이 작업은 UIDP/04279/2020, UIDB/04279/2020 및 EXPL/SAU-INF/0742/2021 보조금에 따라 Universidade Católica Portuguesa 의과대학의 내부 자금과 Fundação para a Ciência e a Tecnologia(FCT)의 외부 자금으로 지원되었습니다.

참고: 여기에 설명된 프로토콜은 BCG용이지만 모든 마이코박테리아에 적용할 수 있습니다. BCG는 BSL3 시설을 이용할 수 없을 때 결핵 실험을 위한 대리 세균으로 사용될 수 있다22. BCG를 사용하는 다음 절차는 생물 안전 레벨 2 (BSL2) 실험실에서 수행해야하며 위험 그룹 2 미생물 조작에 대한 적절한 생물 안전 지침 및 우수 실험실 관행을 따라야합니다.
1. 배양액 준비
<ol><li>공급업체의 지침에 따라 7%(v/v) 올레산, 알부민, 덱스트로오스 및 카탈라아제(OADC) 농축이 보충된 Middlebrook 9H10 육수를 준비합니다. 육수에 0.05%(v/v)의 타이록사폴을 보충합니다. 참고: Tyloxapol은 박테리아 덩어리 형성을 방지하기 위해 계면활성제로 사용된 비이온성 액체 폴리머입니다16.</li>
	<li>공급업체의 지침에 따라 7%(v/v) OADC 농축이 보충된 Middlebrook 10H10 고체 배지를 준비합니다.</li>
	<li>정사각형 페트리 접시(120mm x 120mm)당 40mL의 배지를 분배합니다. 한천 표면의 응결을 최소화하기 위해 플레이트를 건조시키십시오. 알림: 이 특정 크기의 페트리 접시는 96웰 플레이트에서 최소 96개의 물방울을 직접 전치할 수 있도록 하는 데 기본입니다. 플레이트의 효과적인 건조는 나중에 박테리아 현탁액의 작은 물방울의 도금을 용이하게 하고 물방울이 퍼지는 것을 방지합니다.</li>
	<li>감염 배지를 생산하기 위해 Roswell Park Memorial Institute 배지(RPMI 1640) 또는 Dulbecco's Modified Eagle 배지(DMEM)를 준비합니다. 두 경우 모두 배지에 10% 태아 송아지 혈청, 1% L-글루타민, 1mM 피루브산 나트륨을 보충하십시오. 페니실린과 스트렙토마이신을 배지에 첨가하지 마십시오.</li>
</ol>2. 샘플 준비
<ol><li>다양한 출처에서 샘플을 얻을 수 있습니다. 일반적으로 결핵 백신의 효능을 평가하기 위해 CFU를 정량화하려면 백신을 접종한 동물과 접종하지 않은 동물 조직에서 샘플을 채취합니다. 예를 들어, 쥐의 폐 및 비장(spleen)11 또는 원숭이 폐(macaque lung), 흉부 및 말초 림프절(superracic lymph nodes), 비장(spleen), 간(liver), 피부(skin), 혈액(blood), 골수(bone marrow), 기관지 폐포 세척(bronchoalveolar lavage wash)23이 있다. 또는 BCG 18,19,20,24,25,26에 감염된 대식세포/수지상세포/호중구의 시험관 내 배양에서 샘플을 얻습니다.</li>
</ol>3. BCG 문화의 생산
참고: 결핵 백신의 생체 내 연구의 목표는 BCG의 효능을 개선하는 것입니다. 따라서 BCG 백신 접종 그룹이 일반적으로 대조군으로 사용됩니다. 인간 백신 접종에 사용되는 BCG 균주는 동물 모델 테스트에 이상적입니다. 이 경우 BCG 문화는 공급자의 지침27에 따라 재구성되어야 합니다. 그러나, 생체 내 연구를 위한 BCG 배양물은 또한 사내에서 생산될 수 있다11. 체외 감염 프로토콜을 위한 단세포, 균일 및 고품질 BCG 배양의 생산은 동물 챌린지 연구에도 사용할 수 있는 다음 프로토콜을 사용하여 여러 연구 11,16,18,19,20,26,28,29에서 매우 성공적으로 생산되었습니다.
<ol><li>BCG 50mL를 7H9 육수에 넣고 37°C에서 200rpm에서 교반하여 배양합니다. 실험의 필요에 따라 볼륨을 변경합니다.</li>
	<li>매일 8-10일 동안 100μL의 배양액을 수집하고 1mL 큐벳에 900μL의 PBS를 첨가하여 희석합니다. 그런 다음 박테리아의 광학 밀도를 측정하여 진행합니다(λ=600nm에서 OD; OD600)을 분광 광도계에 담았다. 이러한 값에서 성장 곡선을 그립니다. 문화권의 중간 로그 단계(OD가 시간 단위당 일관되게 두 배가 되는 경우)를 식별합니다.</li>
	<li>후속 배양을 준비하고 3.1 및 3.2단계에서와 같이 중간/후기 로그 성장 단계에 도달할 때까지 배양합니다. 이전 단계에서 얻은 값을 지침으로 사용합니다. 배양이 고정 성장 단계(OD가 안정화되기 시작할 때)에 도달하지 않도록 하여 생존 가능한 박테리아의 양호한 품질의 배양을 유지합니다.</li>
	<li>로그 증가 중간/후기 단계에서 배양을 수집합니다. 3000 x g 에서 10분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거합니다.</li>
	<li>PBS 10mL를 추가하여 박테리아를 씻어냅니다. 3000 x g 에서 10분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거합니다.</li>
	<li>5mL의 감염 배지로 박테리아를 재현탁시킵니다. 튜브를 초음파 수조에 15분 동안 넣고 80Hz에서 최대 전력으로 가열합니다.</li>
	<li>1000 x g 에서 10분 동안 원심분리기 펠릿을 피하는 상층액은 고품질 BCG 배양에서 피해야 하는 박테리아 덩어리가 풍부하므로 수집하여 폐기하십시오.</li>
	<li>상층액의 OD를 측정합니다. 여기서 OD600 이 0.1인 기하급수적 성장 단계의 배양액은 1 x 107 CFU/mL에 해당합니다. 참고: 각 실험실은 분광 광도계를 사용하여 OD600과 CFU 사이의 선형 회귀를 설정하기 위해 실험을 시작하기 전에 자체 BCG 성장 곡선을 생성해야 합니다. 분광 광도계는 광 경로 거리가 다르기 때문에 동일한 샘플에 대해 얻은 판독값이 달라질 수 있습니다.</li>
	<li>간단한 계산을 수행하여 각 숙주 세포 배양에 추가할 박테리아 수를 설정합니다. 숙주 세포당 박테리아 수는 감염 다중성(MOI)입니다. 숙주 세포당 10개의 박테리아 MOI를 사용하며, 이는 BCG 감염 실험에 사용되는 가장 일반적인 MOI입니다.</li>
</ol>4. 단위 분석실험을 형성하는 마이크로 콜로니
참고: in vivo 또는 in vitro 감염 실험이 완료된 후 mCFU로 박테리아 계수를 수행할 수 있습니다. in vivo 연구의 경우, 먼저 비드 비터 또는 다른 조직 균질화기에서 샘플을 균질화해야 합니다. BCG에 감염된 대식세포/수지상세포/호중구의 시험관 내 배양의 경우 비이온성 세제(예: 비이온성, 비변성 세제의 0.05% 용액)를 사용하여 샘플을 용해해야 합니다.
<ol><li>96웰 플레이트를 사용한 연속 희석: 그림 1A의 계획에 따라 멸균 96웰 플레이트에서 용해물을 연속 10배 희석합니다. 용해물을 행 A와 E에 분포시킵니다. 각 플레이트의 최대 샘플 및/또는 반복실험 수는 24개입니다.</li>
	<li>나머지 웰에 180μL의dH2O를 추가하여 연속 희석을 수행합니다.</li>
	<li>12채널 피펫을 사용하여 A열에서 용해물을 재현탁시키고 20μL를 B열로 옮깁니다(20μL 용해물 + 180μLdH2O). 잘 균질화하십시오. D 행의 마지막 희석에 도달 할 때까지 B 행과 C 행에 대해이 단계를 순차적으로 반복합니다. 참고: 우리는 일반적으로 세 번의 희석(100, 101, 102, 103)을 수행하므로 12개의 샘플 및/또는 반복 횟수의 각 세트에 대해 4줄의 플레이트(AD 또는 EH)를 사용합니다.</li>
	<li>마이크로 액적 도금: 그림 1B에 따라 0.5-10μL(얇은 팁 선호) 멀티채널 피펫을 사용하여 96웰 플레이트의 각 행에서 단단한 중간 정사각형 플레이트로 5μL를 전달합니다.</li>
	<li>5μL 방울을 천천히 피펫팅하면서 한천에 약간 닿도록 합니다. 이렇게 하면 팁에서 한천 쪽으로 물방울을 제거하고 팁 내부에 액체가 머무를 가능성을 줄이는 데 도움이 됩니다.</li>
	<li>물방울을 건조시키고 한천 플레이트를 닫은 다음 박테리아 성장을 모니터링하면서 37°C에서 배양합니다. 선택적으로, 플레이트가 건조되는 것을 방지하기 위해 밀봉된 비닐 봉지에 한천 플레이트를 배양합니다.</li>
	<li>마이크로 콜로니 카운팅: 약 6-10일의 배양 후 육안으로 볼 수 있는 개별 콜로니를 확인합니다(그림 2).</li>
	<li>도립 광학 현미경 또는 돋보기의 가장 낮은 배율 대물렌즈(4x 이하)를 사용하여 콜로니를 계산합니다. 콜로니의 수가 300 미만이고 30 이상인 희석액에서 계수를 수행해야합니다. 또는 카메라를 사용하여 물방울 사진을 찍어 컴퓨터에서 수동으로 콜로니를 계산하거나 ImageJ와 같은 소프트웨어를 사용하여 콜로니 카운팅을 자동화합니다.</li>
	<li>세포 수를 CFU/mL로 표현하려면 다음 방정식을 사용하십시오. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/65447/65447eq01.jpg" style="margin: auto;"> 여기서 C = 계수된 콜로니의 수, V = μL로 도금된 부피, Dil = 콜로니가 계수된 희석(100, 101, 102, 103). 예를 들어, 희석 102에서 5 μL 액적에서 30 콜로니를 계수하면 다음과 같습니다. <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/65447/65447eq02.jpg" style="margin: auto;"></li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65447/65447fig01.jpg"> 그림 1. mCFU 프로토콜의 개략도 표현. (A) 96웰 플레이트에서 BCG 함유 용해물의 연속 10배 희석. (B) 고체 배양 배지를 포함하고 각각 5μL의 96개 방울로 오버레이된 정사각형 페트리 접시. 액적은 멀티채널 피펫을 사용하여 96웰 플레이트에서 직접 피펫팅됩니다. BioRender.com 로 만들었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65447/65447fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65447/65447fig02.jpg"> 그림 2. 10일간의 배양 후 BCG의 미세 집락 형성 단위. 왼쪽은 이전에 그림 1B에 표시된 것처럼 각각 5μL의 96개 방울로 겹쳐진 정사각형 페트리 접시의 사진입니다. 오른쪽에서 3 개의 물방울의 개별 사진은 원래 용해물 (100)과 2 개의 희석 (101, 102)에 해당합니다. 사진은 18-55mm 줌 렌즈(플레이트) 또는 105mm 매크로 렌즈(물방울)가 장착된 DSRL 카메라를 사용하여 촬영했습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65447/65447fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
5. 피지에서 단위를 세는 마이크로 콜로니 형성 (ImageJ)
참고: mCFU 분석법을 사용하면 대규모 샘플 세트의 CFU 정량화가 가능합니다. 콜로니 계수를 용이하게 하기 위해 사후 분석을 위해 액적의 사진을 기록할 수 있습니다. 여러 사진 장치는 이러한 목적을 위해 충분한 품질의 이미지를 생성할 수 있습니다. 여기에는 디지털 카메라, 웹캠, 카메라 부착 현미경 및 돋보기, 휴대폰이 포함됩니다. ImageJ와 같은 무료 이미지 분석 소프트웨어는 이러한 이미지에서 수동 또는 자동 콜로니 카운팅의 가능성을 제공합니다. 두 가지 방법을 모두 시연하기 위해, 과학적 이미지 분석(30)을 위한 여러 도구들을 패키징하는 ImageJ의 배포판인 피지가 사용될 것이다. 피지는 https://fiji.sc/ 에서 다운로드 할 수 있습니다.
<ol><li>수동 계수 방법<ol><li>피지에서 mCFU가 포함된 이미지를 엽니다. Plugins(플러그인) > Analyze > Cell Counter(세포 카운터 분석)를 선택합니다.</li>
		<li>셀 카운터 메뉴에서 초기화 를 선택한 다음 카운터를 선택합니다(예: 1 입력).</li>
		<li>각 식민지를 클릭하여 진행하십시오. 클릭할 때마다 그림에 표시되고 카운터가 업데이트됩니다(그림 3). 실수로 클릭한 것을 취소하려면 삭제를 선택합니다.</li>
		<li>카운터에 표시된 값을 등록합니다. 재설정 버튼을 클릭하여 카운트를 재설정하고 새 이미지를 열어 추가 샘플을 카운트합니다. 참고: 이 플러그인에 대한 자세한 지침은 https://imagej.net/plugins/cell-counter 에서 확인할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>자동 계수 방법<ol><li>피지에서 mCFU가 포함된 이미지를 엽니다. 이미지 > 유형 > 8비트를 선택합니다. 이렇게 하면 이미지가 8비트 회색조 이미지로 변환됩니다.</li>
		<li>도구 모음에서 Oval 도구를 선택하고 콜로니가 있는 영역 주위에 타원을 그립니다(그림 4A). 타원은 그린 후 조정할 수 있습니다.</li>
		<li>Edit(편집) > Clear Outside(외부 지우기)를 선택하여 외부 영역의 간섭을 제거합니다(그림 4B). [이미지]> [임계값 조정]> 선택합니다.</li>
		<li>콜로니가 빨간색으로 나타나고 배경 잡음이 최소화될 때까지 임계값 메뉴의 슬라이더를 움직입니다(그림 4C).</li>
		<li>적용을 선택하고 임계값 창을 종료합니다. 흑백 이미지가 생성됩니다(그림 4D).</li>
		<li>분석(Analyze) > 입자 분석(Analyze Particles)을 선택합니다. 입자 분석 창에서 콜로니 면적(1과 무한대 사이, 제곱 픽셀로 측정) 및 원형도(0과 1 사이, 여기서 1은 완전한 원)의 범위를 지정합니다. 그림 4E).</li>
		<li>표시 팝업 메뉴에서 윤곽선을 선택합니다. 결과 창에서 각 콜로니에 대한 자세한 측정값을 보려면 결과 표시(Display Results )를 확인하십시오. Clear Results(결과 지우기 )를 선택하여 이전 측정값을 지웁니다. 요약( Summarize ) 상자를 선택하여 요약된 측정 결과를 표시합니다(그림 4E).</li>
		<li>확인을 선택하여 분석기를 시작합니다. 새 창이 나타나고 감지되고 계수된 모든 윤곽선이 표시됩니다. 결과 창에는 각 콜로니에 대한 세부 정보가 표시되고, 요약된 결과 창에는 개수된 총 콜로니가 표시됩니다(그림 4F). 참고: 크기 및 원형도에 대한 설정은 이미지의 해상도와 배율, 콜로니의 크기 및 모양에 따라 달라집니다. 모든 콜로니를 감지하는 최상의 설정을 찾을 때까지 이 과정을 여러 번 반복합니다. 파티클 분석 플러그인에 대한 자세한 내용은 https://imagej.nih.gov/ij/docs/menus/analyze.html#ap 에서 확인할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65447/65447fig03.jpg"> 그림 3. Fiji 소프트웨어의 셀 카운터 플러그인을 사용하여 mCFU를 계산하는 수동 방법입니다. 파란색 점은 사용자가 이미 클릭한 콜로니를 나타냅니다. 오른쪽 메뉴에는 지금까지 계산된 식민지 수가 표시됩니다(개수는 41개). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65447/65447fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65447/65447fig04.jpg"> 그림 4. Fiji 소프트웨어를 사용하여 mCFU를 계산하는 자동화된 방법입니다. (ᄀ, ᄂ) 콜로니가 있는 관심 영역은 타원형 선택 도구를 사용하여 선택되고 외부 영역은 clear outside 명령을 사용하여 제거됩니다. (씨, 디) 콜로니의 흑백 이미지는 임계값 도구를 사용하여 생성됩니다. (E, F) 콜로니의 수는 입자 분석 도구를 사용하여 정량화됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65447/65447fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Micro-CFU 방법을 사용한 결핵 판정 가속화

<ol>
	<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Global Tuberculosis Report 2022. , (2022).</li><li>Bettencourt, P. J. G., Joosten, S. A., Lindestam Arlehamn, C. S., Behr, M. A., Locht, C., Neyrolles, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=100+years+of+the+Bacillus+Calmette-Guérin+vaccine.">100 years of the Bacillus Calmette-Guérin vaccine.</a> Vaccine. 39 (50), 7221-7222 (2021).</li><li>Bettencourt, P. J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+100th+anniversary+of+bacille+Calmette-Gu&#233;rin+(BCG)+and+the+latest+vaccines+against+COVID-19.">The 100th anniversary of bacille Calmette-Gu&#233;rin (BCG) and the latest vaccines against COVID-19.</a> The International Journal of Tuberculosis and Lung Disease. 25 (8), 611-613 (2021).</li><li>Scriba, T. J., Netea, M. G., Ginsberg, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Key+recent+advances+in+TB+vaccine+development+and+understanding+of+protective+immune+responses+against+Mycobacterium+tuberculosis.">Key recent advances in TB vaccine development and understanding of protective immune responses against Mycobacterium tuberculosis.</a> Seminars in Immunology. 50, 101431 (2020).</li><li>McShane, H., Williams, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+preclinical+animal+models+utilised+for+TB+vaccine+evaluation+in+the+context+of+recent+human+efficacy+data.">A review of preclinical animal models utilised for TB vaccine evaluation in the context of recent human efficacy data.</a> Tuberculosis. 94 (2), 105-110 (2014).</li><li>Voss, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+challenges+in+TB+vaccine+development.">Progress and challenges in TB vaccine development.</a> F1000Research. 7, 199 (2018).</li><li>Satti, I., McShane, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+approaches+toward+identifying+a+correlate+of+immune+protection+from+tuberculosis.">Current approaches toward identifying a correlate of immune protection from tuberculosis.</a> Expert Review of Vaccines. 18 (1), 43-59 (2019).</li><li>Young, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+tuberculosis.">Animal models of tuberculosis.</a> European Journal of Immunology. 39 (8), 2011-2014 (2009).</li><li>Pedroza-Rold&#225;n, C., Flores-Valdez, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+mouse+models+and+vaccine+candidates+for+preventing+chronic/latent+tuberculosis+infection+and+its+reactivation.">Recent mouse models and vaccine candidates for preventing chronic/latent tuberculosis infection and its reactivation.</a> Pathogens and disease. 75 (6), (2017).</li><li>Gong, W., Liang, Y., Wu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+Models+of+Tuberculosis+Vaccine+Research:+An+Important+Component+in+the+Fight+against+Tuberculosis.">Animal Models of Tuberculosis Vaccine Research: An Important Component in the Fight against Tuberculosis.</a> BioMed Research International. 2020, 1-21 (2020).</li><li>Bettencourt, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+antigens+presented+by+MHC+for+vaccines+against+tuberculosis.">Identification of antigens presented by MHC for vaccines against tuberculosis.</a> NPJ vaccines. 5 (1), 2 (2020).</li><li>Moorlag, S. J. C. F. M., Arts, R. J. W., van Crevel, R., Netea, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-specific+effects+of+BCG+vaccine+on+viral+infections.">Non-specific effects of BCG vaccine on viral infections.</a> Clinical Microbiology and Infection. 25 (12), 1473-1478 (2019).</li><li>Wilkie, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+in-vitro+evaluation+of+the+non-specific+effects+of+BCG+vaccination+in+a+randomised+controlled+clinical+study.">Functional in-vitro evaluation of the non-specific effects of BCG vaccination in a randomised controlled clinical study.</a> Scientific Reports. 12 (1), 7808 (2022).</li><li>Netea, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trained+immunity:+A+program+of+innate+immune+memory+in+health+and+disease.">Trained immunity: A program of innate immune memory in health and disease.</a> Science. 352 (6284), aaf1098 (2016).</li><li>Bettencourt, P., Pires, D., Carmo, N., Anes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+Confocal+Microscopy+for+Quantification+of+Intracellular+Mycobacteria+in+Macrophages.">Application of Confocal Microscopy for Quantification of Intracellular Mycobacteria in Macrophages.</a> Microscopy: Science, Technology, Applications and Education. 1, 614-621 (2010).</li><li>Bettencourt, P., Carmo, N., Pires, D., Tim&#243;teo, P., Anes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterial+infection+of+macrophages:+the+effect+of+the+multiplicity+of+infection.">Mycobacterial infection of macrophages: the effect of the multiplicity of infection.</a> Antimicrobial research: Novel bioknowledge and educational programs. , 651-664 (2017).</li><li>Pires, D., Bettencourt, P., Carmo, N., Niederweis, M., Anes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Mycobacterium+tuberculosis+outer-membrane+porins+in+bacterial+survival+within+macrophages.">Role of Mycobacterium tuberculosis outer-membrane porins in bacterial survival within macrophages.</a> Drug Discovery Today. 15 (23-24), 1112-1113 (2010).</li><li>Pires, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+tuberculosis+Modulates+miR-106b-5p+to+Control+Cathepsin+S+Expression+Resulting+in+Higher+Pathogen+Survival+and+Poor+T-Cell+Activation.">Mycobacterium tuberculosis Modulates miR-106b-5p to Control Cathepsin S Expression Resulting in Higher Pathogen Survival and Poor T-Cell Activation.</a> Frontiers in immunology. 8 (DEC), 1819 (2017).</li><li>Pires, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Cathepsins+in+Mycobacterium+tuberculosis+Survival+in+Human+Macrophages.">Role of Cathepsins in Mycobacterium tuberculosis Survival in Human Macrophages.</a> Scientific reports. 6 (August), 32247 (2016).</li><li>Bettencourt, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin-binding+protein+regulation+by+microRNAs+as+a+novel+microbial+strategy+to+modulate+phagocytosis+by+host+cells:+the+case+of+N-Wasp+and+miR-142-3p.">Actin-binding protein regulation by microRNAs as a novel microbial strategy to modulate phagocytosis by host cells: the case of N-Wasp and miR-142-3p.</a> Frontiers in cellular and infection microbiology. 3 (June), 19 (2013).</li><li>Bhuyan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microliter+spotting+and+micro-colony+observation:+A+rapid+and+simple+approach+for+counting+bacterial+colony+forming+units.">Microliter spotting and micro-colony observation: A rapid and simple approach for counting bacterial colony forming units.</a> Journal of Microbiological Methods. 207, 106707 (2023).</li><li>Jackson, S., McShane, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+Developing+a+Controlled+Human+Tuberculosis+Challenge+Model.">Challenges in Developing a Controlled Human Tuberculosis Challenge Model.</a> Current topics in microbiology and immunology. , 1-27 (2022).</li><li>Darrah, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+tuberculosis+in+macaques+after+intravenous+BCG+immunization.">Prevention of tuberculosis in macaques after intravenous BCG immunization.</a> Nature. 577 (7788), 95-102 (2020).</li><li>Madura Larsen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BCG+stimulated+dendritic+cells+induce+an+interleukin-10+producing+T-cell+population+with+no+T++helper+1+or+T+helper+2+bias+in+vitro.">BCG stimulated dendritic cells induce an interleukin-10 producing T-cell population with no T helper 1 or T helper 2 bias in vitro.</a> Immunology. 121 (2), 276-282 (2007).</li><li>Bickett, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+BCG-Induced+Macrophage+and+Neutrophil+Mechanisms+for+Defense+Against+Mycobacterium+tuberculosis.">Characterizing the BCG-Induced Macrophage and Neutrophil Mechanisms for Defense Against Mycobacterium tuberculosis.</a> Frontiers in immunology. 11, 1202 (2020).</li><li>Pires, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interference+of+Mycobacterium+tuberculosis+with+the+endocytic+pathways+on+macrophages+and+dendritic+cells+from+healthy+donors:+role+of+cathepsins.">Interference of Mycobacterium tuberculosis with the endocytic pathways on macrophages and dendritic cells from healthy donors: role of cathepsins.</a> Drug Discovery Today. 15 (23-24), 1112-1112 (2010).</li><li>Betts, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimising+Immunogenicity+with+Viral+Vectors:+Mixing+MVA+and+HAdV-5+Expressing+the+Mycobacterial+Antigen+Ag85A+in+a+Single+Injection.">Optimising Immunogenicity with Viral Vectors: Mixing MVA and HAdV-5 Expressing the Mycobacterial Antigen Ag85A in a Single Injection.</a> PLoS ONE. 7 (12), e50447 (2012).</li><li>Tanner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+haemoglobin+and+iron+on+in+vitro+mycobacterial+growth+inhibition+assays.">The influence of haemoglobin and iron on in vitro mycobacterial growth inhibition assays.</a> Scientific reports. 7 (1), 43478 (2017).</li><li>McNeill, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+mycobacterial+infection+by+macrophage+Gch1+and+tetrahydrobiopterin.">Regulation of mycobacterial infection by macrophage Gch1 and tetrahydrobiopterin.</a> Nature communications. 9 (1), 5409 (2018).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Pereira, M., Vale, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saquinavir:+From+HIV+to+COVID-19+and+Cancer+Treatment.">Saquinavir: From HIV to COVID-19 and Cancer Treatment.</a> Biomolecules. 12 (7), 944 (2022).</li><li>Pires, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repurposing+Saquinavir+for+Host-Directed+Therapy+to+Control+Mycobacterium+Tuberculosis+Infection.">Repurposing Saquinavir for Host-Directed Therapy to Control Mycobacterium Tuberculosis Infection.</a> Frontiers in immunology. 12, 647728 (2021).</li><li>Pires, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomal+Delivery+of+Saquinavir+to+Macrophages+Overcomes+Cathepsin+Blockade+by+Mycobacterium+tuberculosis+and+Helps+Control+the+Phagosomal+Replicative+Niches.">Liposomal Delivery of Saquinavir to Macrophages Overcomes Cathepsin Blockade by Mycobacterium tuberculosis and Helps Control the Phagosomal Replicative Niches.</a> International journal of molecular sciences. 24 (2), (2023).</li><li>Maartens, G., Wilkinson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuberculosis.">Tuberculosis.</a> The Lancet. 370 (9604), 2030-2043 (2007).</li><li>Matarazzo, L., Bettencourt, P. J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+vaccines:+a+new+opportunity+for+malaria,+tuberculosis+and+HIV.">mRNA vaccines: a new opportunity for malaria, tuberculosis and HIV.</a> Frontiers in Immunology. 14, 1172691 (2023).</li><li>Young, D., Dye, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Development+and+Impact+of+Tuberculosis+Vaccines.">The Development and Impact of Tuberculosis Vaccines.</a> Cell. 124 (4), 683-687 (2006).</li><li>Kommareddi, S., Abramowsky, C. R., Swinehart, G. L., Hrabak, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nontuberculous+mycobacterial+infections:+Comparison+of+the+fluorescent+auramine-o+and+Ziehl-Neelsen+techniques+in+tissue+diagnosis.">Nontuberculous mycobacterial infections: Comparison of the fluorescent auramine-o and Ziehl-Neelsen techniques in tissue diagnosis.</a> Human Pathology. 15 (11), 1085-1089 (1984).</li><li>Sabiiti, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Tuberculosis+Molecular+Bacterial+Load+Assay+(TB-MBLA).">A Tuberculosis Molecular Bacterial Load Assay (TB-MBLA).</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (158), e60460 (2020).</li><li>Somosko&#776;vi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Recoveries+of+Mycobacterium+tuberculosis+Using+the+Automated+BACTEC+MGIT+960+System,+the+BACTEC+460+TB+System,+and+Lo&#776;wenstein-Jensen+Medium.">Comparison of Recoveries of Mycobacterium tuberculosis Using the Automated BACTEC MGIT 960 System, the BACTEC 460 TB System, and Lo&#776;wenstein-Jensen Medium.</a> Journal of Clinical Microbiology. 38 (6), 2395-2397 (2000).</li><li>Tanner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vitro+direct+mycobacterial+growth+inhibition+assay+(MGIA)+for+the+early+evaluation+of+TB+vaccine+candidates+and+assessment+of+protective+immunity:+a+protocol+for+non-human+primate+cells.">The in vitro direct mycobacterial growth inhibition assay (MGIA) for the early evaluation of TB vaccine candidates and assessment of protective immunity: a protocol for non-human primate cells.</a> F1000Research. 10, 257 (2021).</li></ol>

DP와 PJGB는 이 연구가 잠재적인 이해 상충으로 해석될 수 있는 상업적 또는 재정적 관계가 없는 상태에서 수행되었음을 선언합니다.

결핵은 특히 저소득 및 중간 소득 국가에서 그 중요성이 커지고 있는 중요한 공중 보건 문제입니다. COVID-19 팬데믹 기간 동안 결핵을 진단하고 치료하기 위한 의료 환경의 붕괴는 신규 사례 발생률에 부정적인 영향을 미쳤습니다1. 또한, 이 전염병을 통제하기 위해서는 다제내성 및 광범위한 약물 내성 M.tb 균주, M.tb와 HIV의 동시 감염이 시급히 해결되어야 한다<sup cla...

결핵(TB)은 단일 감염원인인 결 핵균(M.tb)에 의한 전 세계 주요 사망 원인으로, 다른 어떤 병원체보다 더 많은 사람을 사망에 이르게 합니다. 2021년 결핵은 160만 명의 사망자를 발생시켰으며, 2019-2021년 팬데믹 기간 동안 코로나19를 능가했습니다1. 또한 세계보건기구(WHO)의 2022년 전 세계 결핵 보고서에 따르면 코로나19 팬데믹으로 인해 새로운 결핵 사례가 증가했습니다. 세계보건기구(WHO)는 또한 이 기간 동안 결핵 진단을 받은 사람의 수가 크게 감소했다고 보고하고 있으며, 이로 인해 결핵 발병 건수는 더 증가할 수 있다1.
BCG(Bacillus Calmette-Guérin)는 100여 년 전에 백신으로 처음 사용된 병원성 Mycobacterium bovis의 약독화 생균주입니다. 이 백신은 결핵에 대한 유일한 백신이며 세계에서 가장 오래된 허가된 백신으로 여전히 사용되고 있습니다 2,3. 현재 12개의 백신이 서로 다른 임상시험 단계에 있으며4 수십 개의 백신이 전임상 개발 중에 있습니다5,6. 결핵 백신의 전임상 평가에는 안전성 및 면역원성7 평가가 포함되며, 이는 제브라피시, 마우스, 기니피그, 토끼, 소, 비인간 영장류와 같은 다양한 동물 모델에서 얻을 수 있다 8,9,10. 또한, M.tb 감염 및/또는 전염에 대한 보호를 유도하는 백신의 능력, 즉 백신 효능을 평가하기 위해서는 in vivo 5,11에서 M.tb 이의 제기가 필요합니다. 흥미롭게도, BCG 백신 접종은 훈련된 면역 14의 메커니즘을 통해 다른 박테리아 및 바이러스 병원체의 생존에 영향을 미치는 비특이적 효과를 유도한다12,13. 감염된 동물에서 생존 가능한 박테리아 부담을 정량화하기 위해 선택하는 방법은 콜로니 형성 단위(CFU) 분석 5,15를 통해 박테리아 콜로니를 계수하는 것입니다. CFU는 특정 성장 조건에서 군체를 형성하는 미생물(박테리아 또는 곰팡이)의 수를 추정하는 단위입니다. CFU는 생존 가능한 미생물과 복제 가능한 미생물에서 유래하며, 각 군집 내에서 살아있는 미생물의 절대적인 수를 추정하기는 어렵습니다. 군체가 하나 이상의 미생물에서 유래했는지 여부는 불확실합니다. CFU 단위는 이러한 불확실성을 반영하므로 동일한 샘플의 반복실험에서 큰 변동성을 관찰할 수 있습니다. 시간이 많이 소요되는 이 분석에는 생물안전 레벨 3(BSL3) 시설, 상당한 실험실 및 인큐베이터 공간에서 작업하도록 훈련된 전문 기술자가 필요하며, 결론을 내리는 데 4주에서 6주가 소요되며 오염되기 쉽습니다.
이 연구에서는 콜로니 계수에 최적화된 방법인 micro-CFU(mCFU)를 설명하고 결과 15,16,17,18,19,20을 분석하기 위한 간단하고 빠른 솔루션을 제공합니다. mCFU 분석은 10배 적은 시약이 필요하고, 배양 기간을 3배 단축하며, 결론을 내리는 데 1-2주가 소요되며, 실험실 공간 및 시약 비용을 줄이고, 많은 수의 M.tb 작업과 관련된 건강 및 안전 위험을 최소화합니다. 우리는 이 방법이 백신 효능 결정에 대한 전임상 연구에 보편적으로 채택되어야 하며, 궁극적으로 결핵 백신 개발 시간을 단축할 것을 제안합니다. 마지막으로, 이 최적화된 CFU 계수 방법은 마이코박테리아뿐만 아니라 대장균(Escherichia coli) 및 랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonia solanacearum21)과 같은 다른 박테리아도 정량화하는 데 사용되었습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-2781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSLR 15-55 mm lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>AF-P DX NIKKOR 18-55mm f/3.5-5.6G VR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSLR camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>D3400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSLR macro lens</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>MACRO 105mm F2.8 EX DG OS HSM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji Software</td>
			<td></td>
			<td>https://fiji.sc/</td>
			<td>Fiji is an open-source software supported by several laboratories, institutions, and individuals. All the required plugins are included.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal CA-630</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>18896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H10</td>
			<td>BD</td>
			<td>262710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H9</td>
			<td>BD</td>
			<td>271310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel pipette (0.5 - 10 &#181;l)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel pipette (20 - 200 &#181;l)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycobacterium bovis BCG&#160;</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>ATCC35734</td>
			<td>strain TMC 1011 [BCG Pasteur]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OADC enrichment</td>
			<td>BD</td>
			<td>211886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>NZYTech</td>
			<td>MB25201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21875091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer UV-6300PC</td>
			<td>VWR</td>
			<td>634-6041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square Petri dish 120 x 120 mm</td>
			<td>Corning</td>
			<td>BP124-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyloxapol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasound bath Elma P 30 H</td>
			<td>VWR</td>
			<td>142-0051</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

micro-colony forming unit assay for efficacy evaluation of vaccines against tuberculosis

전 세계적으로 감염원에 의한 주요 사망 원인인 결핵(TB)은 2022년에 160만 명의 목숨을 앗아갔으며, 2019-2021년 팬데믹 기간 동안 COVID-19를 능가했습니다. 이 질병은 결핵균(Mycobacterium tuberculosis , M.tb)에 의해 발생합니다. 유일한 결핵 백신인 Mycobacterium bovis 균주 Bacillus Calmette-Guérin(BCG)은 세계에서 가장 오래된 허가 백신으로 여전히 사용되고 있습니다. 현재 12개의 백신이 임상시험 중이며 수십 개의 백신이 전임상 개발 중입니다. 전임상 연구에서 결핵 백신의 효능을 평가하기 위해 사용되는 방법은 콜로니 형성 단위(CFU) 분석에 의한 박테리아 콜로니의 계수입니다. 이 시간 소모적인 분석은 결론을 내리는 데 4-6주가 걸리고, 상당한 실험실 및 인큐베이터 공간이 필요하며, 시약 비용이 높고, 오염되기 쉽습니다. 여기서는 M.tb 백신 효능 결과를 분석하기 위한 간단하고 빠른 솔루션을 제공하는 콜로니 계수에 최적화된 방법인 micro-CFU(mCFU)에 대해 설명합니다. mCFU 분석은 10배 적은 시약이 필요하고, 배양 기간을 3배 단축하며, 결론을 내리는 데 1-2주가 소요되며, 실험실 공간 및 시약 비용을 줄이고, 많은 수의 M.tb 작업과 관련된 건강 및 안전 위험을 최소화합니다. 또한, 결핵 백신의 효능을 평가하기 위해 마이코박테리아에 감염된 백신을 접종한 동물의 조직을 포함하여 다양한 출처에서 샘플을 얻을 수 있습니다. 또한 감염 연구를 위해 단세포, 균일 및 고품질 마이코박테리아 배양을 생산하는 최적화된 방법을 설명합니다. 마지막으로, 우리는 이러한 방법이 백신 효능 결정에 대한 전임상 연구에 보편적으로 채택되어 궁극적으로 결핵 백신 개발 시간을 단축해야 한다고 제안합니다.

Tuberculosis (TB) is the leading cause of death worldwide by a single infectious agent, bacterium Mycobacterium tuberculosis (M.tb), killing more people than any other pathogen. In 2021, TB was responsible for 1.6 million deaths and was surpassed by COVID-19 during the 2019-2021 pandemic1. Moreover, according to the World Health Organization&#180;s global TB report of 2022, the COVID-19 pandemic was responsible for an increase in new TB cases. The WHO also reports large drops in the number of people diagnosed with TB during this period, which could increase further the number of TB cases1.
The Bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG) is a live-attenuated strain of the pathogenic Mycobacterium bovis, used for the first time as a vaccine more than 100 years ago. This is the only vaccine against TB and is the oldest licensed vaccine in the world still in use2,3. Currently, there are 12 vaccines in different phases of clinical trials4, and dozens of vaccines are under pre-clinical development5,6. Pre-clinical assessment of vaccines against TB includes the evaluation of the safety and immunogenicity7, which can be obtained in diverse animal models such as zebrafish, mice, guinea pigs, rabbits, cattle, and non-human primates8,9,10. Additionally, assessing the capacity of a vaccine to induce protection against M.tb infection and/or transmission, i.e., the vaccine efficacy, requires an M.tb challenge in vivo5,11. Interestingly, BCG vaccination induces non-specific effects that affect the survival of other bacterial and viral pathogens12,13&#160;through the mechanism of trained immunity14. To quantify the viable bacterial burden in an infected animal, the method of choice is the enumeration of bacterial colonies through the colony-forming units (CFU) assay5,15. CFU is a unit that estimates the number of microorganisms (bacteria or fungi) that form colonies under specific growth conditions. CFUs originate from viable and replicative microorganisms, and the absolute number of living microorganisms within each colony is difficult to estimate. It is uncertain whether a colony has originated from one or more microorganisms. The CFU unit reflects this uncertainty, hence a great variability can be observed in replicates of the same sample. This time-consuming assay requires specialized technicians trained to work in a biosafety level 3 (BSL3) facility, substantial laboratory and incubator space, takes from 4 to 6 weeks to conclude, and is prone to contamination.
In this study, we describe an optimized method for colony enumeration, the micro-CFU (mCFU), and offer a simple and rapid solution to analyze the results15,16,17,18,19,20. The mCFU assay requires tenfold fewer reagents, reduces the incubation period threefold, taking 1 to 2 weeks to conclude, reduces lab space and reagent cost, and minimizes the health and safety risks associated with working with large numbers of M.tb. We propose that this method should be universally adopted for pre-clinical studies of vaccine efficacy determination, ultimately leading to time reduction in the development of vaccines against TB. Finally, this optimized method of CFU enumeration has been used to quantify not only Mycobacteria but also other bacteria, such as Escherichia coli and Ralstonia solanacearum21.

저자 스포트라이트: 결핵 백신 효능 및 항원 제시 분석의 효율적인 평가를 위한 CFU 결정 최적화 

결핵에 대한 백신의 효능 평가를 위한 Micro-colony Forming Unit Assay

CFU determination is necessary to measure the efficacy of the immune response against bacteria. However, it is very low throughput and becomes cumbersome and expensive when applied to pathogenic bacteria such as Mycobacterium tuberculosis. This is a significant limitation when we need to test large panels of treatments.The research focuses on tuberculosis and on the assessments of TB vaccines. It explores safety, immunogenicity, and efficacy of vaccines against Mycobacterium tuberculosis. The study presents an optimized method to micro-CFU for enumerating bacterial colonies to assess vaccine efficacy in preclinical studies.This protocol aims to optimize CFU determination by generating results from a small droplet similar to those from a regular Petri dish. Quantifying bacteria viability from such a small sample allows us to analyze thousands of data points using a fraction of the materials and time necessary for the classical method. Our research aims to dissect the antigen presentation machinery and to identify the most relevant antigens to optimize antigen presentation.This will inform us to design and develop better vaccines to improve or replace the current TB vaccine, which is BCG.

여기에 설명된 mCFU 분석은 단일 페트리 접시에서 검색할 수 있는 정보의 양을 최소 96배로 증가시킵니다. 그림 5는 결핵 치료를 위한 숙주 지향 약물로서 사퀴나비르(SQV)31,32의 용도 변경에 대한 두 가지 약물 전달 방법의 비교를 보여줍니다. 이 분석에서는 Mycobacterium tuberculosis의 4가지 다른 균주를 사용하여 1차 인간 대식세?...

Watch this Scientific Journal Video about Optimizing CFU Determination for Efficient Assessment of TB Vaccine Efficacy and Antigen Presentation Analysis at JoVE.com

콜로니 형성 단위(CFU)의 측정은 눈에 보이는 콜로니를 형성하는 데 몇 주가 걸릴 수 있는 Mycobacterium tuberculosis를 포함하여 박테리아를 정량화하기 위한 황금 표준 기술입니다. 여기서는 시간 효율성 향상, 실험실 공간 및 시약 비용 절감, 중간 및 고처리량 실험으로의 확장성을 갖춘 CFU 측정을 위한 마이크로 CFU에 대해 설명합니다.

Tuberculosis (TB), the leading cause of death worldwide by an infectious agent, killed 1.6 million people in 2022, only being surpassed by COVID-19 during ...

CFU 측정은 박테리아에 대한 면역 반응의 효능을 측정하는 데 필요합니다. 그러나 처리량이 매우 낮고 Mycobacterium tuberculosis와 같은 병원성 박테리아에 적용할 때 번거롭고 비용이 많이 듭니다. 이는 대규모 처리 패널을 테스트해야 할 때 중요한 제한 사항입니다.이 연구는 결핵과 결핵 백신의 평가에 초점을 맞추고 있습니다. 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)에 대한 백신의 안전성, 면역원성 및 효능을 탐구합니다. 이 연구는 전임상 연구에서 백신 효능을 평가하기 위해 박테리아 콜로니를 열거하기 위해 micro-CFU에 최적화된 방법을 제시합니다.이 프로토콜은 일반 페트리 접시와 유사한 작은 방울에서 결과를 생성하여 CFU 측정을 최적화하는 것을 목표로 합니다. 이러한 작은 샘플에서 박테리아 생존율을 정량화하면 기존 방법에 필요한 재료와 시간의 일부를 사용하여 수천 개의 데이터 포인트를 분석할 수 있습니다. 우리의 연구는 항원 제시 메커니즘을 해부하고 항원 제시를 최적화하기 위해 가장 관련성이 높은 항원을 식별하는 것을 목표로 합니다.이를 통해 현재 결핵 백신인 BCG를 개선하거나 대체할 수 있는 더 나은 백신을 설계하고 개발해야 합니다.

micro-colony-forming-unit-assay-for-efficacy-evaluation-vaccines

Research

JoVE Journal

Medicine

Micro-Colony Forming Unit Assay for Efficacy Evaluation of Vaccines Against Tuberculosis

1.4K 조회수.  Universidade Católica Portuguesa. CFU 측정은 박테리아에 대한 면역 반응의 효능을 측정하는 데 필요합니다. 그러나 처리량이 매우 낮고 Mycobacterium tuberculosis와 같은 병원성 박테리아에 적용할 때 번거롭고 비용이 많이 듭니다. 이는 대규모 처리 패널을 테스트해야 할 때 중요한 제한 사항입니다.이 연구는 결핵과 결핵 백신의 평가에 초점을 맞추고 있습니다. 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)에 대한 백신의 안...