Fenotip mikro dizi teknolojisi, çok çeşitli giriş metabolitlerine yanıt olarak hücresel metabolik aktiviteleri işlevsel olarak belirleyen etkili bir yüksek verimli yöntemdir. Bu teknolojideki kullanım, tetrazolium bazlı bir redoks boyasının NADH azaltımı ile üretilen renk geliştirme miktarına göre belirlenen hücresel solunum şeklinde ölçülür. Bu çalışmada, Chlamydomonas reinhardtii model türlerini kullanarak mikro algler bağlamında fenotip mikro dizi tahlillerinin kullanımını tanıtacağız.
Bu çalışmanın amacı, mevcut alg metabolik ağ modellerini genişletmek veya yeni modellerin yeniden inşasına rehberlik etmek için kullanılabilecek mikro alglerin metabolik fenotiplesini karakterize etmek için güvenilir bir yöntem oluşturmaktır. Chlamydomonas reinhardtii strain CC-503, Minnesota ÜNIVERSITESI ABD'deki Chlamydomonas kaynak merkezinden temin edilebilir. Hücreleri taze Tris-asetat fosfat yağ medyasında orta kütük fazı kadar büyütün.
Mikroskop altındaki hücreleri kontrol ederek iyi durumda olduklarından ve herhangi bir kirlenme olmadığından emin olun. 2000 G kuvveti ile kültürü 10 dakika döndürün. Peletin rahatsız etmeden süpernatant atın.
%0,1 tetrazolium menekşe boyası içeren taze musluk ortamı hazırlayın D"Bakteri üremesini engellemek için medyaya Timentin, Ampicillin ve Kanamycin dahil olmak üzere farklı antibiyotikler ekleyin. Yağ ortamı ve bu adım, her plaka tipine bağlı olarak besinlerden çıkarılmalıdır. Peleni ve taze musluk medyasını mililitre başına 1 milyon hücrelik son konsantrasyona yeniden askıya alın.
Karbon kaynakları, azot kaynakları, fosfor ve kükürt kaynakları plakaları ve peptit azot kaynakları gibi kimyasal bileşik dizi tahlil plakalarını kullanın. Deneme plakalarının her kuyusuna 100 mikroliter yeterli miktarda kendi kendine yeten ortam aşılayın. Tahlilleri çoğaltın.
Bu aşamada bakteriyel kontaminasyonu izlemek için hücrelerin tahlil öncesi ve sonrasında gram negatif lekelenme ile test edilmesi gerektiği unutulmamalıdır. Kimyasal bileşik alan test plakalarını mikro plaka okuyucu sistemine yerleştirin. Tüm plakaları yedi güne kadar 30 derecede kuluçkaya yatırın ve mikro plaka okuyucu sistemini her 15 dakikada bir boya renk değişimini okuyacak şekilde programlayın.
Çoğu mikro plaka okuyucusu kuluçka sırasında sürekli ışık kaynağı sağlamadığı için, algler heterotrofik solunum yapabilmelidir. Ham kinetik verileri mikro plaka okuyucusundan CSV dosyaları olarak dışa aktarın, bu da daha sonra fenotip mikroarray yazılım paketine ve yazılımımıza giriş olarak kullanılacaktır. Fenotip mikroarray veri analizini gerçekleştirmek için, R yazılım ortamında çalışan OmniLog fenotip mikro Erik OPM yazılım paketini kullanın.
R studio'da, R için grafik kullanıcı arayüzü, makalede ayrıntılı olarak açıklanan komutları kullanarak OPM paketini ve bağımlılıklarını yükleyin. Kinetik verilerin CSV dosyalarını içeren dizine gidin ve okuma OPM işlevini kullanarak verileri alın. Kinetik veriler pref parametre tahmini kullanılarak toplanabilir ve ayrıklaştırılabilir.
XY çizim işlevinin kullanılması, solunum veya büyüme ölçümlerinin 96 kuyu plakaları için zamanın bir işlevi olarak eşlenilmesini sağlar. Veriler, kinetik verilerin hızlı bir karşılaştırmalı genel görünümünü sağlamak için işlev düzeyi çizimi kullanılarak bir ısı haritası olarak görselleştirilebilir. Bir sonraki adım, yeni metabolitlerle ilişkili reaksiyonları ve genleri tanımlamaktır.
Algler için mevcut bir modelin varlığı durumunda, fenotip mikroarray sisteminden gelen veri analizi bu modeli iyileştirmek için kullanılabilir. Burada fenotip mikroarray verilerini kullanarak Chlamydomonas modeli için genom ölçeğinde metabolik ağ iyileştirmesi için kullandığımız boru hattını sunuyoruz. Kullanım için yeni bir bileşik test pozitif olduğunda, bileşiğin ilgili reaksiyon profilleri, ilişkili enzim komisyon numaralarını sağlayarak metabolik bilgi temeli kullanılarak tanımlanır.
İlk adım, kimyasal bileşik dizilerden bulunan metabolize edilmiş reaksiyonlar için enzim komisyon numaralarını, VC'leri tanımlamak için Kegg ve MetaCyc'i aramaktır. Daha sonra, tanımlanan EC numaralarını ortak genom Enstitüsü, JGI, Fitome ve hakemli yayınlar gibi mevcut birden fazla alg ek açıklama kaynağında arama temeli olarak kullanıyoruz. Reaksiyonlar ve metabolitler, modeli genişletmek ve iyileştirmek için COBRA tabanlı Chlamydomonas reinhardtii metabolik ağ modeli olan iRC1080'e eklenir.
EC sayısını destekleyen genetik kanıtlar bulunamazsa, reaksiyonla ilişkili aday genleri tanımlamak için NCBI Pozisyona Özgü Yineleme, NCBI PSI-BLAST gibi profil tabanlı bir arama yapılabilir. Sonuçlar daha sonra el ile değerlendirilir. Arama EC numaralarıyla ilgisi için 0,05'ten küçük E değerlerine sahip bu QC adımını geçenler, daha sonra ölçüm modeline eklenir.
Bu protokolün son adımı modeli iyileştirmek, modelleri değerlendirmek ve karşılaştırmaktır. Model iyileştirme adımlarını gerçekleştirmek için en son COBRA araç kutusu sürüm 3.0'ı ve MATLAB platformunu kullanın. Cobra araç kutusunu yükledikten sonra iRC1080 modelini indirebilirsiniz.
Daha sonra MATLAB'da yapılacak ilk şey, referans modeli iRC1080'i içeren klasöre gitmektir. Kobra araç kutusu işlevlerini kullanarak iRC1080 gibi metabolik modele ilişkili genleriyle tanımlanan reaksiyonları ekleyin. Reaksiyon ekleyin ve gen ilişkisini değiştirin.
iRC1080 modelini içeren dizine gidin ve modeli yüklemek için komutları çalıştırın. Yeniden adlandırın ve yeni bir reaksiyon ve ilişkili geni ekleyin. Metabolit hücre içi olarak üretilmediği, ancak ortamdan alındığı bazı durumlarda, metabolitleri hücre dışı ortama girmek veya çıkarmak için ekle/değiştir reaksiyonu işlevi kullanılarak yeni metabolitler için taşıma reaksiyonlarının modele eklenmesi gerekir.
Yeni sonuç ve modelin davranışını test edin, örneğin, iBD1106, akı dengesi analizi yaparak, FBA, işlev optimize CB modelini ışık ve karanlık koşullar altında kullanarak nesne işlevi olarak biyokütlenin en üst düzeye çıkarılması için. Diğerlerinin yanı sıra, FBA çözümü reaksiyon akılarını, metabolit gölge fiyatlarını ve reaksiyonun maliyetleri düşürdüğü üç vektörü çıkışı sağlar. Burada, her modelde hesaba katılan değişikliklere ve metabolitlere biyokütle nesnel işlevinin hassasiyetini temsil eden gölge fiyatları elde ederek iRC1080 modelinin rafine sürümü iBD1106 ile karşılaştırıldığı bir örnek verilmiştir.
Burada sırasıyla deniz mavisi renginde ve mor renkte boş ve CC-503 için karbon kaynaklarının ve azot kaynaklarının test plakalarının solunum XY arazilerini ve seviye çizelgelerini gösteriyoruz. Her kuyuda, solunum eğrileri zamanın işlevi olarak azaltılarak boya dönüşümünü temsil eder. Panel A'da vurgulanan tepe noktası, asetatın chlamydomonas literatürü ile tutarlı olan bu plakadan elde edilen tek karbon kaynağı olarak algılanmasını temsil eder.
İyi küratörlüğünü yapılan Chlamydomonas metabolik modeli olan iRC1080, GC-TOF uçuşunun gaz kromatografi süresi ve fenotip mikroarray denemesi olmak üzere üç farklı yöntem kullanılarak tanımlanan metabolit sayısının karşılaştırılması, üç set arasında sadece altı metabolit çakışması olduğunu, 149'unun ise iRC1080 ile fenotip mikroarray assay kümesi arasında yaygın olduğunu göstermektedir. Bu, her teknolojinin metabolik profilleme araştırmasına karşı bir gücü olsa da, fenotip mikroarray test setinin önemli bir yeni metabolik bilgi kaynağı olabileceğini göstermektedir. Elde edilen bilgiler metabolik ağ modeli iRC1080'i genişletmek ve iyileştirmek için kullanıldı.
Burada, iRC1080 modelinin içeriğini ve reaksiyon sayısı, metabolit sayısı ve gen sayısı dahil olmak üzere genişletilmiş model iBD1106'yı karşılaştırıyoruz. Model rafine etmemizin yeni ortaya çıkan ağa 254'ün üzerinde reaksiyon eklediğini gösteriyoruz. Bu reaksiyonlar amino asitler, dipeptitler, tripeptitler ve taşıma reaksiyonları olarak sınıflandırılır.
Yeni tanımlanan metabolitler metabolik ağ genişlemesi ve mevcut Chlamydomonas reinhardtii metabolik modelinin iyileştirilmesi için kullanılmıştır. Fenotip mikroarray tahlilleri, mevcut ve yeni izole edilmiş suşların metabolik fenotiplerini karakterize etmek için kullanılabilir. Ek olarak, mikro algler bağlamında kullandığımız protokol, diğer türlerin metabolik modellerinin iyileştirilmesine rehberlik edebilir.
