Uwe Strahle ve nazik neurogenin1 muhabir hattı sağlamak için; Vyacheslav Kalchenko, Douglas Lutz ve teknik danışmanlık ve yardım için iki foton uncaging ile Leonid Roitman;; Maayan Tahor ve teknik yardım için Suliman Elsadin sayesinde şekil grafik genia Brodsky nedeniyle Bu yazının yorumları için Amos Gutnick. İsrail Bilim Vakfı (hibe sayısı 928/08) ve Harriet &amp; Marcel Dekker Vakfı; Levkowitz laboratuarında araştırma Alman-İsrail Vakfı (hibe sayısı 183/2007) tarafından desteklenmektedir. GL Biyomedikal Araştırma Tauro Kariyer Geliştirme Başkanı bir görevdeki.

Biz kafesli floresein kullanarak hücre etiketleme bir protokol tanımlayan, ancak diğer fotoğraf devreye sokulabilir boyalar ve proteinlerin aynı şekilde kullanılan olabilir. 1. Kafesli Floresein enjeksiyon <ol><li> Dextran-konjuge 4,5-dimetoksi 2-nitrobenzyl floresein (DMNB) (10.000 MW dekstran, anyonik, Invitrogen, moleküler problar, Carlsbad, CA kafesli% 5 stok solüsyonu hazırlayın (5mg kafesli floresein / 100 mcL 0,2 M KCl) , kedi yok. D-3310). -20 ° C&#39;de kısım ve mağaza DMNB-kafesli floresein ışığa duyarlı ve karanlıkta tutulması gerektiğini unutmayın. </li><li> &quot;Zebra balığı kitap&quot; 1 açıklandığı gibi% 1 agaroz (Sigma, St Louis, MO, kedi hayır. A9539) yapılan bir enjeksiyon çukur hazırlayın. </li><li> 100 x E3 stok solüsyonu seyreltilmesi ile 2 litre E3 ortamı hazırlayın. </li><li> Enjeksiyondan önce akşam, erkek (ler) fotoaktivasyon için hedef hücrelerinin lokalize için kullanılan bir görünür floresan dönüm noktası (GFP, RFP vb.) Ifade istenilen transgenik çizgi kadın (lar) dan ayıran çiftleşme kafesleri hazırlamak. </li><li> Mikropipet çektirmesi (Sutter Enstrüman, Novato, CA, P-97) kullanarak kılcal enjeksiyon iğneleri (filamanlı İnce Duvar Cam kılcal, Dünya Hassas Aletler, Sarasota, FL, kedi hayır. TW100F-6) hazırlayın. </li><li> Floresein kafesli buz üzerinde% 5 bir kısım çözülme. </li><li> 0,2 M KCl% 5 kafesli floresein stok çözelti% 1&#39;lik bir nihai konsantrasyonu azaltır ve buz üzerinde tutmak. Işığa maruz kaçının. </li><li> Kurulum çiftleşme 4. adımda hazırlanan geçer. </li><li> Döllenmiş yumurtalar kısa sürede belirtilen olarak toplayın. Orient agaroz enjeksiyon kalıp tek hücreli dönem embriyoların E3 1 ile kaplanmış. </li><li> Microloader ucu (Eppendorf, Hamburg, Almanya, kedi.. 5242 956,003) dolgu ~ 1% 1 kafesli floresein çözüm mcL bir enjeksiyon iğnesinin kullanılması. </li><li> Gazla çalışan bir mikroenjektör (pnömatik picopump, Dünya Hassas Aletler, Sarasota, FL, PV820) bağlı bir mikromanipülatör içine yerleştirin iğne yüklenir </li><li> 2-3nl enjeksiyon hacmi ayarlayın ve kafesli floresein doğrudan hücre sitoplazma içine enjekte edilir. Deneme başına 50 embriyoların en az enjekte edilir. </li><li> 28.5 karanlıkta embriyolar inkübe ° C istenen gelişimsel aşamada E3. Eğer 24 saat sonra döllenme daha büyük embriyolar analiz edilir, pigmentasyon inhibe etmek için% 0.1 (PTU, Sigma, St Louis, MO, kedi hayır. 22.290-9) phenylthiourea ekleyin. </li></ol> 2. Embriyo Montaj <ol><li> (4 ° C&#39;de bir hafta saklanabilir çözümler parçası) taze E2 çözüm hazırlayın. </li><li> E2 ortamda çözünmüş 1% agaroz ince bir tabaka ile kaplayın 60 mm Petri kapları. </li><li> % 2 düşük erime noktası agaroz (Ultra Saf LMP agaroz, Invitrogen, Carlsbad, CA, kedi hayır 16.520.100) gömme hazırlayın: agaroz steril çift distile su kaynayana kadar mikrodalga ısıtma çözülür. Isıtma sırasında tüp kılıfı açık tutun. Kısım mikrosantrifüj tüpler içine 1 ml ve 72 ısıtma bloğu ° C </li><li> Embriyoların chorions hafifçe keskin forseps (5) sayılı dışında koryon çekerek çıkarın. (Bkz: adım 2) agar-kaplı çanak E2 çözüm embriyoların tutun. Polipropilen pipetler yapışabilir Dechorionated embriyolar yangın parlatılmış cam Pasteur pipeti ile ele alınmalıdır. Bu embriyolar sıvı yüzey gerilimi tarafından hasar görmüş olabilir gibi hava dechorionized embriyo açığa kaçının. </li><li> E2 küçük hacimli bir yangın parlatılmış cam Pasteur pipeti kullanarak seçili embriyo toplayın, ve 60 mm Petri kabında embriyo. Mount embriyo yanında bir damla% 2&#39;lik agaroz (~ 150 mcL) (3. aşama). Hızla iki damla karıştırın ve homojen bir final ~% 1 agaroz karışımı elde etmek için embriyonun dorsal yüzü objektif lens bakan bir diseksiyon mikroskobu şark kullanarak. </li><li> Agaroz katılaşmış kadar bekleyin ve gömülü embriyo sıvı batık kadar E2 orta ekleyin. Bu fotoaktivasyon işleminden sonra agaroz serbest olarak çanak başına tek embriyo elde etmek için tercih edilir. </li></ol> 3. Fotoaktivasyon <ol><li> Biz bir Zeiss LSM 510 META NLO iki foton, ayarlanabilir bir geniş bant (700-1020nm) Spectraphysics den Mai Tai-HP-femtosecond lazer ile donatılmış mikroskop kullanın. </li><li> Üzerine monte edilmiş bir embriyo mikroskop altında bir plaka sahibi yerleştirin. Embriyo floresan dönüm noktası 40x/0.8W Achroplan su kullanarak hedefi dalmış görüntülenmiştir. 500-550nm bant geçiren filtre (BP) ile non-descanned dedektörü (NDD) aşağıdaki adımları izleyin. </li><li> Fotoaktivasyon süreci için bir ön koşul olarak, en ventral görüntü serisi 860nm iki foton lazer dalga boyu (GFP algılama) ile tespit floresan sinyal dorsal parçası satın alarak ilgi bölgenin mekansal floresan bilgi edinin. Bu amaçla, yeterli çözünürlük elde edilen her bir odak düzlemi arasındaki 6μm bir yayılma kullanılarak elde edilebilir. </li><li> Hedef seçinfotoaktivasyon için z-düzlemi ve bu bölgede odak noktası haline getirmek. Deneyin amacı bağlı olarak, faiz bölge GFP görünür dönüm içinde veya dışında da olabilir. Bu z-düzleminde tek bir görüntü çekin. Görüntü kaydetme ve ayrı bir pencerede açık tutmak. </li><li> 720nm iki foton lazer dalga boyu ayarlama ve lazer &#39;Düzenle çamaşır suyu&#39; menüsünden açmak mod-kilitli olduğu zaman. &#39;Tanımlama Bölgesi&#39; menüsünü kullanarak 860nm (Adım 4) alınan görüntü göre fotoaktivasyon ilgi bölgesi (ROI) tanımlayın. Bu, ikinci eylem, x, y konumları gözlenen alan değişiklikleri gibi lazer dalga boyu 720nm değişen sonra bu resmin üzerine ROI seçmek için çok önemlidir. </li><li> (Bkz: adım 9) &#39;Düzenle çamaşır suyu&#39; menüsünden fotoaktivasyon için aşağıdaki parametreleri ayarlayın: a) göreceli lazer güç; b) iterasyon sayısını, c) tarama hızı. </li><li> Basın &#39;Düzenle çamaşır suyu&#39; penceresi &#39;Bleach&#39; ve lazer durana kadar bekleyin. </li><li> 860nm için geri dönün, çıkan photoactivated malzeme ve görüntü elde aktive etki Z-a (kalınlık) değerlendirmek için ikinci bir dizi yoğunluğunu değerlendirmek için bir tek düzlem görüntü kazanır. </li><li> Fotoaktivasyon için aşağıdaki parametreler göz önünde bulundurun: <ol class="lalpha"><li> Lazer yoğunluğu ve fotoaktivasyon süresi: Bir ampirik olarak değişen iki parametre tarafından fotoaktivasyon için en uygun koşulların belirlenmesi gerekir. Acousto-Optik Modülatör (AOM) iletim göreceli lazer güç tarafından kontrol edilebilir. Fotoaktivasyon süresi tekrarlamalar ve tarama hızı sayısının bir fonksiyonudur. </li><li> Uncaged floresan doygunluk önlemek için floresan doğrusal aralığı belirleyin. </li><li> Uncaged moleküllerin elde edilen floresan ve photoactivated klon 2 z ekseni bir sürede arasında doğrusal bir korelasyon vardır. </li></ol></li></ol> 4. Uncaged Floresein Tespiti <ol><li> Fotoaktivasyon sonra karanlıkta embriyolar yükseltmek, 28.5 ° C E2 orta deri pigmentasyonu görünümünü önlemek için% 0.1 PTU içeren. </li><li> Diseksiyon mikroskop altında agaroz istenilen gelişimsel aşamada, embriyo çıkarın. Sivri uçlu bir bistüri kullanarak, &quot;V&quot; embriyonun kafası dönük böylece embriyo yakın agaroz &quot;V&quot; şeklinde kesi oluşturmak. &quot;V&quot; embriyo başkanı yakın noktada kapalı bir pens yerleştirin ve hafifçe embriyo uzunluğu boyunca agaroz ayıran ve ortama embriyo serbest forseps açık itin. </li><li> Bir yangın cilalı Pasteur pipeti ile embriyoların toplayın ve paraformaldehid (PFA;% 4 1 x PBS, pH 7.2) ile düzeltmek oda sıcaklığında 3 saat veya gece boyunca 4 ° C </li><li> Fiksatif çözüm çıkartın ve oda sıcaklığında en az 5 dakika PBST 2-3 kez yıkayın. </li><li> Taze metanol ve -20 ° C&#39;de inkübe ile doldurmak, en az 2 saat, 10 dakika süreyle% 100 metanol ile embriyolar yıkayın. </li><li> % 80,% 60,% 40 ve% 20: PBSTr seyreltilmiş metanol bir dizi ardışık inkubasyon (5 dk) embriyolar rehidrate. PBSTr 2 x 10 dakika yıkayın. </li><li> 500 mcL Engelleme çözüm oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. </li><li> Çözüm Engelleme 1:500 sulandırılmış bir anti-Floresein alkalen fosfataz (AP) Fab parçaları (Roche, Palo Alto, CA, kedi.. 11426338910) ekleyin ve 4 gece boyunca inkübe ° C (kendi tarafta yer mikrosantrifüj tüpleri) . </li><li> PBST 5 x 15 dakika yıkayın. </li><li> TNT, 0,2 M NaCl 5 dakika yıkayınız. </li><li> TNT 0.4M NaCl içinde 5 dakika boyunca yıkayın. </li><li> Prestain çözüm taze hazırlanmış 3 x 5 dakika dengelenmesi. </li><li> Hızlı Kırmızı tablet (Roche, Palo Alto, CA, kedi no 11496549001), 2 mL Prestain çözelti içinde eritin. Un çözünmüş parçacıklar atlamak için Whatman No 2 kağıt kullanarak çözüm filtre tavsiye edilir. Alternatif olarak, çözüm aşağı spin ve net süpernatant sıvı kullanın. </li><li> 500 mcL Hızlı Kırmızı oda sıcaklığında karanlıkta inkübe her tüp çözüm, ve monitör renk gelişimi istenilen sinyal-zemin oranı (birkaç saat 20 dakika) ulaşana kadar ekleyin. Eğer arka plan geliştirir, 4 transfer ° C. Inkübasyon bir saat sonra, yeni bir Hızlı Kırmızı boyama solüsyonu ile doldurun. </li><li> 3 x 5 dakika boyama tepki Dur PBST yıkar. </li><li> 20 dakika oda sıcaklığında% 4 PFA saptamak için. </li><li> PBST 2 x 5 dakika yıkayınız. </li><li> Embriyolar kadar% 25,% 50 ve PBS içinde% 75 gliserol ile net embriyoların tüpün alt kısmında yerleşmiş. Embriyolar birkaç gün süreyle 4 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. </li></ol> 5. Uncaged Alanı Floresan Görselleştirme <ol><li> Montaj için bir mikroskop lamı hazırlayın: 1 ml şırınga kullanarak birbirinden ~ 15mm bir mesafe yerleştirilen dört slaytta açık silikon gres lekeleri, uygulamak. Cente Mount embriyor ~% 75 gliserol ve yeri bir lamel (no. 0; 18x18mm) 200 mcL üst ve silikon karşı gliserol çözüm slaytlar arasındaki yüzey kaplar kadar yavaşça itin. </li><li> Sahneye monte embriyo yerleştirin ve 40x objektif kullanarak odak noktası haline getirmek. 488nm Argon ve uyarma kaynağı olarak 543nm HeNe lazerler kullanarak görüntüleri konfokal Z-serisi edinin. </li><li> Photoactivatated etki z ekseni a Uncaged embriyo bir görüntü analiz yazılımı kullanarak 3 boyutlu rekonstrüksiyon kullanarak analiz edilebilir. </li></ol> 6. Çözümler <table border="1"><tbody><tr><td> 100 x E3 </td><td> 174mm 21mm KCl, NaCl, 12mm MgSO 4, 18mm Ca (NO3), 15mm Hepes, pH = 7.4 . Filtrasyon ve mağaza tarafından sterilize, 4 ° C </td></tr><tr><td> 20 x E2 </td><td> 0,3 M NaCl, 10mM KCl, oda sıcaklığında 20mm CaCl 2 * 2HOH, 20mm MgSO 4 * 7HOH, 3mm KH 2 PO 4, 0.8mm Na 2 HPO 4 * 2HOH, süzüntü ve mağaza </td></tr><tr><td> 1 x E2 </td><td> 20 x E2 sulandırınız çift distile su ve taze NaHCO 3 (0.7mm final konsantrasyon), Penisilin ve Streptomisin (penisilin ve ml başına 100 mg streptomisin (Invitrogen 100U içeren 1 x nihai konsantrasyonu seyreltik kalem strep çözüm yapılmış eklemek Carlsbad, CA, kedi yok. 15.140-122)) </td></tr><tr><td> PBST </td><td> % 0.1 PBS içinde TWEEN-20 </td></tr><tr><td> PBSTr </td><td> PBS içinde% 0.3 Triton </td></tr><tr><td> Engelleme çözüm </td><td> % 10 BSA,% 0.3 Triton, PBS içinde% 1 DMSO </td></tr><tr><td> TNT </td><td> 100 mM Tris-HCl pH 7.5, 150mm NaCl,% 0.5, çift distile su TWEEN-20 </td></tr><tr><td> Prestain çözüm </td><td> 100 mM Tris-HCl pH 8.2, 0.4M NaCl,% 0.1, çift distile su TWEEN-20 </td></tr></tbody></table> 7. Temsilcisi Sonuçlar Yaşayan bir zebrafish embriyo ajanlar photoactivate iki foton mikroskopi bir örnek sunulmaktadır. Daha önce de benzer bir yaklaşım kullanarak zebrafish beyin 2,3 photoactivated etiketli sinir atalarıdır soy izlenmektedir. : GFP muhabiri transgen, canlı içsel bir dönüm noktası olarak görev yaptı: Şekil 1 neurog1 taşıyan zebrafish embriyoların anterior sinir plaka kafesli floresein konjuge tracer boya fotoaktivasyon gösterir. Embriyolar, bir hücre aşamada kafesli floresein enjekte ve tomurcuk aşamasında agaroz gömülü. 3 - 5 hücre gruplarının sahne uzamsal koordinatlarını neurog1 ölçüldü: GFP transgenik embriyo uncaging (Şekil 1A, A &#39;) için ilgi bölgesi (ROI) belirlemek için. Biz nöral plaka belirli bir etki alanı (Şekil 1B, B &#39;) floresein soy tracer Uncaged. Daha sonra, bu nöral progenitör etiketli subdomain kaderi Uncaged floresein (Şekil 1C, C &#39;) immün prim5 (24 saat sonra döllenme) aşamasında tespit edildi. Iki foton lazer uncaging ölçüde, yani Uncaged floresan ve photoactivated etki alanı (z a) kalınlığı yoğunluğu iki parametre ayarlayarak kontrol edilebilir: lazer yoğunluğu ve süresi. Ikinci iterasyon sayısı ve tarama hızının ayarlanması ile kontrol edilebilir (Russek-Blum, 2009, bölüm 3, adım 9 bakınız). Şekil 1&#39;de gösterilen örnekte, biz% 12 AOM iletim 25.6 μsec / piksel göreceli lazer gücü, 20 tekrarlamalar ve tarama hızı kullanılır. Bu ayarları kullanarak 9-10 hücreleri ve 30μm photoactivated z-a (~ 1-2 hücre satır) içeren bir yatırım getirisi olarak nitelendirdi. <img src="/files/ftp_upload/1902/1902fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1, iki-foton mikroskopi kullanılarak canlı zebrafish embriyo kafesli floresein fotoaktivasyon Temsilcisi sonucu . Şematik gösterimi (AC) ve fotoaktivasyon süreci temsilcisi görüntüleri (A&#39;C &#39;). 1 hücre aşamada kafesli floresein tracer boya enjekte edildi: (GFP: neurog1) Zebra balığı embriyo (A, A &#39;) neurogenin-1 organizatörü kontrolü altında ifade GFP yaşayın. 3-5 - hücre gruplarının sahne, ön beyin primordium (diensefalon) ayrı bir alan photoactivated ve Uncaged floresein tracer boya (B, B &#39;) tespit edilebilir. Fotoaktivasyon prosedürü takiben, embriyo ° C ve Uncaged floresein içeren beyin hücrelerinin 24 saat sonra döllenme (C, C &#39;hpf) anti-Floresein immün tarafından takip 28.5 inkübe edildi. Dien, Diencephalon; Telefon, Telencephalon.

<ol>
	<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Zebrafish+Book:+Guide+for+the+Laboratory+Use+of+Zebrafish+(Brachydanio+rerio.">The Zebrafish Book: Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Brachydanio rerio.</a> , (1995).</li><li>Russek-Blum, N., Nabel-Rosen, H., Levkowitz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+fate+map+of+the+zebrafish+diencephalon.">High resolution fate map of the zebrafish diencephalon.</a> Dev Dyn. 238, 1827-1835 (2009).</li><li>Russek-Blum, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopaminergic+neuronal+cluster+size+is+determined+during+early+forebrain+patterning.">Dopaminergic neuronal cluster size is determined during early forebrain patterning.</a> Development. 135, 3401-3413 (2008).</li><li>Kozlowski, D. J., Murakami, T., Ho, R. K., Weinberg, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+cell+movement+and+tissue+patterning+in+the+zebrafish+embryo+revealed+by+fate+mapping+with+caged+fluorescein.">Regional cell movement and tissue patterning in the zebrafish embryo revealed by fate mapping with caged fluorescein.</a> Biochem Cell Biol. 75, 551-562 (1997).</li><li>Staudt, N., Houart, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Prethalamus+Is+Established+during+Gastrulation+and+Influences+Diencephalic+Regionalization.">The Prethalamus Is Established during Gastrulation and Influences Diencephalic Regionalization.</a> PLoS Biol. 5, e69-e69 (2007).</li><li>Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optical+marker+based+on+the+UV-induced+green-to-red+photoconversion+of+a+fluorescent+protein.">An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 12651-12656 (2002).</li><li>Hatta, K., Tsujii, H., Omura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+tracking+using+a+photoconvertible+fluorescent+protein.">Cell tracking using a photoconvertible fluorescent protein.</a> Nat Protoc. 1, 960-967 (2006).</li><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).</li><li>Bulina, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromophore-assisted+light+inactivation+(CALI)+using+the+phototoxic+fluorescent+protein+KillerRed.">Chromophore-assisted light inactivation (CALI) using the phototoxic fluorescent protein KillerRed.</a> Nat Protoc. 1, 947-9453 (2006).</li><li>Adams, S. R., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+cell+chemistry+with+caged+compounds.">Controlling cell chemistry with caged compounds.</a> Annu Rev Physiol. 55, 755-784 (1993).</li><li>Wieboldt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photolabile+precursors+of+glutamate:+synthesis,+photochemical+properties,+and+activation+of+glutamate+receptors+on+a+microsecond+time+scale.">Photolabile precursors of glutamate: synthesis, photochemical properties, and activation of glutamate receptors on a microsecond time scale.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 91, 8752-8756 (1994).</li><li>Marque, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+caged+neurotransmitters.">Using caged neurotransmitters.</a> Nature. 337, 583-584 (1989).</li><li>Zucker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photorelease+techniques+for+raising+or+lowering+intracellular+Ca2.">Photorelease techniques for raising or lowering intracellular Ca2.</a> Methods Cell Biol. 40, 31-63 (1994).</li><li>Neveu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+caged+retinoic+acid+for+one-+and+two-photon+excitation+in+zebrafish+embryos.">A caged retinoic acid for one- and two-photon excitation in zebrafish embryos.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 47, 3744-3746 (2008).</li><li>Shestopalov, I. A., Sinha, S., Chen, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-controlled+gene+silencing+in+zebrafish+embryos.">Light-controlled gene silencing in zebrafish embryos.</a> Nat Chem Biol. 3, 650-651 (2007).</li><li>Ando, H., Furuta, T., Tsien, R. Y., Okamoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photo-mediated+gene+activation+using+caged+RNA/DNA+in+zebrafish+embryos.">Photo-mediated gene activation using caged RNA/DNA in zebrafish embryos.</a> Nat Genet. 28, 317-325 (2001).</li></ol>

Foto-aktive bileşikler fonksiyonu moleküllerin biyolojik ya da kimyasal olarak aktif bir devlet haline dönüştüren bir fotokimyasal reaksiyon inducing (genellikle UV), belirli bir dalga boyu ile aydınlatılmış kadar maskeli moleküllerdir. Aktivasyon ışığa maruz kaldıkları sınırlayarak tam zamansal ve mekansal olarak kontrol edilebilir beri bu probları, hücre biyolojisi araştırmalarında çok güçlü araçlar sunuyoruz. Çok foton mikroskopi önemli bir avantaj, nispeten...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Dextran-conjugated 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl (DMNB) caged fluorescein (10,000 MW dextran, anionic)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>D-3310</td>
<td>molecular probes</td>
</tr>
<tr>
<td>Agarose for injection trough and coated plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A9539</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Thin Wall Glass Capillaries with filament</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>TW100F-6</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micropipette puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instrument</td>
<td>P-97</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microloader tip</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>5242 956.003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pneumatic picopump</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>PV820</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phenylthiourea (PTU)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>22290-9</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Low melting point agarose for embryo mounting</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ultra Pure LMP agarose</td>
<td>16520100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anti-Fluorescein- alkaline phosphatase (AP) Fab fragments</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>11426338910</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fast Red</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>11496549001</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

two-photon-based photoactivation in live zebrafish embryos

Yaşayan bir organizma hedef bileşiklerin fotoaktivasyon gibi, embriyonik gelişim, hücresel sinyal ve yetişkin fizyoloji gibi çeşitli biyolojik süreçleri araştırmak için değerli bir yaklaşım olduğunu kanıtlamıştır. Bu bağlamda, multi-foton mikroskopi kullanımı, tek bir hücrenin çözünürlükte derin dokularda belirli bir ışık duyarlı ajan kantitatif fotoaktivasyon sağlar. Zebra balığı embriyolar optik şeffaf olduğu için, onların gelişimi in vivo olarak izlenebilir. Bu özellikler zebrafish odaklı ışığı ile kimyasal ajanlar ve proteinlerin çeşitli aktivite kontrol etmek için mükemmel bir model organizma. Burada biz, bizi, canlı zebrafish embriyolarının hücrenin kaderini takip kimyasal kafesli floresein aktivasyonu ikna etmek için iki-foton mikroskopi kullanımını tanımlamak. Biz, herhangi bir ilgi hücreleri bulmak ve hassas hedef canlı genetik bir dönüm noktası (GFP) ifade embriyolar kullanın. Bu prosedür, aynı şekilde, proteinleri, hormonlar, küçük moleküller ve diğer kafesli bileşikler hassas ışık kaynaklı aktivasyonu için kullanılabilir.

Watch this Scientific Journal Video about Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos at JoVE.com

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Multiphoton mikroskobu optik derin penetrasyon ve azaltılmış fototoksisite düşük enerjili fotonların kontrol sağlar. Biz zebrafish embriyolar canlı hücre etiketlenmesi için bu teknolojinin kullanımını anlatmayacağız. Bu protokol fotoğraf indüksiyonu için çeşitli ışık duyarlı moleküllerin kolayca adapte edilebilir.

Canlı Zebra balığı Embriyolar iki-Foton-Tabanlı fotoaktivasyon

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

two-photon-based-photoactivation-in-live-zebrafish-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

11.5K Görüntüleme.  Weizmann Institute of Science. Multiphoton mikroskobu optik derin penetrasyon ve azaltılmış fototoksisite düşük enerjili fotonların kontrol sağlar. Biz zebrafish embriyolar canlı hücre etiketlenmesi için bu teknolojinin kullanımını anlatmayacağız. Bu protokol fotoğraf indüksiyonu için çeşitli ışık duyarlı moleküllerin kolayca adapte edilebilir.

Video: Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Zebra balığı Embriyolar mRNA ve morfolino Antisens Oligonükleotidler Mikroenjeksiyon.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Biyoloji

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Gen Fonksiyon Analiz Zebra balığı Embriyolar Mikroenjeksiyon

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

İki foton axotomy ve zaman atlamalı konfokal görüntüleme canlı zebrafish embriyolar

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

Transplantasyon Kimerik Zebra balığı Embriyolar Yaratma

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily accessible at all stages of development. Moreover, their optical clarity allows high resolution imaging of cell and molecular dynamics in the natural environment of the intact embryo. We are using a live imaging approach to analyze cell behaviors during neural crest cell migration and the outgrowth and guidance of neuronal axons.
Live imaging is particularly useful for understanding mechanisms that regulate cell motility processes. To visualize details of cell motility, such as protrusive activity and molecular dynamics, it is advantageous to label individual cells. In zebrafish, plasmid DNA injection yields a transient mosaic expression pattern and offers distinct benefits over other cell labeling methods. For example, transgenic lines often label entire cell populations and thus may obscure visualization of the fine protrusions (or changes in molecular distribution) in a single cell. In addition, injection of DNA at the one-cell stage is less invasive and more precise than dye injections at later stages.
Here we describe a method for labeling individual developing neurons or neural crest cells and imaging their behavior in vivo. We inject plasmid DNA into 1-cell stage embryos, which results in mosaic transgene expression. The vectors contain cell-specific promoters that drive expression of a gene of interest in a subset of sensory neurons or neural crest cells. We provide examples of cells labeled with membrane targeted GFP or with a biosensor probe that allows visualization of F-actin in living cells1.
Erica Andersen, Namrata Asuri, and Matthew Clay contributed equally to this work.

This protocol describes imaging of individual neurons or neural crest cells in living zebrafish embryos. This method is used to examine cellular behaviors and actin localization using fluorescence confocal time-lapse microscopy.

Zebra balığı Embriyolar Bireysel Nöronlar ve Sinir Crest Hücreler Aktin Sitoiskelet Hücre Motilite ve Canlı Görüntüleme

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their environment. Chimeric embryos, which are composed of cells of different genetic background, are great tools to study the cell-cell interactions mediated by genes of interest. The embryonic transparency of zebrafish at early developmental stages permits direct visualization of the morphogenesis of tissues and organs at the cellular level. Here, we demonstrate a protocol to generate chimeric retinas and brains in zebrafish embryos and to perform live imaging of the donor cells. The protocol covers the preparation of transplantation needles, the transplantation of GFP-expressing donor blastomeres to GFP-negative hosts, and the examination of donor cell behavior under live confocal microscopy. With slight modifications, this protocol can also be used to study the embryonic development of other tissues and organs in zebrafish. The advantages of using GFP to label donor cells are also discussed. 

We demonstrate a protocol to generate chimeric zebrafish embryos for live imaging cellular behavior during embryogenesis.

Transplantasyon GFP of-Kimerik Zebra balığı Embriyolar Retina ve Beyin Gelişimi Canlı Görüntüleme blastomer ifade

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Imaging Glycans in Zebrafish Embryos by Metabolic Labeling and Bioorthogonal Click Chemistry

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or alkyne-tagged monosaccharides1, 2. The modified monosaccharides, processed by the glycan biosynthetic machinery, are incorporated into cell surface glycoconjugates. The bioorthogonal azide or alkyne tags then allow covalent conjugation with fluorescent probes for visualization, or with affinity probes for enrichment and glycoproteomic analysis. This protocol describes the procedures typically used for noninvasive imaging of fucosylated glycans in zebrafish embryos, including: 1) microinjection of one-cell stage embryos with GDP-5-alkynylfucose (GDP-FucAl), 2) labeling fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos with azide-conjugated fluorophores via biocompatible Cu(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC), and 3) imaging by confocal microscopy3. The method described here can be readily extended to visualize other classes of glycans, e.g. glycans containing sialic acid4 and N-acetylgalactosamine5, 6, in developing zebrafish and in other living organisms.

A click-chemistry based method that allows for the rapid, noninvasive, and robust labeling of alkyne-tagged glycans in zebrafish embryos is described. Fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos in the late gastrulation stage were imaged in this study.

Metabolik Etiketleme ve Bioorthogonal tıklayın Kimya Zebra balığı Embriyolar Görüntüleme glukanlardır

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these relationships will help to understand the underlying etiology for a range of diseases linked with mitochondrial dysfunction, such as diabetes and obesity. Recent advances in instrumentation, has enabled the monitoring of distinct parameters of mitochondrial function in cell lines or tissue explants. Here we present a method for a rapid and sensitive analysis of mitochondrial function parameters in vivo during zebrafish embryonic development using the Seahorse bioscience XF 24 extracellular flux analyser. This protocol utilizes the Islet Capture microplates where a single embryo is placed in each well, allowing measurement of bioenergetics, including: (i) basal respiration; (ii) basal mitochondrial respiration (iii) mitochondrial respiration due to ATP turnover; (iv) mitochondrial uncoupled respiration or proton leak and (iv) maximum respiration. Using this approach embryonic zebrafish respiration parameters can be compared between wild type and genetically altered embryos (mutant, gene over-expression or gene knockdown) or those manipulated pharmacologically. It is anticipated that dissemination of this protocol will provide researchers with new tools to analyse the genetic basis of metabolic disorders in vivo in this relevant vertebrate animal model.

Zebrafish represent a powerful vertebrate model that has been under-utilised for metabolic studies. Here we describe a rapid way to measure the in vivo metabolic profile of developing zebrafish that allows the comparison of different mitochondrial function parameters between genetically or pharmacologically manipulated embryos, thereby increasing the applicability of this organism.

Zebra balığı Embriyolar Metabolik Profil Analizi

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes oxidation of molecules (lipid, DNA, protein) and leads to cell death. Oxidative stress also impacts the progression of several pathological conditions such as diabetes, retinopathies, neurodegeneration, and cancer. Thus, it is important to define tools to investigate oxidative stress conditions not only at the level of single cells but also in the context of whole organisms. Here, we consider the zebrafish embryo as a useful in vivo system to perform such studies and present a protocol to measure in vivo oxidative stress. Taking advantage of fluorescent ROS probes and zebrafish transgenic fluorescent lines, we develop two different methods to measure oxidative stress in vivo: i) a &#8220;whole embryo ROS-detection method&#8221; for qualitative measurement of oxidative stress and ii) a &#8220;single-cell&#160;ROS detection method&#8221; for quantitative measurements of oxidative stress. Herein, we demonstrate the efficacy of these procedures by increasing oxidative stress in tissues by oxidant agents and physiological or genetic methods. This protocol is amenable for forward genetic screens and it will help address cause-effect relationships of ROS in animal models of oxidative stress-related pathologies such as neurological disorders and cancer.

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.

Zebra balığı Embriyolar Oksidatif Stres Analizi

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are frequently used to identify chemicals that modulate gene expression. Chemical screens that assay fluorescence in live zebrafish often rely on expensive, specialized equipment for high content screening. We describe a procedure using a standard epifluorescence microscope with a motorized stage to automatically image zebrafish embryos and detect tissue-specific fluorescence. Using transgenic zebrafish that report estrogen receptor activity via expression of GFP, we developed a semi-automated procedure to screen for estrogen receptor ligands that activate the reporter in a tissue-specific manner. In this video we describe procedures for arraying zebrafish embryos at 24-48 hours post fertilization (hpf) in a 96-well plate and adding small molecules that bind estrogen receptors. At 72-96 hpf, images of each well from the entire plate are automatically collected and manually inspected for tissue-specific fluorescence. This protocol demonstrates the ability to detect estrogens that activate receptors in heart valves but not in liver.

Described here is a protocol for semi-automated imaging of tissue-specific fluorescence in zebrafish embryos.

Zebra balığı Embriyolar Doku spesifik Floresans yarı otomatik Görüntüleme

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...