Bu çalışma, Universidade Católica Portuguesa Tıp Fakültesi'nin iç finansmanı ve UIDP/04279/2020, UIDB/04279/2020 ve EXPL/SAU-INF/0742/2021 hibeleri kapsamında Fundação para a Ciência e a Tecnologia'nın (FCT) dış finansmanı ile desteklenmiştir.

NOT: Burada açıklanan protokol BCG içindir ancak herhangi bir Mikobakteriye uygulanabilir. BCG, BSL3 tesislerinin bulunmadığı durumlarda TB deneyleri için vekil bir bakteri olarak kullanılabilir22. BCG kullanan aşağıdaki prosedürler, bir biyogüvenlik seviyesi 2 (BSL2) laboratuvarı altında gerçekleştirilmeli ve tehlike grubu 2 mikroorganizmalarının manipülasyonu için uygun biyogüvenlik yönergelerine ve iyi laboratuvar uygulamalarına uyulmalıdır.
1. Kültür ortamının hazırlanması
<ol><li>Tedarikçinin talimatlarına göre %7 (h/h) oleik asit, albümin, dekstroz ve katalaz (OADC) zenginleştirmesi ile desteklenmiş Middlebrook 9H10 et suyunu hazırlayın. Et suyunu% 0.05 (h / h) tyloxapol ile destekleyin. NOT: Tyloxapol, bakteri küme oluşumunu önlemek için yüzey aktif madde olarak kullanılan iyonik olmayan sıvı bir polimerdir16.</li>
	<li>Tedarikçinin talimatlarına göre %7 (h/h) OADC zenginleştirmesi ile desteklenmiş Middlebrook 10H10 katı ortamını hazırlayın.</li>
	<li>Kare Petri kabı başına 40 mL ortam dağıtın (120 mm x 120 mm). Agarın yüzeyindeki yoğuşmayı en aza indirmek için plakaların kurumasını bekleyin. NOT: Bu özel petri kabı boyutu, 96 oyuklu bir plakadan en az 96 damlacığın doğrudan transpozaline izin vermek için esastır. Plakaların etkili bir şekilde kurutulması daha sonra küçük bakteri süspansiyon damlacıklarının kaplanmasını kolaylaştıracak ve damlacıkların yayılmasını önleyecektir.</li>
	<li>Enfeksiyon ortamını üretmek için Roswell Park Memorial Institute Medium'u (RPMI 1640) veya Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium'unu (DMEM) hazırlayın. Her iki durumda da, ortamı %10 fetal buzağı serumu, %1 L-glutamin ve 1 mM sodyum piruvat ile destekleyin. Ortama penisilin ve streptomisin eklemeyin.</li>
</ol>2. Numune hazırlama
<ol><li>Çeşitli kaynaklardan örnekler alın. Tipik olarak, bir TB aşısının etkinliğini değerlendirmek için CFU'yu ölçmek için aşılanmış ve aşılanmamış hayvan dokularından örnekler alın. Örneğin, fare akciğeri ve dalağı11 veya makak akciğeri, torasik ve periferik lenf düğümleri, dalak, karaciğer, deri, kan, kemik iliği ve bronkoalveoler lavaj yıkama23. Alternatif olarak, BCG 18,19,20,24,25,26 ile enfekte makrofajların/dendritik hücrelerin/nötrofillerin in vitro kültürlerinden örnekler alın.</li>
</ol>3. BCG kültürünün üretimi
NOT: Tüberküloz aşılarının in vivo çalışmalarında amaç, BCG'nin etkinliğini arttırmaktır. Bu nedenle BCG aşısı yapılan gruplar genellikle kontrol olarak kullanılır. İnsan aşılaması için kullanılan BCG suşları, hayvan modellerinde test etmek için idealdir. Bu durumda, tedarikçinin talimatlarına göre bir BCG kültürü yeniden oluşturulmalıdır27. Bununla birlikte, in vivo çalışmalar için bir BCG kültürü de kurum içinde üretilebilir11. İn vitro enfeksiyon protokolleri için tek hücreli, tek tip ve yüksek kaliteli BCG kültürünün üretimi, çeşitli çalışmalarda 11,16,18,19,20,26,28,29 çok başarılı bir şekilde üretilmiştir.
<ol><li>7H9 et suyunda, 37 °C'de, 200 rpm'de çalkalama ile 50 mL BCG kültürü. Ses seviyesini deneyin ihtiyaçlarına göre değiştirin.</li>
	<li>Her gün, 8-10 gün boyunca, 100 μL kültür toplayın ve 1 mL'lik bir küvete 900 μL PBS ekleyerek seyreltin. Daha sonra bakterilerin optik yoğunluğunu ölçerek devam edin (λ=600 nm'de OD; OD600) bir spektrofotometrede. Bu değerlerden bir büyüme eğrisi çizin. Kültürün orta log aşamasını tanımlayın (OD birim zamanda tutarlı bir şekilde iki katına çıktığında).</li>
	<li>Sonraki bir kültür hazırlayın ve adım 3.1 ve 3.2'de olduğu gibi orta/geç kütük büyüme aşamasına ulaşana kadar inkübe edin. Önceki adımda elde edilen değerleri kılavuz olarak kullanın. Kaliteli bir canlı bakteri kültürünü korumak için kültürün sabit büyüme aşamasına (OD stabilize olmaya başladığında) ulaşmadığından emin olun.</li>
	<li>Kültürü orta/geç kütük büyüme aşamasında toplayın. 3000 x g'da 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın.</li>
	<li>Bakterileri yıkamak için 10 mL PBS ekleyin. 3000 x g'da 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın.</li>
	<li>Bakterileri 5 mL enfeksiyon ortamı ile yeniden süspanse edin. Tüpü 15 dakika boyunca ultrason banyosuna yerleştirin, 80 Hz'de tam güçte.</li>
	<li>1000 x g'da 10 dakika santrifüjleyin. Yüksek kaliteli bir BCG kültüründe kaçınılması gereken bakteri kümeleri açısından zengin olduğu için peletten kaçınarak süpernatanı toplayın ve atın.</li>
	<li>Süpernatantın OD'sini ölçün. Burada, OD600'ü 0.1 olan üstel büyüme fazındaki kültürler, 1 x 107 CFU/mL'ye eşdeğerdir. NOT: Her laboratuvar, spektrofotometreyi kullanarak OD600 ve CFU arasında doğrusal bir regresyon oluşturmak için deneylere başlamadan önce kendi BCG büyüme eğrilerini üretmelidir. Spektrofotometrelerin, aynı numune için elde edilen okumaları değiştirebilen farklı ışık yolu mesafelerine sahip olduğunu lütfen unutmayın.</li>
	<li>Her konakçı hücre kültürüne eklenecek bakteri sayısını belirlemek için basit hesaplamalar yapın. Konak hücre başına düşen bakteri sayısı, Enfeksiyon Çokluğudur (MOI). BCG enfeksiyon deneyleri için kullanılan en yaygın MOI olan konakçı hücre başına 10 bakterilik bir MOI kullanın.</li>
</ol>4. Mikro koloni oluşturan birim tahlili
NOT: Bir in vivo veya in vitro enfeksiyon deneyi tamamlandıktan sonra, bakterilerin sayımı mCFU ile gerçekleştirilebilir. İn vivo çalışmalar için, numuneler önce bir boncuk çırpıcı veya başka bir doku homojenizatöründe homojenize edilmelidir. BCG ile enfekte makrofajların/dendritik hücrelerin/nötrofillerin in vitro kültürleri için, numuneler iyonik olmayan bir deterjan (örneğin, iyonik olmayan, denatüre olmayan deterjanın% 0.05 çözeltisi) kullanılarak parçalanmalıdır.
<ol><li>96 oyuklu bir plaka kullanarak seri seyreltmeler: Şekil 1A'daki şemaya göre steril bir 96 oyuklu plakada lizatların seri 10 kat seyreltmelerini gerçekleştirin. Lizatları A ve E sıralarına dağıtın. Her plaka için maksimum numune ve/veya replikasyon sayısı 24'tür.</li>
	<li>Seri seyreltmeyi gerçekleştirmek için kalan kuyucuklara 180 μL dH2O ekleyin.</li>
	<li>12 kanallı bir pipet kullanarak, A sırasındaki lizatları yeniden süspanse edin ve 20 μL'yi B sırasına aktarın (20 μL lizat + 180 μL dH2O). İyice homojenize edin. D satırındaki son seyreltmeye ulaşana kadar B ve C satırları için bu adımı sırayla tekrarlayın. NOT: Genellikle üç seyreltme (100, 101, 102, 103) gerçekleştiririz, böylece her 12 numune ve/veya kopya seti için 4 sıra plaka (AD veya EH) kullanırız.</li>
	<li>Mikro damlacık kaplama: Şekil 0.5B'ye göre 10 oyuklu plakanın her sırasından 5 μL'yi katı orta kare plakaya aktarmak için 96-1 μL (ince uçlar tercih edilir) çok kanallı pipet kullanın.</li>
	<li>5 μL'lik damlacıkları yavaşça pipetlerken, agarın üzerine hafifçe dokunmalarına izin verin. Bu, damlacığın uçtan agar'a doğru çıkarılmasına ve sıvının uç içinde tutulma olasılığının azaltılmasına yardımcı olacaktır.</li>
	<li>Damlacıkların kurumasını bekleyin, agar plakasını kapatın ve bakteri üremesini izlerken 37 °C'de inkübe edin. İsteğe bağlı olarak, plakaların kurumasını önlemek için agar plakalarını kapalı bir plastik torba içinde inkübe edin.</li>
	<li>Mikro koloni sayımı: yaklaşık 6-10 günlük inkübasyonun ardından, çıplak gözle görülebilen tek tek kolonileri kontrol edin (Şekil 2).</li>
	<li>Ters çevrilmiş bir optik mikroskop veya büyüteç için en düşük büyütme objektifini (4x veya daha düşük) kullanarak kolonileri sayın. Koloni sayısının 300'den az ve 30'dan yüksek olduğu dilüsyonlarda sayım yapılmalıdır. Alternatif olarak, bilgisayardaki kolonileri manuel olarak saymak için damlacığın fotoğrafını çekmek için bir kamera kullanın veya koloni sayımını otomatikleştirmek için ImageJ gibi bir yazılım kullanın.</li>
	<li>Hücre numaralarını CFU/mL cinsinden ifade etmek için aşağıdaki denklemi kullanın: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/65447/65447eq01.jpg" style="margin: auto;"> Burada C = sayılan koloni sayısı, V = μL cinsinden kaplanmış hacim ve Dil = kolonilerin sayıldığı seyreltme (100, 101, 102, 103). Örneğin, 102 seyreltmesinde 5 μL'lik bir damlacıkta 30 koloni sayıldıysa, o zaman: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/65447/65447eq02.jpg" style="margin: auto;"></li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65447/65447fig01.jpg"> Şekil 1. mCFU protokolünün şematik gösterimi. (A) 96 oyuklu bir plakada BCG içeren lizatların seri 10 kat seyreltilmesi. (B) Katı kültür ortamı içeren ve her biri 5 μL'lik 96 damlacık ile kaplanmış kare Petri kabı. Damlacıklar, çok kanallı bir pipet kullanılarak doğrudan 96 oyuklu plakadan pipetlenir. BioRender.com ile oluşturuldu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65447/65447fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65447/65447fig02.jpg"> Şekil 2. 10 günlük inkübasyonun ardından BCG'nin mikro koloni oluşturan birimleri. Solda, daha önce Şekil 1B'de gösterildiği gibi, her biri 5 μL'lik 96 damlacık ile kaplanmış kare bir Petri kabının fotoğrafı. Sağda, 3 damlacığın tek tek fotoğrafları, orijinal bir lizata (100) ve iki seyreltmeye (101, 102) karşılık gelir. Fotoğraflar, 18-55 mm yakınlaştırma lensi (plaka) veya 105 mm makro lens (damlacıklar) ile donatılmış bir DSRL kamera kullanılarak çekildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65447/65447fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
5. Fiji'de mikro koloni oluşturan birim sayımı (ImageJ)
NOT: mCFU yöntemi, büyük numune setlerinin CFU miktar tayinine izin verir. Koloni sayımını kolaylaştırmak için damlacıkların resimleri posterior analiz için kaydedilebilir. Birkaç fotoğraf cihazı bu amaç için yeterli kalitede görüntüler üretebilir. Bunlara dijital kameralar, web kameraları, kameraya bağlı mikroskoplar ve büyüteçler ve cep telefonları dahildir. ImageJ gibi ücretsiz görüntü analiz yazılımları, bu görüntülerde manuel veya otomatik koloni sayımı imkanı sunar. Her iki yöntemi de göstermek için, bilimsel görüntü analizi için çeşitli araçları paketleyen bir ImageJ dağılımı olan Fiji kullanılacaktır30. Fiji, https://fiji.sc/'dan indirilebilir.
<ol><li>Manuel sayma yöntemi<ol><li>Fiji'de mCFU'yu içeren görüntüyü açın. Hücre sayacını analiz > > Eklentiler'i seçin.</li>
		<li>Hücre Sayacı menüsünde Başlat'ı seçin ve ardından bir sayaç seçin (örneğin, Tür 1).</li>
		<li>Her koloniye tıklayarak devam edin. Her tıklama resimde gösterilecek ve sayacı güncelleyecektir (Şekil 3). Yanlışlıkla yapılan tıklamaları geri almak için Sil'i seçin.</li>
		<li>Sayaçta görüntülenen değeri kaydedin. Sayımı sıfırlamak ve ek örnekleri saymak için yeni bir görüntü açmak için Sıfırla düğmesine tıklayın. NOT: Bu eklenti hakkında daha fazla talimat https://imagej.net/plugins/cell-counter'de bulunabilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Otomatik sayma yöntemi<ol><li>Fiji'de mCFU'yu içeren görüntüyü açın. Görüntü > Türü > 8 bit'i seçin. Bu, görüntüyü 8 bit gri tonlamalı bir görüntüye dönüştürecektir.</li>
		<li>Araç çubuğunda Oval aracını seçin ve kolonilerin bulunduğu alanın çevresine bir oval çizin (Şekil 4A). Oval çizildikten sonra ayarlanabilir.</li>
		<li>Dış alandaki parazitleri kaldırmak için Düzenle > Dışını Temizle'yi seçin (Şekil 4B). Görüntü > Eşiği Ayarla>yı seçin.</li>
		<li>Eşik menüsündeki kaydırıcıları, koloniler kırmızı görünene ve arka plan gürültüsü en aza indirilene kadar hareket ettirin (Şekil 4C).</li>
		<li>Uygula'yı seçin ve eşik penceresinden çıkın. Siyah beyaz bir görüntü oluşturulur (Şekil 4D).</li>
		<li>Analiz Et > Parçacıkları Analiz Et'i seçin. Parçacıkları analiz et penceresinde, koloni alanı (1 ile sonsuz arasında, kare piksel cinsinden ölçülür) ve dairesellik (0 ile 1 arasında, burada 1 mükemmel bir dairedir; Şekil 4E).</li>
		<li>Göster açılır menüsünde Anahatlar'ı seçin. Sonuçlar penceresinde her koloni için ayrıntılı ölçümler için Sonuçları Görüntüle'yi işaretleyin. Önceki ölçümleri silmek için Sonuçları Temizle'yi işaretleyin. Ölçümlerin özetlenmiş sonuçlarını görüntülemek için Özetle kutusunu işaretleyin (Şekil 4E).</li>
		<li>Tamam'ı seçerek çözümleyiciyi başlatın. Algılanan ve sayılan tüm ana hatlarıyla belirtilen kolonileri görüntüleyen yeni bir pencere açılır. Sonuçlar penceresi her koloni için ayrıntıları görüntüler ve özetlenmiş sonuçlar penceresi sayılan toplam kolonileri gösterir (Şekil 4F). NOT: Boyut ve dairesellik ayarları, görüntünün çözünürlüğüne ve büyütmesine ve kolonilerin boyutuna ve şekline göre değişir. Tüm kolonileri algılayan en iyi ayarlar bulunana kadar işlemi birkaç kez tekrarlayın. Analiz parçacıkları eklentisi hakkında daha fazla talimat https://imagej.nih.gov/ij/docs/menus/analyze.html#ap'da bulunabilir.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65447/65447fig03.jpg"> Şekil 3. Fiji yazılımındaki hücre sayacı eklentisini kullanarak mCFU'yu saymak için manuel bir yöntem. Mavi noktalar, kullanıcı tarafından zaten tıklanmış kolonileri gösterir. Sağdaki menü, o ana kadar sayılan koloni sayısını gösterir (sayı 41'dir). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65447/65447fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65447/65447fig04.jpg"> Şekil 4. Fiji yazılımını kullanarak mCFU'yu saymak için otomatik bir yöntem. (A, B) Kolonilerle ilgilenilen bölge, oval seçim aracı kullanılarak seçilir ve dış alan, dışını temizle komutu kullanılarak kaldırılır. (C, D) Eşik aracı kullanılarak kolonilerin siyah beyaz bir görüntüsü oluşturulur. (E, F) Koloni sayısı, parçacıkları analiz etme aracı kullanılarak ölçülür. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65447/65447fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Mikro-CFU Yöntemi Kullanılarak Tüberküloz Tespitinin Hızlandırılması

<ol>
	<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Global Tuberculosis Report 2022. , (2022).</li><li>Bettencourt, P. J. G., Joosten, S. A., Lindestam Arlehamn, C. S., Behr, M. A., Locht, C., Neyrolles, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=100+years+of+the+Bacillus+Calmette-Guérin+vaccine.">100 years of the Bacillus Calmette-Guérin vaccine.</a> Vaccine. 39 (50), 7221-7222 (2021).</li><li>Bettencourt, P. J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+100th+anniversary+of+bacille+Calmette-Gu&#233;rin+(BCG)+and+the+latest+vaccines+against+COVID-19.">The 100th anniversary of bacille Calmette-Gu&#233;rin (BCG) and the latest vaccines against COVID-19.</a> The International Journal of Tuberculosis and Lung Disease. 25 (8), 611-613 (2021).</li><li>Scriba, T. J., Netea, M. G., Ginsberg, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Key+recent+advances+in+TB+vaccine+development+and+understanding+of+protective+immune+responses+against+Mycobacterium+tuberculosis.">Key recent advances in TB vaccine development and understanding of protective immune responses against Mycobacterium tuberculosis.</a> Seminars in Immunology. 50, 101431 (2020).</li><li>McShane, H., Williams, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+preclinical+animal+models+utilised+for+TB+vaccine+evaluation+in+the+context+of+recent+human+efficacy+data.">A review of preclinical animal models utilised for TB vaccine evaluation in the context of recent human efficacy data.</a> Tuberculosis. 94 (2), 105-110 (2014).</li><li>Voss, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+challenges+in+TB+vaccine+development.">Progress and challenges in TB vaccine development.</a> F1000Research. 7, 199 (2018).</li><li>Satti, I., McShane, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+approaches+toward+identifying+a+correlate+of+immune+protection+from+tuberculosis.">Current approaches toward identifying a correlate of immune protection from tuberculosis.</a> Expert Review of Vaccines. 18 (1), 43-59 (2019).</li><li>Young, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+tuberculosis.">Animal models of tuberculosis.</a> European Journal of Immunology. 39 (8), 2011-2014 (2009).</li><li>Pedroza-Rold&#225;n, C., Flores-Valdez, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+mouse+models+and+vaccine+candidates+for+preventing+chronic/latent+tuberculosis+infection+and+its+reactivation.">Recent mouse models and vaccine candidates for preventing chronic/latent tuberculosis infection and its reactivation.</a> Pathogens and disease. 75 (6), (2017).</li><li>Gong, W., Liang, Y., Wu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+Models+of+Tuberculosis+Vaccine+Research:+An+Important+Component+in+the+Fight+against+Tuberculosis.">Animal Models of Tuberculosis Vaccine Research: An Important Component in the Fight against Tuberculosis.</a> BioMed Research International. 2020, 1-21 (2020).</li><li>Bettencourt, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+antigens+presented+by+MHC+for+vaccines+against+tuberculosis.">Identification of antigens presented by MHC for vaccines against tuberculosis.</a> NPJ vaccines. 5 (1), 2 (2020).</li><li>Moorlag, S. J. C. F. M., Arts, R. J. W., van Crevel, R., Netea, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-specific+effects+of+BCG+vaccine+on+viral+infections.">Non-specific effects of BCG vaccine on viral infections.</a> Clinical Microbiology and Infection. 25 (12), 1473-1478 (2019).</li><li>Wilkie, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+in-vitro+evaluation+of+the+non-specific+effects+of+BCG+vaccination+in+a+randomised+controlled+clinical+study.">Functional in-vitro evaluation of the non-specific effects of BCG vaccination in a randomised controlled clinical study.</a> Scientific Reports. 12 (1), 7808 (2022).</li><li>Netea, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trained+immunity:+A+program+of+innate+immune+memory+in+health+and+disease.">Trained immunity: A program of innate immune memory in health and disease.</a> Science. 352 (6284), aaf1098 (2016).</li><li>Bettencourt, P., Pires, D., Carmo, N., Anes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+Confocal+Microscopy+for+Quantification+of+Intracellular+Mycobacteria+in+Macrophages.">Application of Confocal Microscopy for Quantification of Intracellular Mycobacteria in Macrophages.</a> Microscopy: Science, Technology, Applications and Education. 1, 614-621 (2010).</li><li>Bettencourt, P., Carmo, N., Pires, D., Tim&#243;teo, P., Anes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterial+infection+of+macrophages:+the+effect+of+the+multiplicity+of+infection.">Mycobacterial infection of macrophages: the effect of the multiplicity of infection.</a> Antimicrobial research: Novel bioknowledge and educational programs. , 651-664 (2017).</li><li>Pires, D., Bettencourt, P., Carmo, N., Niederweis, M., Anes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Mycobacterium+tuberculosis+outer-membrane+porins+in+bacterial+survival+within+macrophages.">Role of Mycobacterium tuberculosis outer-membrane porins in bacterial survival within macrophages.</a> Drug Discovery Today. 15 (23-24), 1112-1113 (2010).</li><li>Pires, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+tuberculosis+Modulates+miR-106b-5p+to+Control+Cathepsin+S+Expression+Resulting+in+Higher+Pathogen+Survival+and+Poor+T-Cell+Activation.">Mycobacterium tuberculosis Modulates miR-106b-5p to Control Cathepsin S Expression Resulting in Higher Pathogen Survival and Poor T-Cell Activation.</a> Frontiers in immunology. 8 (DEC), 1819 (2017).</li><li>Pires, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Cathepsins+in+Mycobacterium+tuberculosis+Survival+in+Human+Macrophages.">Role of Cathepsins in Mycobacterium tuberculosis Survival in Human Macrophages.</a> Scientific reports. 6 (August), 32247 (2016).</li><li>Bettencourt, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin-binding+protein+regulation+by+microRNAs+as+a+novel+microbial+strategy+to+modulate+phagocytosis+by+host+cells:+the+case+of+N-Wasp+and+miR-142-3p.">Actin-binding protein regulation by microRNAs as a novel microbial strategy to modulate phagocytosis by host cells: the case of N-Wasp and miR-142-3p.</a> Frontiers in cellular and infection microbiology. 3 (June), 19 (2013).</li><li>Bhuyan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microliter+spotting+and+micro-colony+observation:+A+rapid+and+simple+approach+for+counting+bacterial+colony+forming+units.">Microliter spotting and micro-colony observation: A rapid and simple approach for counting bacterial colony forming units.</a> Journal of Microbiological Methods. 207, 106707 (2023).</li><li>Jackson, S., McShane, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+Developing+a+Controlled+Human+Tuberculosis+Challenge+Model.">Challenges in Developing a Controlled Human Tuberculosis Challenge Model.</a> Current topics in microbiology and immunology. , 1-27 (2022).</li><li>Darrah, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+tuberculosis+in+macaques+after+intravenous+BCG+immunization.">Prevention of tuberculosis in macaques after intravenous BCG immunization.</a> Nature. 577 (7788), 95-102 (2020).</li><li>Madura Larsen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BCG+stimulated+dendritic+cells+induce+an+interleukin-10+producing+T-cell+population+with+no+T++helper+1+or+T+helper+2+bias+in+vitro.">BCG stimulated dendritic cells induce an interleukin-10 producing T-cell population with no T helper 1 or T helper 2 bias in vitro.</a> Immunology. 121 (2), 276-282 (2007).</li><li>Bickett, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+BCG-Induced+Macrophage+and+Neutrophil+Mechanisms+for+Defense+Against+Mycobacterium+tuberculosis.">Characterizing the BCG-Induced Macrophage and Neutrophil Mechanisms for Defense Against Mycobacterium tuberculosis.</a> Frontiers in immunology. 11, 1202 (2020).</li><li>Pires, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interference+of+Mycobacterium+tuberculosis+with+the+endocytic+pathways+on+macrophages+and+dendritic+cells+from+healthy+donors:+role+of+cathepsins.">Interference of Mycobacterium tuberculosis with the endocytic pathways on macrophages and dendritic cells from healthy donors: role of cathepsins.</a> Drug Discovery Today. 15 (23-24), 1112-1112 (2010).</li><li>Betts, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimising+Immunogenicity+with+Viral+Vectors:+Mixing+MVA+and+HAdV-5+Expressing+the+Mycobacterial+Antigen+Ag85A+in+a+Single+Injection.">Optimising Immunogenicity with Viral Vectors: Mixing MVA and HAdV-5 Expressing the Mycobacterial Antigen Ag85A in a Single Injection.</a> PLoS ONE. 7 (12), e50447 (2012).</li><li>Tanner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+haemoglobin+and+iron+on+in+vitro+mycobacterial+growth+inhibition+assays.">The influence of haemoglobin and iron on in vitro mycobacterial growth inhibition assays.</a> Scientific reports. 7 (1), 43478 (2017).</li><li>McNeill, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+mycobacterial+infection+by+macrophage+Gch1+and+tetrahydrobiopterin.">Regulation of mycobacterial infection by macrophage Gch1 and tetrahydrobiopterin.</a> Nature communications. 9 (1), 5409 (2018).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Pereira, M., Vale, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saquinavir:+From+HIV+to+COVID-19+and+Cancer+Treatment.">Saquinavir: From HIV to COVID-19 and Cancer Treatment.</a> Biomolecules. 12 (7), 944 (2022).</li><li>Pires, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repurposing+Saquinavir+for+Host-Directed+Therapy+to+Control+Mycobacterium+Tuberculosis+Infection.">Repurposing Saquinavir for Host-Directed Therapy to Control Mycobacterium Tuberculosis Infection.</a> Frontiers in immunology. 12, 647728 (2021).</li><li>Pires, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomal+Delivery+of+Saquinavir+to+Macrophages+Overcomes+Cathepsin+Blockade+by+Mycobacterium+tuberculosis+and+Helps+Control+the+Phagosomal+Replicative+Niches.">Liposomal Delivery of Saquinavir to Macrophages Overcomes Cathepsin Blockade by Mycobacterium tuberculosis and Helps Control the Phagosomal Replicative Niches.</a> International journal of molecular sciences. 24 (2), (2023).</li><li>Maartens, G., Wilkinson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuberculosis.">Tuberculosis.</a> The Lancet. 370 (9604), 2030-2043 (2007).</li><li>Matarazzo, L., Bettencourt, P. J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+vaccines:+a+new+opportunity+for+malaria,+tuberculosis+and+HIV.">mRNA vaccines: a new opportunity for malaria, tuberculosis and HIV.</a> Frontiers in Immunology. 14, 1172691 (2023).</li><li>Young, D., Dye, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Development+and+Impact+of+Tuberculosis+Vaccines.">The Development and Impact of Tuberculosis Vaccines.</a> Cell. 124 (4), 683-687 (2006).</li><li>Kommareddi, S., Abramowsky, C. R., Swinehart, G. L., Hrabak, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nontuberculous+mycobacterial+infections:+Comparison+of+the+fluorescent+auramine-o+and+Ziehl-Neelsen+techniques+in+tissue+diagnosis.">Nontuberculous mycobacterial infections: Comparison of the fluorescent auramine-o and Ziehl-Neelsen techniques in tissue diagnosis.</a> Human Pathology. 15 (11), 1085-1089 (1984).</li><li>Sabiiti, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Tuberculosis+Molecular+Bacterial+Load+Assay+(TB-MBLA).">A Tuberculosis Molecular Bacterial Load Assay (TB-MBLA).</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (158), e60460 (2020).</li><li>Somosko&#776;vi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Recoveries+of+Mycobacterium+tuberculosis+Using+the+Automated+BACTEC+MGIT+960+System,+the+BACTEC+460+TB+System,+and+Lo&#776;wenstein-Jensen+Medium.">Comparison of Recoveries of Mycobacterium tuberculosis Using the Automated BACTEC MGIT 960 System, the BACTEC 460 TB System, and Lo&#776;wenstein-Jensen Medium.</a> Journal of Clinical Microbiology. 38 (6), 2395-2397 (2000).</li><li>Tanner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vitro+direct+mycobacterial+growth+inhibition+assay+(MGIA)+for+the+early+evaluation+of+TB+vaccine+candidates+and+assessment+of+protective+immunity:+a+protocol+for+non-human+primate+cells.">The in vitro direct mycobacterial growth inhibition assay (MGIA) for the early evaluation of TB vaccine candidates and assessment of protective immunity: a protocol for non-human primate cells.</a> F1000Research. 10, 257 (2021).</li></ol>

DP ve PJGB, çalışmanın potansiyel bir çıkar çatışması olarak yorumlanabilecek herhangi bir ticari veya finansal ilişkinin yokluğunda yürütüldüğünü beyan eder.

Tüberküloz, özellikle düşük ve orta gelirli ülkelerde önemi giderek artan önemli bir halk sağlığı sorunudur. COVID-19 pandemisi sırasında tüberkülozu teşhis ve tedavi etmek için sağlık hizmeti ortamlarının bozulması, yeni vakaların görülme sıklığı üzerinde olumsuz bir etkiye neden olmuştur1. Ek olarak, bu salgını kontrol etmek için çoklu ilaç ve yaygın ilaca dirençli M.tb suşları ve M.tb ve HIV'in birlikte enfeksiyonu acilen ele alınmal?...

Tüberküloz (TB), tek bir enfeksiyöz ajan olan Mycobacterium tuberculosis (M.tb) bakterisinin dünya çapında önde gelen ölüm nedenidir ve diğer tüm patojenlerden daha fazla insanı öldürür. 2021'de tüberküloz 1,6 milyon ölümden sorumluydu ve 2019-2021 pandemisi sırasında COVID-19 tarafından aşıldı1. Ayrıca, Dünya Sağlık Örgütü'nün 2022 küresel TB raporuna göre, COVID-19 salgını yeni TB vakalarındaki artıştan sorumluydu. DSÖ ayrıca bu dönemde TB teşhisi konan kişi sayısında büyük düşüşler olduğunu ve bunun TB vakalarının sayısını daha da artırabileceğini bildirmektedir1.
Bacillus Calmette-Guérin (BCG), 100 yıldan daha uzun bir süre önce ilk kez aşı olarak kullanılan patojenik Mycobacterium bovis'in canlı zayıflatılmış bir türüdür. Bu, tüberküloza karşı tek aşıdır ve halen kullanımda olan dünyanın en eski lisanslı aşısıdır 2,3. Şu anda, klinik deneylerin farklı aşamalarında12 aşı bulunmaktadır 4 ve düzinelerce aşı klinik öncesi geliştirme aşamasındadır 5,6. Tüberküloza karşı aşıların klinik öncesi değerlendirmesi, zebra balığı, fareler, kobaylar, tavşanlar, sığırlar ve insan olmayan primatlar gibi çeşitli hayvan modellerinde elde edilebilen güvenlik ve immünojenisitenin7 değerlendirilmesini içerir 8,9,10. Ek olarak, bir aşının M.tb enfeksiyonuna ve/veya bulaşmasına karşı koruma sağlama kapasitesinin, yani aşı etkinliğinin değerlendirilmesi, in vivo 5,11. İlginç bir şekilde, BCG aşısı, eğitilmiş bağışıklık mekanizması12,13 yoluyla diğer bakteriyel ve viral patojenlerin14 hayatta kalmasını etkileyen spesifik olmayan etkilere neden olur. Enfekte bir hayvandaki canlı bakteri yükünü ölçmek için tercih edilen yöntem, koloni oluşturan birimler (CFU)testi 5,15 yoluyla bakteri kolonilerinin sayımıdır. CFU, belirli büyüme koşulları altında koloniler oluşturan mikroorganizmaların (bakteri veya mantar) sayısını tahmin eden bir birimdir. CFU'lar canlı ve replikatif mikroorganizmalardan kaynaklanır ve her kolonideki canlı mikroorganizmaların mutlak sayısını tahmin etmek zordur. Bir koloninin bir veya daha fazla mikroorganizmadan kaynaklanıp kaynaklanmadığı belirsizdir. CFU birimi bu belirsizliği yansıtır, bu nedenle aynı numunenin kopyalarında büyük bir değişkenlik gözlemlenebilir. Bu zaman alıcı tahlil, bir biyogüvenlik seviyesi 3 (BSL3) tesisinde, önemli laboratuvar ve inkübatör alanında çalışmak üzere eğitilmiş uzman teknisyenler gerektirir, sonuçlanması 4 ila 6 hafta sürer ve kontaminasyona eğilimlidir.
Bu çalışmada, koloni sayımı için optimize edilmiş bir yöntem olan mikro-CFU'yu (mCFU) tanımladık vesonuçları analiz etmek için basit ve hızlı bir çözüm sunuyoruz 15,16,17,18,19,20. mCFU tahlili on kat daha az reaktif gerektirir, kuluçka süresini üç kat azaltır, sonuçlanması 1 ila 2 hafta sürer, laboratuvar alanını ve reaktif maliyetini azaltır ve çok sayıda M.tb ile çalışmanın getirdiği sağlık ve güvenlik risklerini en aza indirir. Bu yöntemin, aşı etkinliğinin belirlenmesine yönelik klinik öncesi çalışmalar için evrensel olarak benimsenmesini ve sonuçta TB'ye karşı aşıların geliştirilmesinde zamanın azalmasına yol açmasını öneriyoruz. Son olarak, bu optimize edilmiş CFU sayım yöntemi, yalnızca Mikobakterileri değil, aynı zamanda Escherichia coli ve Ralstonia solanacearum21 gibi diğer bakterileri de ölçmek için kullanılmıştır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-2781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSLR 15-55 mm lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>AF-P DX NIKKOR 18-55mm f/3.5-5.6G VR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSLR camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>D3400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSLR macro lens</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>MACRO 105mm F2.8 EX DG OS HSM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji Software</td>
			<td></td>
			<td>https://fiji.sc/</td>
			<td>Fiji is an open-source software supported by several laboratories, institutions, and individuals. All the required plugins are included.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal CA-630</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>18896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H10</td>
			<td>BD</td>
			<td>262710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H9</td>
			<td>BD</td>
			<td>271310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel pipette (0.5 - 10 &#181;l)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel pipette (20 - 200 &#181;l)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycobacterium bovis BCG&#160;</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>ATCC35734</td>
			<td>strain TMC 1011 [BCG Pasteur]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OADC enrichment</td>
			<td>BD</td>
			<td>211886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>NZYTech</td>
			<td>MB25201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21875091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer UV-6300PC</td>
			<td>VWR</td>
			<td>634-6041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square Petri dish 120 x 120 mm</td>
			<td>Corning</td>
			<td>BP124-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyloxapol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasound bath Elma P 30 H</td>
			<td>VWR</td>
			<td>142-0051</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

micro-colony forming unit assay for efficacy evaluation of vaccines against tuberculosis

Bulaşıcı bir ajan tarafından dünya çapında önde gelen ölüm nedeni olan tüberküloz (TB), 2022'de 1,6 milyon insanı öldürdü, ancak 2019-2021 pandemisi sırasında COVID-19 tarafından aşıldı. Hastalığa Mycobacterium tuberculosis (M.tb) bakterisi neden olur. Tek tüberküloz aşısı olan Mycobacterium bovis suşu Bacillus Calmette-Guérin (BCG), halen kullanımda olan dünyanın en eski lisanslı aşısıdır. Şu anda klinik deneylerde 12 aşı ve klinik öncesi geliştirilmekte olan düzinelerce aşı var. Klinik öncesi çalışmalarda TB aşılarının etkinliğini değerlendirmek için kullanılan tercih edilen yöntem, bakteri kolonilerinin koloni oluşturan birimler (CFU) testi ile sayımıdır. Bu zaman alıcı tahlilin sonuçlanması 4 ila 6 hafta sürer, önemli laboratuvar ve inkübatör alanı gerektirir, yüksek reaktif maliyetlerine sahiptir ve kontaminasyona eğilimlidir. Burada, M.tb aşısının etkinlik sonuçlarını analiz etmek için basit ve hızlı bir çözüm sunan, koloni sayımı için optimize edilmiş bir yöntem olan mikro-CFU'yu (mCFU) açıklıyoruz. mCFU tahlili on kat daha az reaktif gerektirir, kuluçka süresini üç kat azaltır, sonuçlanması 1 ila 2 hafta sürer, laboratuvar alanını ve reaktif maliyetini azaltır ve çok sayıda M.tb ile çalışmanın getirdiği sağlık ve güvenlik risklerini en aza indirir. Ayrıca, bir TB aşısının etkinliğini değerlendirmek için, Mikobakteriler ile enfekte olmuş aşılanmış hayvanlardan alınan dokular da dahil olmak üzere çeşitli kaynaklardan örnekler alınabilir. Ayrıca, enfeksiyon çalışmaları için tek hücreli, tek tip ve yüksek kaliteli bir mikobakteri kültürü üretmek için optimize edilmiş bir yöntem açıklıyoruz. Son olarak, bu yöntemlerin aşı etkinliğinin belirlenmesine yönelik klinik öncesi çalışmalar için evrensel olarak benimsenmesini ve sonuçta TB'ye karşı aşıların geliştirilmesinde zamanın azalmasına yol açmasını öneriyoruz.

Tuberculosis (TB) is the leading cause of death worldwide by a single infectious agent, bacterium Mycobacterium tuberculosis (M.tb), killing more people than any other pathogen. In 2021, TB was responsible for 1.6 million deaths and was surpassed by COVID-19 during the 2019-2021 pandemic1. Moreover, according to the World Health Organization&#180;s global TB report of 2022, the COVID-19 pandemic was responsible for an increase in new TB cases. The WHO also reports large drops in the number of people diagnosed with TB during this period, which could increase further the number of TB cases1.
The Bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG) is a live-attenuated strain of the pathogenic Mycobacterium bovis, used for the first time as a vaccine more than 100 years ago. This is the only vaccine against TB and is the oldest licensed vaccine in the world still in use2,3. Currently, there are 12 vaccines in different phases of clinical trials4, and dozens of vaccines are under pre-clinical development5,6. Pre-clinical assessment of vaccines against TB includes the evaluation of the safety and immunogenicity7, which can be obtained in diverse animal models such as zebrafish, mice, guinea pigs, rabbits, cattle, and non-human primates8,9,10. Additionally, assessing the capacity of a vaccine to induce protection against M.tb infection and/or transmission, i.e., the vaccine efficacy, requires an M.tb challenge in vivo5,11. Interestingly, BCG vaccination induces non-specific effects that affect the survival of other bacterial and viral pathogens12,13&#160;through the mechanism of trained immunity14. To quantify the viable bacterial burden in an infected animal, the method of choice is the enumeration of bacterial colonies through the colony-forming units (CFU) assay5,15. CFU is a unit that estimates the number of microorganisms (bacteria or fungi) that form colonies under specific growth conditions. CFUs originate from viable and replicative microorganisms, and the absolute number of living microorganisms within each colony is difficult to estimate. It is uncertain whether a colony has originated from one or more microorganisms. The CFU unit reflects this uncertainty, hence a great variability can be observed in replicates of the same sample. This time-consuming assay requires specialized technicians trained to work in a biosafety level 3 (BSL3) facility, substantial laboratory and incubator space, takes from 4 to 6 weeks to conclude, and is prone to contamination.
In this study, we describe an optimized method for colony enumeration, the micro-CFU (mCFU), and offer a simple and rapid solution to analyze the results15,16,17,18,19,20. The mCFU assay requires tenfold fewer reagents, reduces the incubation period threefold, taking 1 to 2 weeks to conclude, reduces lab space and reagent cost, and minimizes the health and safety risks associated with working with large numbers of M.tb. We propose that this method should be universally adopted for pre-clinical studies of vaccine efficacy determination, ultimately leading to time reduction in the development of vaccines against TB. Finally, this optimized method of CFU enumeration has been used to quantify not only Mycobacteria but also other bacteria, such as Escherichia coli and Ralstonia solanacearum21.

Yazar Gündemi: TB Aşı Etkinliğinin ve Antijen Sunum Analizinin Etkili Değerlendirmesi için CFU Belirlemesini Optimize Etme 

Tüberküloza Karşı Aşıların Etkinlik Değerlendirmesi için Mikro Koloni Oluşturan Birim Testi

Burada açıklanan mCFU testi, tek bir Petri kabından alınabilecek bilgi miktarını en az 96 kata çıkarır. Şekil 5, tüberkülozu tedavi etmek için konakçıya yönelik bir ilaç olarak sakinavirin (SQV)31,32 yeniden amaçlı kullanımı için iki ilaç verme yönteminin karşılaştırmasını göstermektedir. Bu tahlilde, primer insan makrofajlarını enfekte etmek için dört farklı Mycobacterium tuberculosis su?...

Watch this Scientific Journal Video about Optimizing CFU Determination for Efficient Assessment of TB Vaccine Efficacy and Antigen Presentation Analysis at JoVE.com

Koloni oluşturan birimlerin (CFU) belirlenmesi, görünür koloniler oluşturması haftalar sürebilen Mycobacterium tuberculosis de dahil olmak üzere bakterilerin miktarını belirlemek için altın standart tekniktir. Burada, artan zaman verimliliği, azaltılmış laboratuvar alanı ve reaktif maliyeti ve orta ve yüksek verimli deneylere ölçeklenebilirlik ile CFU belirleme için bir mikro-CFU'yu açıklıyoruz.

Tuberculosis (TB), the leading cause of death worldwide by an infectious agent, killed 1.6 million people in 2022, only being surpassed by COVID-19 during ...

Bakterilere karşı bağışıklık tepkisinin etkinliğini ölçmek için CFU tayini gereklidir. Bununla birlikte, çok düşük verimlidir ve Mycobacterium tuberculosis gibi patojenik bakterilere uygulandığında hantal ve pahalı hale gelir. Bu, büyük tedavi panellerini test etmemiz gerektiğinde önemli bir sınırlamadır.Araştırma, tüberküloz ve tüberküloz aşılarının değerlendirilmesine odaklanmaktadır. Mycobacterium tuberculosis'e karşı aşıların güvenliğini, immünojenisitesini ve etkinliğini araştırır. Çalışma, klinik öncesi çalışmalarda aşı etkinliğini değerlendirmek için bakteri kolonilerini numaralandırmak için mikro-CFU'ya optimize edilmiş bir yöntem sunmaktadır.Bu protokol, normal bir Petri kabından elde edilenlere benzer küçük bir damlacıktan sonuçlar üreterek CFU tayinini optimize etmeyi amaçlamaktadır. Bu kadar küçük bir numuneden bakteri canlılığını ölçmek, klasik yöntem için gerekli olan malzemelerin ve zamanın bir kısmını kullanarak binlerce veri noktasını analiz etmemizi sağlar. Araştırmamız, antijen sunum mekanizmasını incelemeyi ve antijen sunumunu optimize etmek için en uygun antijenleri belirlemeyi amaçlamaktadır.Bu, BCG olan mevcut TB aşısını iyileştirmek veya değiştirmek için daha iyi aşılar tasarlamamız ve geliştirmemiz için bizi bilgilendirecektir.

micro-colony-forming-unit-assay-for-efficacy-evaluation-vaccines

Research

JoVE Journal

Medicine

Micro-Colony Forming Unit Assay for Efficacy Evaluation of Vaccines Against Tuberculosis

1.5K Görüntüleme.  Universidade Católica Portuguesa. Bakterilere karşı bağışıklık tepkisinin etkinliğini ölçmek için CFU tayini gereklidir. Bununla birlikte, çok düşük verimlidir ve Mycobacterium tuberculosis gibi patojenik bakterilere uygulandığında hantal ve pahalı hale gelir. Bu, büyük tedavi panellerini test etmemiz gerektiğinde önemli bir sınırlamadır.Araştırma, tüberküloz ve tüberküloz aşılarının değerlendirilmesine odaklanmaktadır. Mycobacterium tuberculosis'e karşı aşıların güvenliğini...

Video: Yazar Gündemi: TB Aşı Etkinliğinin ve Antijen Sunum Analizinin Etkili Değerlendirmesi için CFU Belirlemesini Optimize Etme 

Tuberculosis (TB), the leading cause of death worldwide by an infectious agent, killed 1.6 million people in 2022, only being surpassed by COVID-19 during the 2019-2021 pandemic. The disease is caused by the bacterium Mycobacterium tuberculosis (M.tb). The Mycobacterium bovis strain Bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG), the only TB vaccine, is the oldest licensed vaccine in the world, still in use. Currently, there are 12 vaccines in clinical trials and dozens of vaccines under pre-clinical development. The method of choice used to assess the efficacy of TB vaccines in pre-clinical studies is the enumeration of bacterial colonies by the colony-forming units (CFU) assay. This time-consuming assay takes 4 to 6 weeks to conclude, requires substantial laboratory and incubator space, has high reagent costs, and is prone to contamination. Here we describe an optimized method for colony enumeration, the micro-CFU (mCFU), that offers a simple and rapid solution to analyze M.tb vaccine efficacy results. The mCFU assay requires tenfold fewer reagents, reduces the incubation period threefold, taking 1 to 2 weeks to conclude, reduces lab space and reagent cost, and minimizes the health and safety risks associated with working with large numbers of M.tb. Moreover, to evaluate the efficacy of a TB vaccine, samples may be obtained from a variety of sources, including tissues from vaccinated animals infected with Mycobacteria. We also describe an optimized method to produce a unicellular, uniform, and high-quality mycobacterial culture for infection studies. Finally, we propose that these methods should be universally adopted for pre-clinical studies of vaccine efficacy determination, ultimately leading to time reduction in the development of vaccines against TB.

The determination of colony-forming units (CFU) is the gold-standard technique for quantifying bacteria, including Mycobacterium tuberculosis which can take weeks to form visible colonies. Here we describe a micro-CFU for CFU determination with increased time efficiency, reduced lab space and reagent cost, and scalability to medium and high throughput experiments.