitness. This manuscript describes a microscope-based assay that tracks approximately 105&#160;Saccharomyces cerevisiae microcolonies per experiment. After automated time-lapse imaging of yeast immobilized in a multiwell plate, microcolony growth rates are easily analyzed with custom image-analysis software. For each microcolony, expression and localization of fluorescent proteins and survival of acute stress can also be monitored. This assay allows precise estimation of strains&#39; average growth rates, as well as comprehensive measurement of heterogeneity in growth, gene expression, and stress tolerance within clonal populations.

Yeast growth phenotypes are precisely measured through highly parallel time-lapse imaging of immobilized cells growing into microcolonies. Simultaneously, stress tolerance, protein expression, and protein localization can be monitored, generating integrated datasets to study how environmental and genetic differences, as well as gene-expression heterogeneity among isogenic cells, modulate growth.

Büyüme ve Gen İfadesinde Heterojenliği Ölçmek için Mikrokolonların Yüksek Verimli Canlı Görüntülemesi

Precise measurements of between- and within-strain heterogeneity in microbial growth rates are essential for understanding genetic and environmental ...