Yazarlar nazik onların yardım ve teknik uzmanlık için Susanna GRAFE ve Arno Wiehe özel sayesinde, lipozomal mTHPC formülasyonu ile bize sağlamak için biolitec Araştırma GmbH ile (Jena, Almanya) teşekkür etmek istiyorum. Biz de sonuçları büyük bir bölümünü oluşturulan ve yayımı 11 coresponsible oldu Kerstin Reidy, teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Schweizerischer Verein Balgrist, Zürih Üniversitesi, Krebsliga Zürih yanı sıra Walter L. ve Johanna Kurt Vakfı, Zürih, İsviçre hibe ve EuroNanoMed ERA-NET / SNF İsviçreli bir hibe ile hibe tarafından desteklenmiştir Ulusal Bilim Vakfı 31NM30-131004/1. Bu çalışma aynı zamanda HSM Kanton Zürih Muskuloskeletal Onkoloji (Yüksek İhtisas Tıp) programı tarafından desteklenmiştir.

1.. Bulunduğu Low mTHPC arasında Alımı ve Yüksek Metastatik HOS ve 143B OS Hücre Hatlarının Karşılaştırılması <ol><li> DMEM, Ham F12 ve bir oranı 4.5:4.5:1 içinde ısı ile inaktive edilmiş fetal dana serumu ihtiva eden hücre kültür ortamı hazırlayın. Not: PS mTHPC bir lipozom formülasyonu, 1.5 mg / ml mTHPC bir son konsantrasyonda su içinde çözülür. </li><li> Levha 0.2 x 10 6 HOS ve 143B hücre / oyuk, 6 oyuklu tabaklar (her bir durum için kopyaların) ve hücreler gece boyunca uygun sağlar. Not: sayısını tek tek hücre çizgileri için ayarlanmalıdır. % 80-90 arasında bir confluency Deney zamanında en çok uygundur. </li><li> Ertesi gün farklı zaman dilimlerinde (zamana bağlı alımı) için mTHPC sabit bir konsantrasyonu ile inkübe hücreleri, ya da sabit bir süre (doza bağlı bir uptake) boyunca mTHPC artan yoğunluklarda. </li><li> Belirli bir zaman p mTHPC ile hücreleri inkübeoints veya mTHPC konsantrasyonları. Not: Bu çalışmada, HOS 143B ve hücre çizgileri, her ikisi için de 0.6 ug / ml ile inkübe edildi mTHPC 0, 2.5, 5, veya 10 saat, ya da 5 saat boyunca 0, 0.6, 2.5 ve 10 ug / ml ile mTHPC. Uygulanan zaman aralıkları ve dozajlar, kullanılan bir hücre hattı ile ilgili olarak değişebilir. </li><li> Her zaman hücreleri direkt ışık maruz kalmasını önlemek için karanlık veya karartılmış ışık koşullarında çalışmak unutmayın. </li><li> Belirtilen koşullarda hücrelerin inkübasyonundan sonra, ortam aspire ve hücreler PBS ile üç kez yıkayın. Daha sonra, 0.5 ml tripsin / EDTA ile hücreleri ayırmak ve hücreleri sayın. </li><li> Ayrıldıktan sonra, 5 dakika boyunca 400 x g&#39;de santrifüj hücreleri orta aspire ve 200,000 hücre / ml &#39;lik bir son yoğunluğa kadar PBS içinde tekrar süspansiyon hücreleri. </li><li> Elde edilen hücre süspansiyonu pipetle 100 ul, 96 oyuklu bir plaka içerisinde ve bir floresan spektrofotometrede bu hücrelerin floresan ölçer (örneğin 20.000 hücre). AyarımTHPC floresans ölçümleri için ler vardır: emisyon için 652 nm eksitasyon ve 417 nm. </li><li> , Hücre başına içsel mTHPC miktarının hesaplanması aşağıdaki gibi hücre sayısı ve hücre hacmine nispi floresan ünitesi (RFU) normalleştirmek amacıyla: </li><li> 0-4 ug / ml (araç kullanımı üç kopyalı ölçüm) ikinci PBS mTHPC farklı konsantrasyonları kullanılarak standart bir eğri hazırlanır. 96 oyuklu bir plaka içerisinde her seyreltme oranından 100 ul pipet ve aşama 1.6 altında tarif ayarları kullanarak kuyuların floresan ölçer. </li><li> Kuyuda (ug / ml) mTHPC konsantrasyonunu vermektedir mTHPC, doğrusal standart eğrinin eğimi ile (20,000 hücreler için elde edilmiş) RFU bölün. </li><li> (Hücre süspansiyonu 100 ul temsil ug) bir kuyuda mTHPC toplam miktarını almak ve 20,000 hücre hacmi ile bu değeri 10 bölmek için bu mTHPC konsantrasyonu bölün. </li><li> X (4/3 x π): Bir kürenin için formülü ile hacmini hesaplayınR3. Mikroskop altında 20 tripsinize edilmiş hücre çapını ölçmek ve bu değeri 2 ile bölünmesiyle elde edilir yarıçapı r. </li><li> Son olarak, 10 saat (doza bağlı alımı) saat ya da% 100&#39;e ayarlanmış olan 10 ug / ml mTHPC (zamana bağlı alımı) ile işlem gördükten sonra HOS hücreleri için elde edilenlere tüm değerleri normalize. </li></ol> 2. PS in vitro Fototoksisite Ölçümü <ol><li> 96 oyuklu bir plaka (mTHPC her bir konsantrasyonu için kopyaların kullanılır) içerisinde 3,000 hücre / oyuk tohum ve gece boyu bağlı sağlar. Benzer şekilde ek bir 96 oyuklu plaka hazırlanması ve aşağıda tarif edildiği gibi hücre tedavisi, ancak daha sonra faz kontrastlı görüntüleme için bir kenara koydu. Not: sayı her bir hücre hattı için ayarlanmalıdır. Deneyin zamanında% 50-60 arasında bir confluency idealdir. <ol><li> MTHPC konsantrasyonlarının her biri için hücrelerin gelen karanlık toksisite denetimi eklemek için unutmayın.se mTHPC seçilmiş konsantrasyonlarının varlığında veya yokluğunda inkübe edilecek hücreler, ancak aydınlatılmış olmayacaktır. </li></ol></li><li> Ertesi gün, hücre çizgileri ile ilgili olarak mTHPC (0, 0.0001, 0.001, 0.01, 0.03, 0.075, 0.15, 0.3, 0.6, 1.25, 2.5, 5 ve 10 ug / ml) farklı konsantrasyonları ile inkübe edilir ve hücreleri 5 saat boyunca karanlıkta tutun. <ol><li> Bölüm 1.3.2 başvurun Not: Kuluçka süresi aydınlatma hücre hattı ve kullanılan PS bağlıdır önce, bu nedenle, ayrı deneylerde, farklı konsantrasyonlarda ve farklı zaman noktaları test için tavsiye edilir. </li></ol></li><li> Belirtilen süre için inkübe edildikten sonra, PBS ile iki kez yıkama ve hücreler mTHPC olmadan yeni taze ortam ekleyin. </li><li> MTHPC absorpsiyon spektrumu için özel bir 652 nm diyot lazer, (bkz. Şekil 1) ile hücrelerin aydınlatın. <ol><li> 13.5 cm dista bir yükseklikte, 21.88 mW / cm 2 gücüne lazer ayarlama5 J / cm 2 lik bir enerji dozu elde etmek amacıyla, hücrelerden ım. 230 saniye boyunca hücreleri aydınlatın. (Ve mTHPC olmadan) karanlık toksisite kontrol hücrelerini aydınlatmak etmeyin. Not: Her zaman PS uyarma için kullanılan lazer ışıktan gözleri korumak için gözlük. </li></ol></li><li> Aydınlatma sonra, 24 saat boyunca 37 ° C&#39;de karanlıkta hücreleri tutun. Daha sonra, suda çözülebilen tetrazolium (WST-1) reaktif (orta μl/100 10 ul) ekleyin. </li><li> Üç saat WST-1 reaktifi ilave edildikten sonra, 415 nm&#39;de, 96 oyuklu plakanın her bir gözeneğine absorbansı ölçülür. </li><li> Hayatta kalan hücrelerin yüzdesini hesaplamak için, (örneğin mTHPC olmadan mTHPC ve nonilluminated olmadan aydınlatılmış)% 100 her bir durum için non mTHPC tedavi edilen hücreler için elde edilen değerlerin ortalaması olarak ayarlayın. </li></ol> 3. Hücre Sayım tarafından Hücre sayısı Tahmini <ol><li> Tohum 20,000 hücre / biz, 24 oyuklu bir plaka içerisinde ll ve onları bir gece boyunca bağlı sağlar. </li><li> MTHPC ile 5 saat (0.001, 0.003, 0.15, 0.6 ve 1.25 ug / ml) için hücreler inkübe edin ve yukarıda tarif edildiği gibi, onları aydınlatır. </li><li> Orta toplayın, 5 dakika boyunca 400 x g&#39;de santrifüj ile, bir kez PBS ile yıkayın hücreleri bunları trypsinize ve bunları toplamak. </li><li> Santrifüj işleminden sonra, ortam aspire taze ortam ve 200 ul içinde tekrar süspansiyon hücreleri. </li><li> Bir Neubauer odası içinde hücreleri sayın. </li></ol>

<ol>
	<li>Juarranz, A., Jaen, P., Sanz-Rodriguez, F., Cuevas, J., Gonzalez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy+of+cancer.+Basic+principles+and+applications.">Photodynamic therapy of cancer. Basic principles and applications.</a> Clin. Transl. Oncol. 10, 148-154 (2008).</li><li>Agostinis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy+of+cancer:+an+update.">Photodynamic therapy of cancer: an update.</a> CA Cancer. 61, 250-281 (2011).</li><li>D'Adamo, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appraising+the+current+role+of+chemotherapy+for+the+treatment+of+sarcoma.">Appraising the current role of chemotherapy for the treatment of sarcoma.</a> Semin. Oncol. 38 Suppl 3, 19-29 (2011).</li><li>Allison, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+meta-analysis+of+osteosarcoma+outcomes+in+the+modern+medical+era.">A meta-analysis of osteosarcoma outcomes in the modern medical era.</a> Sarcoma. , (2012).</li><li>Anninga, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotherapeutic+adjuvant+treatment+for+osteosarcoma:+where+do+we+stand.">Chemotherapeutic adjuvant treatment for osteosarcoma: where do we stand.</a> Eur. J. Cancer. 47, 2431-2445 (2011).</li><li>Bacci, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+of+relapse+in+patients+with+osteosarcoma+of+the+extremities+treated+with+neoadjuvant+chemotherapy.">Pattern of relapse in patients with osteosarcoma of the extremities treated with neoadjuvant chemotherapy.</a> Eur. J. Cancer. 37, 32-38 (2001).</li><li>Briccoli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resection+of+recurrent+pulmonary+metastases+in+patients+with+osteosarcoma.">Resection of recurrent pulmonary metastases in patients with osteosarcoma.</a> Cancer. 104, 1721-1725 (2005).</li><li>Milla Sanabria, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+and+indirect+photodynamic+therapy+effects+on+the+cellular+and+molecular+components+of+the+tumor+microenvironment.">Direct and indirect photodynamic therapy effects on the cellular and molecular components of the tumor microenvironment.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1835, 36-45 (2013).</li><li>Mitra, S., Foster, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photophysical+parameters,+photosensitizer+retention+and+tissue+optical+properties+completely+account+for+the+higher+photodynamic+efficacy+of+meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin+vs+Photofrin.">Photophysical parameters, photosensitizer retention and tissue optical properties completely account for the higher photodynamic efficacy of meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin vs Photofrin.</a> Photochem. Photobiol. 81, 849-859 (2005).</li><li>Ma, L., Moan, J., Berg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+new+photosensitizer,+meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin,+for+use+in+photodynamic+therapy:+a+comparison+of+its+photobiological+properties+with+those+of+two+other+photosensitizers.">Evaluation of a new photosensitizer, meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin, for use in photodynamic therapy: a comparison of its photobiological properties with those of two other photosensitizers.</a> Int. J. Cancer. 57, 883-888 (1994).</li><li>Reidy, K., Campanile, C., Muff, R., Born, W., Fuchs, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTHPC-mediated+photodynamic+therapy+is+effective+in+the+metastatic+human+143B+osteosarcoma+cells.">mTHPC-mediated photodynamic therapy is effective in the metastatic human 143B osteosarcoma cells.</a> Photochem. Photobiol. 88, 721-727 (2012).</li><li>Triesscheijn, M., Ruevekamp, M., Aalders, M., Baas, P., Stewart, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+sensitivity+of+microvascular+endothelial+cells,+fibroblasts+and+tumor+cells+after+in+vitro+photodynamic+therapy+with+meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin.">Comparative sensitivity of microvascular endothelial cells, fibroblasts and tumor cells after in vitro photodynamic therapy with meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin.</a> Photochem. Photobiol. 80, 236-241 (2004).</li><li>Triesscheijn, M., Baas, P., Schellens, J. H., Stewart, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy+in+oncology.">Photodynamic therapy in oncology.</a> Oncologist. 11, 1034-1044 (2006).</li><li>Burch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+canine+osseous+tumors+with+photodynamic+therapy:+a+pilot+study.">Treatment of canine osseous tumors with photodynamic therapy: a pilot study.</a> Clin. Orthop. Relat. Res. 467, 1028-1034 (2009).</li></ol>

Yazarlar herhangi bir mali çıkarlarını veya çıkar çatışması beyan ederim.

PDT cevap olarak uygun bir sitotoksisite elde etmek için, doğru lazer ışığı ayarları ve inkübasyon sürelerini seçmek çok önemlidir. Burada açıklanan işlemler PS alımını belirlemek için in vitro ve in PDT kaynaklı sitotoksisite ölçmek için tutarlı ve etkili. PS mTHPC spesifik soğurma dalga boylarını kullanarak, hücresel alımı PS doğrudan bir şekilde tespit edilebilir ve PS sitotoksik reaktif oksijen türleri oluşturmak için etkinleştirilebilir. <p class="jove_cont...

Osteosarkom (OS) sanat tedavi Bugünkü devlet, bir primer kemik tümörü, neo adjuvan kemoterapi ve cerrahi bir kombinasyonunu kapsar. Bu tedavi rejimi, kemoterapi kullanımından önce, yaklaşık% 20 ila lokalize hastalığı olan hastaların hayatta kalma oranı artışı, şu anda 4,% 3, 60-70 arasındadır. Ancak, son iki yılda, yerel hastalığı olan OS hastaların genel sağkalım, 5 4 durmuş durumda. Ayrıca, bu hastaların% 30-40 tan sonra 3 yıl içinde nüks ve metastatik hastalığı olan hastalarda% 20-30 4 kötü bir hayatta, 6, 7, yaşamaya devam. Bu hastaların sonuçlarını iyileştirmek için, yeni tedavi stratejileri geliştirilmesi gerekmektedir. Fotodinamik terapi (PDT), bir çok yeni anti-kanser terapisi, bir photosensi uyarılması için belirli bir dalga boyunda ışık kullanırkan akışı içine enjeksiyonundan sonra tümör hücrelerinde biriken tizer (PS). PS&#39;nin Lazer ışığı uyarım tümör hücreleri ve hücre ölümü ile sitotoksik reaksiyonu meydana oksijen mevcudiyetinde oksijen radikalleri oluşturur. PDT tümör enfarktüs yol açan, vazokonstriksiyon ve tümör mikro-damar trombus oluşumuna neden olan ve, dolayısıyla tümör içinde yerel hipoksi ve anoksi Bu birincil mekanizma yanı sıra, iki ek PDT biyolojik işlemler, daha az tümör büyümesine katkıda uyandırdı. Son olarak, PDT yaralı ve ölen tümör hücrelerinin lokal bir bağışıklık tepkisinin, PDT&#39;nin oldukça benzersiz bir özelliği tetikler. Bu, tamamlayıcı sistemi ve dendritik hücreleri antijen sunan 8 aktivasyonunu içerir. Bu durumda, şartlar tümör spesifik bağışıklık yol açan, lenfoid hücrelerin sonraki aktivasyonu tümör antijenlerin sunumu için oluşturulur. Şimdiye kadar, PDT, yumuşak doku tümörleri ve hyperpl çeşitli tedavi etmek için kullanılmaktadırasya adlı, örneğin aktinik keratoz, Barrett özofagus, endobronşiyal tümörler, mesane kanseri, bazal hücreli karsinom, baş ve boyun kanseri 2 palyatif tedavi olarak. Tedavi çok az yan etkileri olan, yerel büyük ölçekli nekroza neden olduğu bilinmektedir ve bu yüzden seçici olarak tümör dokusu ortadan kaldırmak için potansiyele sahiptir. Bu avantajlara rağmen, PDT uygulama kemoterapötik ilaçların uygulanması daha teknik olarak daha zor olmaya devam etmektedir. Maksimal etkinlik, PS konsantrasyonu, ışığa maruz kalma süresini ve toplam ışık enerji transferini elde etmek için optimize edilmiş olması gerekir. Bu, in vivo deneyler yapılabilir, ancak Optimize edilmiş gereken parametrelerin görece çok sayıda, bu ilk olarak in vitro en uygun şartları belirlemek için daha etkilidir. Aşağıda tarif edilen deneylerde, PS 5,10,15,20-tetrakis-(meta-hidroksifenil) CHL kullanan PDT in vitro etkinliği testOrin, mTHPC (Şekil 1A) kısaltılır. mTHPC anda baş ve boyun kanseri hafifletici tedavisi için klinikte kullanılan tıbbi ürün Foscan, aktif maddedir. Düşük konsantrasyonlarda zaten büyük hücre hasarının neden olan, en güçlü PS biridir ve bu doku penetrasyonu 9, 10 açısından diğer PS üstün olduğu gösterilmiştir. Hafif emilme tayfı (Şekil 1 B), sırasıyla PS biriken doku lokalizasyonu ve PDT indüksiyonu için kullanılan iki önemli tepe, 417 nm &#39;de bir ve 652 nm&#39; de bir ikinci, göstermektedir. Şu anda, mTHPC için bir lipozomal formülasyon geliştirme aşamasındadır. İşte, biz bu lipozomal formülasyon alımını ölçmek için, ve iki insan OS hücre hatlarında FDT gerçekleştirmek için prosedürleri tarif; düşük metastatik HOS ve yüksek metastatik 143B hücreleri. Burada sunulan verilerin bazıları 11 daha önce rapor edilmiştir. ThBurada anlatılan E yaklaşım PDT etkinliği üzerinde bir metastatik fenotip etkisini araştırmak için bize sağlar. Orthotopically bağışıklık yetersizliği olan SCID farelerinin arka bacaklarda enjekte 143B hücrelerinin metastaz intratibial birincil tümörlerin, yakından insan Metastaz hastalığı taklit eden bir model neden olur. Bu nedenle, önerilen in vitro deneyler uygun PDT ayarlar daha sonra in vivo deneylerde kullanılmak üzere değerlendirmek için mükemmel bir şekilde uygundur.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="955">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">DMEM</td>
			<td style="width:251px;">PAA GmbH, Freiburg, Germany</td>
			<td style="width:127px;">E15-883</td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">HAM F12</td>
			<td>PAA GmbH, Freiburg, Germany</td>
			<td style="width:127px;">E15-817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">heat-inactivated fetal calf serum</td>
			<td>GIBCO, Basel, Switzerland</td>
			<td style="width:127px;">10500-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:291px;">mTHPC</td>
			<td style="width:251px;">biolitec research GmbH, Jena, Germany</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:287px;">As this liposomal formulation is originating from R &#38; D 
			no catalogue number is available at the moment. Stock: 1.5mg/ml; provided in a 9:1 mixture of dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) and dipalmitoylphosphatidylglycerol (DPPG; &#62;99% purity)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spectramax Gemini XS plate reader</td>
			<td style="width:251px;">Molecular Devices, Sunnyvale, CA</td>
			<td style="width:127px;">ID# 861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">Microscope Zeiss Observer.Z1</td>
			<td style="width:251px;">Axio Observer, Axio Vision Release 4.6.3 SP1, Jena Germany</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Ceralas PDT 652 nm Laser</td>
			<td style="width:251px;">Biolitec AG, Jena, Germany</td>
			<td style="width:127px;">LD652nm2W400u</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">Water-soluble tetrazolium (WST) reagent</td>
			<td style="width:251px;">Roche Diagnostics AG, Rotkreuz, Switzerland</td>
			<td style="width:127px;">1644807</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cytotoxic efficacy of photodynamic therapy in osteosarcoma cells in vitro

Son yıllarda, daha az sistemik yan etkiler ile, kansere karşı daha etkili bir tedavi bulma zorluğu olmuştur. Bu nedenle Fotodinamik tedavi, daha seçici tümör tedavisi için yeni bir yaklaşımdır. Oksijen varlığında, belirli bir dalga boyundaki ışık ile aktivasyon üzerine, bir sitotoksik yanıtı ortaya çıkarma 1 oksijen radikal üreten, toksik olmayan bir photosensitizer (PS), kullanan fotodinamik terapi (PDT). FDA tarafından neredeyse yirmi yıl önce onun onayına rağmen, PDT günümüzde sadece kanser türleri (cilt, mesane) ve nononcological hastalıkları (sedef, aktinik keratoz) 2 sınırlı sayıda tedavi etmek için kullanılır. PDT kullanımının en büyük avantajı, sistemik yan etkileri engelleyen bir lokal tedavi, gerçekleştirmek için yeteneğidir. Ayrıca, (sinirler veya kan damarlarının çapında) örneğin hassas bölgelerde tümörlerin tedavisine izin verir. Burada, bir intraoperatPDT ive uygulama osteosarkom (OS), primer tümör uyduları hedef kemik tümör, cerrahi tümör rezeksiyonu sonrasında dokuyu çevreleyen tümör geride kabul edilir. Tedavi nükslerin sayısını azaltmakta ve (postoperatif) metastaz riskini azaltmayı amaçlamaktadır. Bu çalışmada, iyi kurulmuş intratibial OS fare modellerinde, insan hastalığı üretmek için kullanılan yaygın olarak kullanılan OS hücre çizgilerinin etkili bir tedavi için uygun PDT ayarlarını elde etmek üzere in vitro PDT işlemleri içinde mevcut. PS mTHPC alımı, bir spektrofotometre ve fototoksisite bir WST-1 deneyi ile ve hayatta kalan hücrelerin sayımı ile değerlendirilen, hücre ölümünü teşvik etmek için 652 nm&#39;de mTHPC lazer ışığı uyarım ile tahrik edilmiştir ile incelenmiştir. Kurulan teknikleri, hayvan modellerinde gelecekteki çalışmalar için uygun PDT ayarları tanımlamak için bize sağlar. Onlar PDT etkinliğinin değerlendirilmesi için kolay ve hızlı bir araçtır <em&gt; In vitro, in vivo olarak bir uygulama yapılmıştır.

Burada bildirilen teknikler ile, insan OS hücrelerinde mTHPC bazlı PDT incelenmiştir. İlk olarak, mTHPC zamana ve doza bağımlı bir alım, düşük metastatik HOS ve yüksek düzeyde metastatik 143B OS hücre hatlarında araştırılmıştır. mTHPC alımı bir floresan spektrofotometre ile mTHPC floresanı (Reidy et al. 11 izni ile yeniden Şekil 2) ölçülmesi ile değerlendirilebilmektedir. Şekil 2A, bir zaman bağlı bir şekilde mTHPC alımını gösterm...

Watch this Scientific Journal Video about Cytotoxic Efficacy of Photodynamic Therapy in Osteosarcoma Cells In Vitro at JoVE.com

Cytotoxic Efficacy of Photodynamic Therapy in Osteosarcoma Cells In Vitro

Burada bildirilen protokol sağlar: fotodinamik hücre hatlarında tedavi (PDT) ve hayvan modellerinde tedavi uygulamadan önce PDT ayarlarının optimizasyonu etkinliğinin değerlendirilmesi.

Osteosarkom Hücrelerde Fotodinamik Tedavi sitotoksik etkinliği<em&gt; In Vitro</em

In recent years, there has been the difficulty in finding more effective therapies against cancer with less systemic side effects. Therefore Photodynamic ...

cytotoxic-efficacy-photodynamic-therapy-osteosarcoma-cells

Research

JoVE Journal

Medicine

Cytotoxic Efficacy of Photodynamic Therapy in Osteosarcoma Cells In Vitro

12.7K Görüntüleme.  Balgrist University Hospital, Zurich, Switzerland.  Burada bildirilen protokol sağlar: fotodinamik hücre hatlarında tedavi (PDT) ve hayvan modellerinde tedavi uygulamadan önce PDT ayarlarının optimizasyonu etkinliğinin değerlendirilmesi. 

Video: Cytotoxic Efficacy of Photodynamic Therapy in Osteosarcoma Cells In Vitro

Subretinal Injection of Gene Therapy Vectors and Stem Cells in the Perinatal Mouse Eye

The loss of sight affects approximately 3.4 million people in the United States and is expected to increase in the upcoming years.1 Recently, gene therapy and stem cell transplantations have become key therapeutic tools for treating blindness resulting from retinal degenerative diseases. Several forms of autologous transplantation for age-related macular degeneration (AMD), such as iris pigment epithelial cell transplantation, have generated encouraging results, and human clinical trials have begun for other forms of gene and stem cell therapies.2 These include RPE65 gene replacement therapy in patients with Leber's congenital amaurosis and an RPE cell transplantation using human embryonic stem (ES) cells in Stargardt's disease.3-4 Now that there are gene therapy vectors and stem cells available for treating patients with retinal diseases, it is important to verify these potential therapies in animal models before applying them in human studies. The mouse has become an important scientific model for testing the therapeutic efficacy of gene therapy vectors and stem cell transplantation in the eye.5-8 In this video article, we present a technique to inject gene therapy vectors or stem cells into the subretinal space of the mouse eye while minimizing damage to the surrounding tissue.

This surgical technique illustrates the injection of gene therapy vectors and stem cells into the subretinal space of the mouse eye.

Fare Göz içine Gen Terapisi Vektörler ve Kök Hücre Subretinal Enjeksiyon

The loss of sight affects approximately 3.4 million people in the United States and is expected to increase in the upcoming years.1 Recently, gene therapy ...

Tıp

In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor initiation and/or relapse. Clarifying the mechanisms by which these tumor-initiating cells (TICs) support tumor formation and progression could lead to the development of clinically favorable therapies. Ovarian cancer is a heterogeneous and highly recurrent disease. Recent studies suggest TICs may play an important role in disease biology. We have identified culture conditions that enrich for TICs from ovarian cancer cell lines. Growing either adherent cells or non-adherent &#8216;floater&#8217; cells in a low attachment plate with serum free media in the presence of growth factors supports the propagation of ovarian cancer TICs with stem cell markers (CD133 and ALDH activity) and increased tumorigenicity without the need to physically separate the TICs from other cell types within the culture. Although the presence of floater cells is not common for all cell lines, this population of cells with innate low adherence may have high tumorigenic potential.Compared to adherent cells grown in the presence of serum, TICs readily form spheres, are significantly more tumorigenic in mice, and express putative stem cell markers. The conditions are easy to establish in a timely manner and can be used to study signaling pathways important for maintaining stem characteristics, and to identify drugs or combinations of drugs targeting TICs. The culture conditions described herein are applicable for a variety of ovarian cancer cells of epithelial origin and will be critical in providing new information about the role of TICs in tumor initiation, progression, and relapse.

In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

Tumor-initiating cells (TICs) may represent a viable therapeutic target for the treatment of ovarian cancer, a highly recurrent and fatal disease. We present a protocol for culture conditions that enrich for this highly tumorigenic population of cells.

Yumurtalık Kanseri Tümör başlatan Hücrelerinin in vitro Zenginleşmeden içinde

Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

Pankreas Kanseri Yeni Tedavi Stratejileri Geliştirme Hücre Özellikleri Kök incelenmesi

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic patient tumors in different assays1. Human tumor xenografts represent the gold standard with respect to tumor biology, drug discovery, and metastasis research 2-4. Tumor xenografts can be derived from different types of material like tumor cell lines, tumor tissue from primary patient tumors4 or serially transplanted tumors. When propagated in vivo, xenografted tissue is infiltrated and vascularized by cells of mouse origin. Multiple factors such as the tumor entity, the origin of xenografted material, growth rate and region of transplantation influence the composition and the amount of mouse cells present in tumor xenografts. However, even when these factors are kept constant, the degree of mouse cell contamination is highly variable.
Contaminating mouse cells significantly impair downstream analyses of human tumor xenografts. As mouse fibroblasts show high plating efficacies and proliferation rates, they tend to overgrow cultures of human tumor cells, especially slowly proliferating subpopulations. Mouse cell derived DNA, mRNA, and protein components can bias downstream gene expression analysis, next-generation sequencing, as well as proteome analysis 5. To overcome these limitations, we have developed a fast and easy method to isolate untouched human tumor cells from xenografted tumor tissue. This procedure is based on the comprehensive depletion of cells of mouse origin by combining automated tissue dissociation with the benchtop tissue dissociator and magnetic cell sorting. Here, we demonstrate that human target cells can be can be obtained with purities higher than 96% within less than 20 min independent of the tumor type.

Human tumor xenografts are vascularized and infiltrated by cells of mouse origin during the growth phase in vivo. To circumvent the bias caused by these contaminating cells during downstream analysis, we developed a method allowing for comprehensive depletion of all mouse cells by magnetic cell sorting.

İnsan Tümör ksenogratflarının gelen Fare Hücrelerinin tükenmesi Anlamlı Hedef Hücre Alt Analizi geliştirir

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant CFTR channel in subjects with cystic fibrosis (CF). Identification of subjects that may benefit from these drugs is challenging because of the extensive heterogeneity of CFTR mutations, as well as other unknown factors that contribute to individual drug efficacy. Here, we describe a simple and relatively rapid assay for measuring individual CFTR function and response to CFTR modulators in vitro. Three dimensional (3D) epithelial organoids are grown from rectal biopsies in standard organoid medium. Once established, the organoids can be bio-banked for future analysis. For the assay, 30-80 organoids are seeded in 96-well plates in basement membrane matrix and are then exposed to drugs. One day later, the organoids are stained with calcein green, and forskolin-induced swelling is monitored by confocal live cell microscopy at 37 &#176;C. Forskolin-induced swelling is fully CFTR-dependent and is sufficiently sensitive and precise to allow for discrimination between the drug responses of individuals with different and even identical CFTR mutations. In vitro swell responses correlate with the clinical response to therapy. This assay provides a cost-effective approach for the identification of drug-responsive individuals, independent of their CFTR mutations. It may also be instrumental in the development of future CFTR modulators.

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

This protocol describes an assay for measuring CFTR function and CFTR modulator responses in cultured tissue from subjects with cystic fibrosis (CF). Biopsy-derived intestinal organoids swell in a cAMP-driven fashion, a response that is defective (or strongly reduced) in CF organoids and can be restored by exposure to CFTR modulators.

Forskolin kaynaklı bağırsak Organoids şişme: Bir<em&gt; İn Vitro</em&gt; Deney Kistik Fibrozis Hastalarında İlaç Tepki değerlendirilmesi için

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene and cell therapies are highly promising alternative approaches for CVD treatment. However, the broad clinical application of gene therapy is greatly limited by the lack of suitable gene delivery systems. The development of appropriate gene delivery vectors can provide a solution to current challenges in cell therapy. In particular, existing drawbacks, such as limited efficiency and low cell retention in the injured organ, could be overcome by appropriate cell engineering (i.e., genetic) prior to transplantation. The presented protocol describes the efficient and safe transient modification of endothelial cells using a polyethyleneimine superparamagnetic magnetic nanoparticle (PEI/MNP)-based delivery vector. Also, the algorithm and methods for cell characterization are defined. The successful intracellular delivery of microRNA (miR) into human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) has been achieved without affecting cell viability, functionality, or intercellular communication. Moreover, this approach was proven to cause a strong functional effect in introduced exogenous miR. Importantly, the application of this MNP-based vector ensures cell magnetization, with accompanying possibilities of magnetic targeting and non-invasive MRI tracing. This may provide a basis for magnetically guided, genetically engineered cell therapeutics that can be monitored non-invasively with MRI.

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

This manuscript describes the efficient, non-viral delivery of miR to endothelial cells by a PEI/MNP vector and their magnetization. Thus, in addition to genetic modification, this approach allows for magnetic cell guidance and MRI detectability. The technique can be used to improve the characteristics of therapeutic cell products.

Hazırlık ve<em&gt; İn Vitro</em&gt; Mıknatıslanmış karakterizasyonu Endotel Hücreleri miR-modifiye

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

A Method for Quantifying Upper Limb Performance in Daily Life Using Accelerometers

A key reason for referral to rehabilitation services after stroke and other neurological conditions is to improve one's ability to function in daily life. It has become important to measure a person's activities in daily life, and not just measure their capacity for activity in the structured environment of a clinic or laboratory. A wearable sensor that is now enabling measurement of daily movement is the accelerometer. Accelerometers are commercially-available devices resembling large wrist watches that can be worn throughout the day. Data from accelerometers can quantify how the limbs are engaged to perform activities in peoples' homes and communities. This report describes a methodology to collect accelerometry data and turn it into clinically-relevant information. First, data are collected by having the participant wear two accelerometers (one on each wrist) for 24 h or longer. The accelerometry data are then downloaded and processed to produce four different variables that describe key aspects of upper limb activity in daily life: hours of use, use ratio, magnitude ratio, and the bilateral magnitude. Density plots can be constructed that visually represent the data from the 24 h wearing period. The variables and their resultant density plots are highly consistent in neurologically-intact, community-dwelling adults. This striking consistency makes them a useful tool for determining if upper limb daily performance is different from normal. This methodology is appropriate for research studies investigating upper limb dysfunction and interventions designed to improve upper limb performance in daily life in people with stroke and other patient populations. Because of its relative simplicity, it may not be long before it is also incorporated in clinical neurorehabilitation practice.

This protocol describes a method to quantify upper limb performance in daily life using wrist-worn accelerometers.

Ivmeölçer kullanan Günlük Yaşamda Üst Ekstremite Performans miktarının Bir Yöntem

A key reason for referral to rehabilitation services after stroke and other neurological conditions is to improve one's ability to function in daily life. ...

An In Vitro Approach to Photodynamic Therapy

Photodynamic therapy (PDT) is a medical procedure that involves incubation of an exogenously applied photosensitizer (PS) followed by visible light photoactivation to induce cell apoptosis. The Federal Drug Administration has approved PDT for the treatment of actinic keratosis, and clinical guidelines recommend PDT as a treatment for certain non-melanoma skin cancers and acne vulgaris. PDT is an advantageous therapeutic modality as it is low cost, non-invasive, and associated with minimal adverse events and scaring. In the first step of PDT, a PS is applied and allowed to accumulate intracellularly. Subsequent light irradiation induces reactive oxygen species formation, which may ultimately lead to cell apoptosis, membrane disruption, mitochondrial damage, immune modulation, keratinocyte proliferation, and collagen turnover. Herein, we present an in vitro method to study PDT in an adherent cell line. This treatment protocol is designed to simulate PDT and may be adjusted to studying the use of PDT with various cell lines, photosensitizers, incubation temperatures, or photoactivation wavelengths. Squamous cell carcinoma cells were incubated with 0, 0.5, 1.0, and 2 mM 5-aminolevulinic acid (5-ALA) for 30 min and photoactivated with 417 nm blue light for 1,000 s. The primary outcome measure was apoptosis and necrosis, as measured by annexin-V and 7-aminoactinomycin D flow cytometry. There was a dose-dependent increase in cell apoptosis following thirty-minute incubation of 5-ALA. To achieve high inter-test validity, it is important to maintain consistent incubation and light parameters when performing in vitro PDT experiments. PDT is a useful clinical procedure and in vitro research may allow for the development of novel PSs, optimization of protocols, and new indications for PDT.

An In Vitro Approach to Photodynamic Therapy

Photodynamic therapy (PDT) is a medical procedure that involves incubation of an exogenously applied photosensitizer (PS) followed by visible light photoactivation to induce apoptosis. We present an in vitro PDT protocol designed to simulate PDT that may be used to study differences in PS incubation and light treatment parameters.

Fotodinamik Tedavi bir Vitro yaklaşım

Photodynamic therapy (PDT) is a medical procedure that involves incubation of an exogenously applied photosensitizer (PS) followed by visible light ...

Preparation Of Gushukang (GSK) Granules for In Vivo and In Vitro Experiments

Traditional Chinese herbal medicine plays a role as an alternative method in treating many diseases, such as postmenopausal osteoporosis (POP). Gushukang (GSK) granules, a marketed prescription in China, have bone-protective effects in treating POP. Before administration to the body, one standard preparation procedure is commonly required, which aims to promote the release of active constituents from raw herbs and enhance the pharmacological effects as well as therapeutic outcomes. This study proposes a detailed protocol for using GSK granules in in vivo and in vitro experimental assays. The authors first provide a detailed protocol to calculate the animal-appropriate dosages of granules for in vivo investigation: weighing, dissolving, storage, and administration. Second, this article describes protocols for micro-CT scanning and the measurement of bone parameters. Sample preparation, protocols for running the micro-CT machine and quantification of bone parameters were evaluated. Third, serum-containing GSK granules are prepared, and drug-containing serum is extracted for in vitro osteoclastogenesis and osteoblastogenesis. GSK granules were intragastrically administered twice per day to rats for three consecutive days. Blood was then collected, centrifuged, inactivated, and filtered. Finally, serum was diluted and used for performing osteoclastogenesis and osteoblastogenesis. The protocol described here can be considered a reference for pharmacological investigations of herbal prescription medicines, such as granules.

Preparation Of Gushukang GSK Granules for In Vivo and In Vitro Experiments

This article provides a detailed protocol for preparing a working solution of Gushukang granules for animal studies and GSK granule containing serum for in vitro experiments. This protocol can be applied to pharmacological investigations of herbal medicines as well as prescriptions for both in vivo and in vitro experiments.

In vivo ve In vitro deneyler için Gushukang (GSK) granül hazırlanması

Traditional Chinese herbal medicine plays a role as an alternative method in treating many diseases, such as postmenopausal osteoporosis (POP). Gushukang ...

Large Animal Model for Evaluating the Efficacy of the Gene Therapy in Ischemic Heart

Coronary artery disease is one of the significant causes of mortality and morbidity worldwide. Despite the progression of current therapeutics, a considerable proportion of coronary artery disease patients remain symptomatic. Gene therapy-mediated therapeutic angiogenesis offers a novel therapeutic method for improving myocardial perfusion and relieving symptoms. Gene therapy with different angiogenic factors has been studied in few clinical trials. Due to the novelty of the method, the progress of myocardial gene therapy is a continuous path from bench to bedside. Therefore, large animal models are needed for evaluating the safety and efficacy. The more the large animal model identifies the original disease and the endpoints used in clinics, the more predictable outcomes are from clinical trials. Here, we introduce a large animal model for evaluating the efficacy of the gene therapy in the ischemic porcine heart. We use clinically relevant imaging methods such as ultrasound imaging and 15H2O-PET. For targeting the gene transfers into the desired area, electroanatomical mapping is used. The aim of this method is: (1) to mimic chronic coronary artery disease, (2) to induce therapeutic angiogenesis at hypoxic areas of the heart, and (3) to evaluate the safety and efficacy of the gene therapy by using relevant endpoints.

Myocardial gene therapy for ischemic heart disease holds great promise for future therapeutics. Here, we introduce a large animal model for evaluating the efficacy of gene therapy in the ischemic heart.