Bu çalışma (TMD, JDL ve ATS) NIH / NINDS Grant R01NS070159 tarafından desteklenmiştir.

Tüm deneysel prosedürleri Laboratuar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için Sağlık Rehberi, Ulusal Enstitüleri ile sıkı göre yapılan ve gözden onaylanmış ve Gürcistan Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Üniversitesi tarafından denetlenecektir protokol # A2011 09-003, takip edildi Komite. 1.. Ekipman Kurulumu <ol><li> Kraniotomi için perfüzyon sistemi Yetişkin immobilizasyon balık çözünmüş oksijen sağlamak için entübasyon sistemi gerektirir. Sistemleri çeşitli kullanılabilir, ancak bir 60 ml şırınganın oluşan basit bir yerçekimi sistemi kullanılır. Sürekli ~ 1 ml / dk &#39;lık bir akış hızı veren bir yüksekliğe basınç başım yükseltmek. Bu, daha sonra şırınga elektrofizyolojik perfüzyon sistemine için kullanılan şırınga ile seri halde yerleştirilebilir. <ol><li> Tek bir 60 ml Luer lock şırınga tüpünü alın ve pistonu çıkarın. </li><li> Yaklaşık 8 ve en şırınga Askıda# 160; kelepçeyi kullanarak bir halka-stand tabanı yukarıda. </li><li> Şırınganın ucuna bir tek yollu valf bağlayın. Vana ters amaçla, entübasyon tabanına genişletmek için yeterince uzun olan bir boru parça, çapı 2 mm, bağlayın. </li></ol></li><li> Elektrofizyoloji için perfüzyon sistemi Elektrofizyolojik deneyler için, bir deney sırasında çeşitli bileşikler tanıtmak için çoğu zaman gereklidir. Çeşitli sistemler mevcuttur, ancak seri olarak 60 ml şırınga oluşan bir ağırlık sistemi kullanılabilir. Bu kurulum gelen musluğunu açarak yapılacak çözümler basit, seri giriş için izin verir. <ol><li> Iki veya daha fazla 60 ml Luer lock şırınga elde ve her gelen Plenserleri çıkarın. Bir sonraki her bir şırınga tüp Balıklara farmakolojik çeşitli bileşikler yönetmek için kullanılabilir iken Balıklara yaşam su verilmesi için gereklidir. </li><li> Bir 3&#39;e her şırınga bağlayın -şekilde bir Luer bağlantı nolu kesme vanasına. </li><li> Bir ucunda bir erkek Luer kilidi ile seri bağlamak için şırınga dış çap (OD) boru içinde ⅛ kullanın. </li><li> Basınçlı bir baz içinde 27 üzerinde bir yüksekliğe ya da sürekli ~ 1 ml / dk &#39;lık bir akış hızı veren bir yüksekliğe kadar yükseltilmiş şekildedir cihazı elde edin. </li></ol></li><li> Entübasyon kanül Entübasyon kanül balık sıvının giriş kolaylaştırır. Bu kurulum iyi konumda, hayvanın ağzı içinde kanül esneklik ve sertlik hem de sağlar. <ol><li> Makas her genel çiftini (örneğin. Fiskars) veya jilet kullanarak, bir P-200 pipet geniş ucundan 1,5 cm bölümü çıkarın. </li><li> Bir Tuohy Borst adaptörü örneğin bir dişi Luer kilit kap ve silikon yüksük ile bir indirgeme valf içine bir boru 6 cm x 1 mm parça yerleştirin ve modifiye edilmiş pipet içine bu kanül yerleştirin. Luer l pozisyonunda pipet tutunçaplı boru içinde ⅛ kısa bir kısmını kullanarak ock. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51065/51065fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51065/51065fig1.jpg" /> Şekil 1 </li></ol></li><li> Entübasyon baz Bu yemek stabil, dik bir konumda hareketsiz tutmak için hayvan ve entübasyon yoluyla hayvan giren sıvının çıkarılmasını kolaylaştırmak için kullanılır. Bu doğru bir şekilde kurulmuş ise, havuzlama elektrofizyolojik kayıt müdahaleci titreşim sinyalleri yol oluşabilir. <ol><li> Bir 100 mm x 15 mm plastik Petri çanağı taban çanak elde edilir. </li><li> Bir lehim aleti kullanarak, çanağın yan içine bir delik çapı 6 mm ve jantın dudak altında 7.5 mm, erime. Aynı aracı kullanarak, bir delik, 10 mm çapında ve çanak dudak altında 11 mm ~ 74 ° saat yönünün tersine eritebilir<html> küçük delik. Bu delik drenaj deliği olarak görev yapacak. </li><li> Bir tüp takın, ucu deliğin içine 1 cm çapında, uç bloke edilemez şekilde kaldırdı. Sonra küçük deliğe bir P-200 pipetteman ucu takın, bu bir kukla kanül olarak hizmet verecek. </li><li> Hafifçe daha büyük bir deliğin tarafında yükseltilmiş Petri kabı ile, kanül delik sadece kapalı olduğundan bu çanak içine erimiş mum konserve dökün. Bu bölge, kanül balığın ağzına ~ 3 mm eklenir sağlayan bir durak olarak hizmet edecektir. Bu set up katılaşmaya izin verilmelidir. </li><li> Alevle ısıtılan metal kenar kullanarak, kanal kanülün ucundan başlar ve yaklaşık olarak 1-2 inç uzanmaktadır, böylece balık tutmak için bir kanal bölmek <ol><li> Dikkat drenaj noktasına kanül alandan sürekli bir aşağıya doğru açı meydana olduğundan emin olmak için dikkat edilmelidir.065fig2.jpg &quot;width =&quot; 400px &quot;/&gt; Şekil 2, </li></ol></li></ol></li><li> Perfüzyon kurulum <ol><li> Başlamadan önce, tüm hava kabarcıkları bertaraf olmasını sağlamak, yaşam su ile perfüzyon set-up yıkayın. </li><li> Kraniotomi perfüzyon kurulum ~ 30 ml 0.016% &#39;si (630 iM) tricaine çözüm ekleyin ve ~ 2 ml bu tricaine perfüzyon başlaması üzerine hayvana teslim edilecektir sağlamak için boru üzerinden çalışmasına izin. Seyreltme için adım 2.2 bakınız. </li><li> Ana perfüzyon ayarlamak için, ilk tüpe yaşam su ~ 50 ml ekleyin. Kalan tüpler her biri için herhangi bir istenen deney bileşikleri ekleyin. </li><li> Entübasyon tabanının küçük deliğe kanül kurulum yerleştirin. </li><li> Sıkı bir sarmal içine 42 cm Kimwipe&#39;a geniş şerit bir 1 bükün ve Kimwipe&#39;dan iki ucuna uzanacak şekilde drenaj borusuna takın. Bu doku perfüze sıvının çıkması için bir fitil olarak hizmet edecek ve t içindeki sıvı oluşumunu önlemekO elektrofizyolojik kayıt müdahale olabilir ki, tabanı entübasyon. </li><li> Alt ucu tüm perfüzyon atıkları toplamak için yeterince büyük olan bir inert çanak içine uzanan sağlayan, Petri kabı büyük bir delik içine boru bir ucunu. Bu çanak kurulumu için çıkış rezervuar olarak görev yapacak. Bir ucu hayvanın karın bölgesine yakın uzanacaktır, böylece doku yerleştirin ve alt uzantısı çanak içine aktığından. </li><li> Mikroskop yakın bu tamamlanmış entübasyon tabanını yerleştirin. Tricaine perfüzyon tüpünün için kanül Luer kilidi bağlayın. </li></ol></li><li> Kılcal iğne ve elektrotlar <ol><li> Gümüş tel ve kurulumu şasiye aynı tel içinde 15 kadar yapılması gereken bir ikinci elektrot olarak 0,010 içinde 2.5 oluşan bir birinci elektrot elde edilir. İkinci elektrot için, uyum sağlar bir lehim ucu, gümüş tel 0,010 arasında bölümünde bir 15 kullanımıbir baş-sahnenin arkasında. <ol><li> Klorür iyonları ile de birinci ve ikinci gümüş tellerin uçlarını elektrolizle. </li><li> Bir mikropipet çektirmenin kullanarak, &lt;15 MQ dirence sahip ince duvarlı, borosilikat kılcal iğneyi çekin. <ol><li> 2-3 2 M potasyum klorür ul, ya da kısmen gümüş tel klorit kaplı ucu karşılamak için yeterli olan kılcal iğne doldurun. </li><li> Kılcal kafa içine birincil elektrodu takın ve elektrot tutucu monte. </li><li> Bir micromanipulator içine baş sahne montaj ve daha sonra ikinci bir micromanipulator içine ikincil elektrot montaj. Her elektrot kurulum, ilk pozisyonu ile ve daha sonra baş sahnenin arkasına ikincil elektrot lehimli uç takın. </li></ol></li></ol></li></ol></li></ol> 2. Çözümlerin hazırlanması, Perfüzyon Sistemi ve Elektrofizyolojik Kayıt Cihazları <ol><li> Habitat su 1 L edininbalık akvaryum dan. </li><li> 0.016% T] tricaine metansülfonat (tricaine) (630 uM, 50 ml) 24. <ol><li> % 0.4 Tris-tamponlu tricaine, pH değeri 7.2 olan bir kısım çözülme. </li><li> Habitat su 47.9 ml% 0.4 Tris tamponlu tricaine 2.1 ml ekleyin ve karıştırın. </li></ol></li><li> Istenen suda çözünür deneysel bileşiğin (örneğin 300 mM pentilentetrazol, ortak bir chemoconvulsant) stok konsantrasyonu çözülme. </li><li> Ringer çözeltisi içinde 1 mcg / ml panküronyum bromür bir kısım çözülme. </li><li> Anestezi ve habitat su ile deneysel entübasyon sistemlerini doldurun ve tüpler tüm kabarcıkları en azından yeterince boşaltın. Kabarcıklar hayvanın boğulma yol açan, sıvı akışını engellemek için bu yapılmalıdır. <ol><li> Tamamen bağlantı boru içine hava izin olmadan ilaç yapacak perfüzyon tüpleri boşaltın. </li><li> 0.016% (630 uM) tricaine çözelti ile anestezi tüpü doldurmak ve herhangi bir yer experDeneysel perfüzyon sistemine ilave borunun (ler) in imental bileşik (ler). <ol><li> Deneysel perfüzyon birinci tüp tek yaşam su içermelidir. </li></ol></li></ol></li><li> Boş bir 60 mm x 15 mm Petri kabındaki yaşam su ve yer ile küçük gözenek sünger nemlendirin. Anestezik enjekte edilir ise bu çanak balık tutmak için kullanılacaktır. </li></ol> 3. Kraniotomi <ol><li> O yol yaklaşık dörtte üçü doldurmak için 15 x 60 mm petri için 630 mcM tricaine çözümün yeterince ekleyin. Doldurulan çanak tartılır. Bundan başka anestezi periton içinden enjekte edilebilir, böylece bu hayvan immobilize etmek için kullanılacaktır. </li><li> Çanak içeren tricaine içine hayvan daldırın ve tekrar çanak tartın. <ol><li> Balıkların ağırlığının elde edilmesi için adım 1 ve 2 den ağırlıklar arasındaki fark çıkarın. </li><li> Hayvan sakin ve en hareket bitene kadar tricaine çözelti içinde kalmasını sağlar. </li></ol></li><li> Geniş bir çift forseps kullanarak, önceden nemlendirilmiş süngere balık transferi ve yanal konumlandırmak. Kuyruk tarafından balık aktarılması, bu süreç için iyi çalışır. <ol><li> Mikroskop altında sünger ve balık yerleştirin. </li></ol></li><li> Bir 34 G iğne içeren bir şırınga ile Nanofil, balık ağırlığının 1 ug / g olduğu şekilde, yeterli pankuronyum bromid ölçer. </li><li> Periton Nanofıl şırınga kullanarak pankuronyum bromür yönetmek, sabit tutmak için balık dorsal kenarı boyunca bir popsicle sopa kullanarak. </li><li> Ince forseps kullanarak, alt çenesi ile balık yakala ve hızlı entübasyon tabanına hayvan aktarın. </li><li> Bu mum formu ve 1 mm kanül ağzına sokulacak şekildedir on dorsal-up, böylece hayvan yerleştirin. Balık manevra ve kanül etrafında ağzını açmak için ince forseps kullanın. Nedeniyle entübasyon tepsinin makyaj, bir durdurma sağlar, taban içine yerleştirilebilir olankanül balık ağzına 3 mm sokulacak. <ol><li> Yerleştirildikten sonra, tricaine içeren yerçekimi beslemeli perfüzyon tüp açın. </li></ol></li><li> Kimqipe bir doku 3 cm 2 bölümünü kesmek ve habitat su ile ıslatın. <ol><li> Kurumasını önlemek için hayvan üzerinde doku yerleştirin. Kimwipe bölüm ayrıca, hayvan dorsal-up tutulmasına yardımcı olmak için konumlandırılabilir. </li></ol></li><li> Diseksiyon mikroskobu altında, optik TECTUM kapsayan kranial ~ 2 mm 2 bölümünü kaldırmak için vanna yaylı makas kullanın. Bu alan gözün arkasında oturur bir karanlık, kemikli tabak gibi görünüyor. <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51065/51065fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51065/51065fig3.jpg" width="400px" /> Şekil 3, <ol><li> Plakanın kenarında vanna makas bir bıçak yerleştirin ve geçirgenliğe karşı yeterli bir güçle itmebeyin piercing olmadan, kemik te. Kemik snip makas kapatın. </li><li> Kemik parçasını çıkarın. </li><li> Herhangi bir kan varsa, bir Kimwipe kenarını kullanarak kaldırın. Genellikle Kanama kısa kraniotomi yürüten sonra durur. </li></ol></li></ol> 4. Elektrofizyoloji <ol><li> Entübasyon stop-horoz kapatın ve hızlı tricaine damla için entübasyon tabanını bağlayan Luer kilit ayırın. <ol><li> Elektrofizyoloji mikroskop sağlam entübasyon kurulum Taşı ve perfüzyon sistemine bağlamak. </li><li> Yaşam su açın ve tricaine yıkayın amacıyla, yaklaşık 1 saat boyunca 1 ml / dk &#39;lık bir hızda serpmek. </li></ol></li><li> Elektrot ucu hayvanın burun içine ya da üst çene arkasında daldırma içine sokulabilir, böylece görsel kontrol altında bir mikromanipülatör kullanarak, ikinci elektrot yerleştirmek. </li><li> Kraniotomi ağzına birincil elektrot iğne takın. Takınuç optik TECTUM içinde oldukça yüzeysel bir konuma, bu durumda, doku içine iğne. <ol><li> Elektrod çok derin ise, elektrik sinyali küçük olabilir. </li></ol></li><li> Toplayın ve birincil ve ikincil referans elektrotlar arasında kaydedilen elektriksel farkı analiz. Bu işlem, elde edilecek hücre kayıtları için izin verir. <ol><li> 0.1 kHz düşük geçiş filtresi ve 1 Hz yüksek geçiş filtresi ile, 5 kHz örnekleme hızında Gap serbest modunda verileri toplayın. </li><li> Yaşam suyu 45 dakika bir az perfüze kadar elektrofizyolojik aktiviteyi kaydetmeye başlar etmeyin. </li><li> Önceki deneysel ilaçların eklenmesinden en az 15 dakika boyunca yerel aktivitesinin bir temel kaydedin. Zaman istenilen miktarda tercih ve kayıt deneysel ilaçlar ile perfüzyon başlayın. Sağlıklı preparasyonlarda, 2-3 saat boyunca, nörolojik etkinlik kaydetmek mümkündür. </li></ol></li></ol> 5. Temizlemek </p&gt; <ol><li> Deneyin sonunda, kafatası ve burun deliğinden elektrotlar ve entübasyon kurulum çıkarın. <ol><li> Amerikan Veteriner Hekimleri Birliği (AVMA) Hayvanların Ötenazi (2013) için rehber tarafından belirtildiği gibi, kabul edilen uygulamalara uygun tricaine kullanarak aşırı dozda ilaç ile hayvan Euthanize. </li><li> Ötenazi olmak Zebrafish 200-500 mg / l &#39;a tricaine çözelti yerleştirilmelidir Balıklar ölüm sağlanması için ötenazi (servikal transeksiyonu) bir fiziksel yollarla tabi tutulur ve bundan sonra ritmik operküler aktivite kesildikten sonra, 10 dakika içinde en az, için çözelti içinde kalan edilmelidir. </li></ol></li><li> Perfüzyon kurulum entübasyon tabanını bağlayan Luer kilidini çıkarın. Uygun bertarafı için perfüzyon sistemde kalan sıvıyı toplayın. <ol><li> Tüm tüpler aracılığıyla DI su çalıştırmak ve tehlikeli eğer, uygun bertarafı için toplamak. </li></ol></li><li> Perfüzyon sistemi dezenfekte etmek için, run% 70 etanol tüm tüpler aracılığıyla ve uygun bertarafı için toplamak. <ol><li> Hava kurutma kolaylaştırmak için açık konumda her bir tüp için stopcocks bırakın. </li><li> % 70 etanol içinde elektrotlar daldırın ve hava ile kurumasına izin verir. </li></ol></li><li> Kavuz kapta birincil elektrot için kullanılan kılcal iğne atmayın. </li><li> Entübasyon kurulum demontaj ve su ile tüm parçaları yıkayınız. <ol><li> % 70 etanol ile her parça temizleyin ve kurumaya bırakın. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Henze, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+features+predicted+by+extracellular+recordings+in+the+hippocampus+in+vivo.">Intracellular features predicted by extracellular recordings in the hippocampus in vivo.</a> J. Neurophysiol. 84, 390-400 (2000).</li><li>Gabriel, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locomotor+pattern+in+the+adult+zebrafish+spinal+cord+in+vitro.">Locomotor pattern in the adult zebrafish spinal cord in vitro.</a> J.Neurophysiol. 99, 37-48 (2008).</li><li>Vargas, R., Johannesdottir, I. T., Sigurgeirsson, B., Thornorsteinsson, H., Karlsson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+brain+in+research+and+teaching:+a+simple+in+vivo+and+in+vitro+model+for+the+study+of+spontaneous+neural+activity.">The zebrafish brain in research and teaching: a simple in vivo and in vitro model for the study of spontaneous neural activity.</a> Adv Physiol Educ. 35, 188-196 (2011).</li><li>Makhankov, Y. V., Rinner, O., Neuhauss, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inexpensive+device+for+non-invasive+electroretinography+in+small+aquatic+vertebrates.">An inexpensive device for non-invasive electroretinography in small aquatic vertebrates.</a> J. Neurosci. Methods. 135, 205-210 (2004).</li><li>Brockerhoff, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+behavioral+screen+for+isolating+zebrafish+mutants+with+visual+system+defects.">A behavioral screen for isolating zebrafish mutants with visual system defects.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.. 92, 10545-10549 (1995).</li><li>Baraban, S. C., Taylor, M. R., Castro, P. A., Baier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pentylenetetrazole+induced+changes+in+zebrafish+behavior,+neural+activity+and+c-fos+expression.">Pentylenetetrazole induced changes in zebrafish behavior, neural activity and c-fos expression.</a> Neuroscience. 131, 759-768 (2005).</li><li>Baraban, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large-scale+mutagenesis+screen+to+identify+seizure-resistant+zebrafish.">A large-scale mutagenesis screen to identify seizure-resistant zebrafish.</a> Epilepsia. 48, 1151-1157 (2007).</li><li>Maximino, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Serotonin and anxiety: Neuroanatomical, pharmacological and functional aspects. , (2012).</li><li>Bally-Cuif, L., Vernier, P., Perry, S. F., Ekker, M., Farrell, A. P., Brauner, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fish Physiology: Zebrafish. 29, (2010).</li><li>Kaslin, J., Nystedt, J. M., Ostergard, M., Peitsaro, N., Panula, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+orexin/hypocretin+system+in+zebrafish+is+connected+to+the+aminergic+and+cholinergic+systems.">The orexin/hypocretin system in zebrafish is connected to the aminergic and cholinergic systems.</a> J. Neurosci. 24, 2678-2689 (2004).</li><li>McLean, D. L., Fetcho, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ontogeny+and+innervation+patterns+of+dopaminergic,+noradrenergic,+and+serotonergic+neurons+in+larval+zebrafish.">Ontogeny and innervation patterns of dopaminergic, noradrenergic, and serotonergic neurons in larval zebrafish.</a> J. Comp. Neurol. 480, 38-56 (2004).</li><li>Mueller, T., Vernier, P., Wullimann, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adult+central+nervous+cholinergic+system+of+a+neurogenetic+model+animal,+the+zebrafish+Danio+rerio.">The adult central nervous cholinergic system of a neurogenetic model animal, the zebrafish Danio rerio.</a> Brain Res. 1011, 156-169 (2004).</li><li>Higashijima, S., Schaefer, M., Fetcho, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotransmitter+properties+of+spinal+interneurons+in+embryonic+and+larval+zebrafish.">Neurotransmitter properties of spinal interneurons in embryonic and larval zebrafish.</a> J. Comp. Neurol. 480, 19-37 (1002).</li><li>Tao, L., Lauderdale, J. D., Sornborger, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+Functional+Connectivity+between+Neuronal+Ensembles+with+Larval+Zebrafish+Transgenic+for+a+Ratiometric+Calcium+Indicator.">Mapping Functional Connectivity between Neuronal Ensembles with Larval Zebrafish Transgenic for a Ratiometric Calcium Indicator.</a> Front Neural Circuits. 5, 2 (2011).</li><li>Fan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+statistical+methods+enhance+imaging+of+cameleon+fluorescence+resonance+energy+transfer+in+cultured+zebrafish+spinal+neurons.">New statistical methods enhance imaging of cameleon fluorescence resonance energy transfer in cultured zebrafish spinal neurons.</a> J Biomed Opt. 12, 034017 (2007).</li><li>Burgess, H. A., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensorimotor+gating+in+larval+zebrafish.">Sensorimotor gating in larval zebrafish.</a> J. Neurosci. 27, 4984-4994 (2007).</li><li>Burgess, H. A., Schoch, H., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+retinal+pathways+drive+spatial+orientation+behaviors+in+zebrafish+navigation.">Distinct retinal pathways drive spatial orientation behaviors in zebrafish navigation.</a> Curr. Biol. 20, 381-386 (2010).</li><li>Mueller, K. P., Neuhauss, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+neurobiology:+how+larval+fish+orient+towards+the+light.">Behavioral neurobiology: how larval fish orient towards the light.</a> Curr. Biol. 20, 159-161 (2010).</li><li>Haug, M. F., Biehlmaier, O., Mueller, K. P., Neuhauss, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+acuity+in+larval+zebrafish:+behavior+and+histology.">Visual acuity in larval zebrafish: behavior and histology.</a> Front. Zool. 7, 8 (2010).</li><li>Fetcho, J. R., Higashijima, S., McLean, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+and+motor+control+over+the+last+decade.">Zebrafish and motor control over the last decade.</a> Brain Res.Rev. 57, 86-93 (2008).</li><li>Connaughton, V. P., Nelson, R., Bender, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+evidence+of+GABAA+and+GABAC+receptors+on+zebrafish+retinal+bipolar+cells.">Electrophysiological evidence of GABAA and GABAC receptors on zebrafish retinal bipolar cells.</a> Vis. Neurosci. 25, 139-153 (2008).</li><li>Kim, Y. J., Nam, R. H., Yoo, Y. M., Lee, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+functional+evidence+of+GABAergic+neurons+in+parts+of+the+brain+of+adult+zebrafish+(Danio+rerio).">Identification and functional evidence of GABAergic neurons in parts of the brain of adult zebrafish (Danio rerio).</a> Neurosci. Lett. 355, 29-32 (2004).</li><li>Sato, Y., Miyasaka, N., Yoshihara, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+regulation+of+odorant+receptor+gene+choice+and+subsequent+axonal+projection+of+olfactory+sensory+neurons+in+zebrafish.">Hierarchical regulation of odorant receptor gene choice and subsequent axonal projection of olfactory sensory neurons in zebrafish.</a> J. Neurosci. 27, 1606-1615 (2007).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio). , (1993).</li><li>Lazarova, M., Samanin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potentiation+by+yohimbine+of+pentylenetetrazol-induced+seizures+in+rats:+role+of+alpha+2+adrenergic+receptors.">Potentiation by yohimbine of pentylenetetrazol-induced seizures in rats: role of alpha 2 adrenergic receptors.</a> Pharmacol. Res. Commun. 15, 419-425 (1983).</li><li>Loscher, W., Honack, D., Fassbender, C. P., Nolting, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+technical,+biological+and+pharmacological+factors+in+the+laboratory+evaluation+of+anticonvulsant+drugs.+III.+Pentylenetetrazole+seizure+models.">The role of technical, biological and pharmacological factors in the laboratory evaluation of anticonvulsant drugs. III. Pentylenetetrazole seizure models.</a> Epilepsy res. 8, 171-189 (1991).</li><li>DeMicco, A., Cooper, K. R., Richardson, J. R., White, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+neurotoxicity+of+pyrethroid+insecticides+in+zebrafish+embryos.">Developmental neurotoxicity of pyrethroid insecticides in zebrafish embryos.</a> Toxicol Sci. 113, 177-186 (2010).</li><li>Arnolds, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+effects+of+tricaine+on+the+supramedullary/dorsal+neurons+of+the+cunner,+Tautogolabrus+adspersus.">Physiological effects of tricaine on the supramedullary/dorsal neurons of the cunner, Tautogolabrus adspersus.</a> Biol. Bull. 203, 188-189 (2002).</li></ol>

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Bu protokol, in vivo olarak yetişkin zebrabalıkları nöral aktivitesini ölçmek için kullanılmıştır. Kaydedilen etkinlik özellikleri (genlik ve etkinlikleri şekli), ayrı ayrı balıklar arasında değişebilir ama uygulama ile, sinir aktivitesi, sürekli olarak gözlemlenebilir. Dışı kayıt tekniğinin kullanılması bu gözlemi açıklayabilir. Yöntem, bir bölge içinde 1 hücreleri, çok sayıda eş zamanlı olarak izlenmesini sağlar, bu nedenle birinci elektrot konumlandırma var...

Bu makalede, bir protokol zebrabalıkları yetişkin nöral faaliyet vivo kayıtları elde etmek için tarif edilmektedir. Ekstrasellüler kayıt yöntemleri nöral doku küçük bir bölge içinde elektriksel aktivitenin gerilim ölçümleri sağlayan kullanılır. Soruşturma Bu yöntem, bir hayvanda davranıyor 1 hücrelerin çok sayıda izleme içerir. Daha önce, dilim kayıtları göz kupası hazırlıkları ve elektroretinogram kayıtları gibi, yetişkin ve larva hem de yapılmıştır. Bu deneyler büyük ölçüde çeşitli duyu sistemlerinin 2-5 fizyolojik tepkiler detay yapılmıştır. Yakın zamana kadar, sağlam beyin preparatlar sadece solunum ve oksijen difüzyon deri yoluyla oluşabilir zebra balığı larvası 3,6,7, elektrofizyoloji ile yerine getirilmesi için mevcut olmuştur. Bizim hazırlık hayvan o tamamen bilinçli ve farkında kalır bir yetişkin zebrafish yerli nörolojik etkinlik ölçülecek sağlarf çevresi. Zebra balığı (Br.rerio) şu anda, genetik toksikolojik, farmakolojik ve fizyopatolojik çalışmalar 3 için bir model olarak temel bir rol oynamaktadır. Onlar genetik, nöral ve endokrin seviyelerinde 8 memelilerin kapsamlı benzerliği paylaşmak çünkü Zebra nörobilim alanında görünürlük kazanmıştır. Geçtiğimiz on yıl içinde, standart nöroanatomik immünohistokimyasal teknikler ve zebra balığı sinir sistemi 9-12 arasında ve farklı nörotransmitterlerin 3,8,13 dağılımının ayrıntılı karakteristik organizasyon belirlemek için kullanılmıştır. Daha yakın zamanlarda, araştırmacılar davranışsal süreçler 16-19 ve duyu sistemlerinin 2,13,20 elektrofizyolojik özellikleri üzerine ortalamak birçoğu fonksiyonel çalışmalar 14,15, onların odak değiştirdi. Bu çalışmaların az sayıda Adul belirli alanların elektriksel aktivitesi üzerinde yoğunlaşmıştırzebra balığı beyin 21-23 t, ama in vivo yaklaşımı kullanılarak gerçekleştirilmiştir değildi. Bu protokol, spesifik beyin bölgelerinde aktivitesinin modellerini açıklamak için Zebrafish sinir sistemi içerisinde, hem kendiliğinden ve uyarılmış aktivite elektrofizyolojik çalışmaları için uyarlanabilir. Bu tekniğin kullanımı, karşılaştırmalar, genç larva ve yetişkinlerin nörolojik aktivitesi arasındaki yapılmasını sağlar. Bundan başka, protokol genetik ya da farmakolojik değişiklikler arasında karşılaştırmalar izin verir. Birlikte bu tür genetik mühendisliği veya farmakolojik testleri gibi diğer yaklaşımlar ile, bu yöntem, geç başlangıçlı, epilepsi ya da nörodejeneratif süreçler üzerinde çalışılması gibi olası uygulamalar için nöronal iletişim ve plastisite sağlam bir yetişkin hayvan hem de fonksiyonel analizi için yeni bir olanak sunmaktadır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="539">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:207px;">70% Ethanol</td>
			<td style="width:91px;">Decon Laboratories</td>
			<td style="width:111px;">2750HC</td>
			<td style="width:132px;">Dilute 100% to 70% with DI water</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:207px;">2 M Potassium Chloride</td>
			<td style="width:91px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:207px;">2 M Sodium Chloride</td>
			<td style="width:91px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:111px;">3624-05</td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:207px;">0.4% Tris-Buffered Tricaine</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">E10521</td>
			<td style="width:132px;">pH 7.2-7.4; stored at -20 oC</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:207px;">Pancuronium Bromide</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">P1918</td>
			<td style="width:132px;">Diluted to 1 &#956;g/&#956;l in 1x phosphate buffered saline</td>
		</tr>
		<tr height="127">
			<td height="127" style="height:127px;width:207px;">Habitat water</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:132px;">pH 7.0-7.4, conductivity of 400-450 &#956;S; maintained by Instant Ocean and Sodium Bicarbonate</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:207px;">Pentylenetetrazol</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">P6500</td>
			<td style="width:132px;">Diluted to 300 mM in 1x phosphate buffered saline</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:207px;">Nanofil syringe</td>
			<td style="width:91px;">World Precision Instruments, Inc.</td>
			<td style="width:111px;">06A</td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:207px;">34 G Beveled needle</td>
			<td style="width:91px;">World Precision Instruments, Inc.</td>
			<td style="width:111px;">NF34BV</td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:207px;">Sponge</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:132px;">Small pore and chemical-free</td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:207px;">Foam-backed fine sand paper</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:132px;">5 x 5 cm2 is large enough</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:207px;">9 V Battery</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:207px;">Wires with alligator clips</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:132px;">Need 2</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:207px;">37 cm x 42 cm Kimwipe</td>
			<td style="width:91px;">Kimberly-Clark Professional</td>
			<td style="width:111px;">TW31KEM</td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:207px;">11 cm x 21 cm Kimwipe</td>
			<td style="width:91px;">Kimberly-Clark Professional</td>
			<td style="width:111px;">TW31KWP</td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:207px;">1/8 in diameter tube</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:207px;">1 cm diameter tube</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:207px;">1 mm diameter tube</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:207px;">Reducing valve with female Luer lock cap and silicone ferrule</td>
			<td style="width:91px;">Qosina</td>
			<td style="width:111px;">51505</td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:207px;">Microscope (Leica MZ APO)</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:132px;">Another microscope can be used</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:207px;">Vanna scissors</td>
			<td style="width:91px;">Roboz Surgical Instruments Co., Inc.</td>
			<td style="width:111px;">15018-10</td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:207px;">60 ml Luer lock syringe tubes</td>
			<td style="width:91px;">Becton, Dickinson and Company</td>
			<td style="width:111px;">309653</td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:207px;">3-way Stopcocks with Luer connections</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:207px;">1-way Stopcock with Luer connection</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:207px;">Fisherbrand 100 mm x 15 mm Petri dish</td>
			<td style="width:91px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:111px;">NC9299146</td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:207px;">Fisherbrand 60 mm x 15 mm Petri dish</td>
			<td style="width:91px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:111px;">S67961</td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:207px;">4 in Borosilicate capillary tube</td>
			<td style="width:91px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:111px;">TW100F-4</td>
			<td style="width:132px;">Can contain a filament to aid in filling with solution</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:207px;">P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
			<td style="width:91px;">Sutter Instrument Co.</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:207px;">Digidata 1440</td>
			<td style="width:91px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:207px;">Axon Aloclamp 900A</td>
			<td style="width:91px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:207px;">Axoclamp software</td>
			<td style="width:91px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:207px;">HS-9Ax 1U headstage</td>
			<td style="width:91px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:207px;">0.010 in Silver wire</td>
			<td style="width:91px;">A-M Systems, Inc.</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:207px;">Q-series electrode holder</td>
			<td style="width:91px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:111px;">QSW-A10P</td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:207px;">10 ml Luer lock syringe</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:207px;">1 mm x 15 in Tubing</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:132px;">Connect Luer lock syringe to Q-series electrode holder</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:207px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:91px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:132px;">Need 2</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:207px;">Microsoft-based PC</td>
			<td style="width:91px;">Dell</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:207px;">Faraday Cage</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:207px;">Air Table</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Dissecting Microscope</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electrophysiological recording in the brain of intact adult zebrafish

Daha önce, erişkin zebrabalıkları elektrofizyolojik çalışmalar hazırlıklarını veya göz fincan hazırlıkları ve electrorentinogram kayıtları dilim sınırlı olmuştur. Bu çalışma, nöral faaliyet kayıt sağlayan, bir yetişkin zebra balığı, hareketsiz entübe ve in vivo elektrofizyolojik deneyler için nasıl kullanılabileceğini açıklar. Yetişkin immobilizasyonu yanaktan ve operküler hareketinin yerine solungaçları çözülmüş oksijen sağlamak için bir mekanizma gerekmektedir. Bu teknik ile, hayvanların hareketsiz ve bu şartı yerine getirmek için bir habitat su ile perfüze. Kranyotomi tricaine metansülfonat altında gerçekleştirilir (MS-222; tricaine) anestezi beyne erişimi sağlamak için. Birincil elektrod dışı beyin aktivitesini kaydetmek için kraniotomi penceresi içinde konumlandırılmış. Bir Multitube perfüzyon sisteminin kullanımı sayesinde, farmakolojik bileşikler, çeşitli nöral aktivitede yetişkin balık ve herhangi bir değişiklik için uygulanabilirgözlenebilir. Metodoloji nörolojik etkinlik değişiklikler ile ilgili yapılacak gözlemler sağlar değil, aynı karşılaştırmalar larva ve yetişkin zebrabalıkları arasında yapılacak için de izin verir. Bu araştırmacılara nedeniyle farklı yaşam evrelerinde çeşitli bileşiklerin tanıtımı nörolojik aktivite değişiklikleri tanımlamak için yeteneği verir.

Bu protokol, in vivo olarak yetişkin zebrabalıkları nöral aktivitesini ölçmek için kullanılmıştır. Bu elektrofizyolojik tutarlı ve tekrarlanabilir elde edilir. Pentilentetrazol (PTZ), ortak bir chemoconvulsant 6,7,25,26, entübasyon içeri getirildiği zaman, Şekil 5, bir yetişkin zebrabalıkları nöral faaliyet yerli ve bağlı değişikliklerin bir temsili örneğini göstermektedir Kur. Yetişkin zebrafish yerli, nörolojik etkinlik, her...

Watch this Scientific Journal Video about Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish at JoVE.com

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Bu çalışma, bir yetişkin zebra balığı, hareketsiz entübe ve kayıtları ve bozulmamış bir hayvanda nöral faaliyet işleme izin vermek için in vivo elektrofizyolojik deneyler için nasıl kullanılabileceğini açıklar.

Sağlam Yetişkin Zebra balığı Beyin Elektrofizyolojik Kayıt

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

electrophysiological-recording-in-the-brain-of-intact-adult-zebrafish

Research

JoVE Journal

Neuroscience

21.3K Görüntüleme.  University of Georgia.  Bu çalışma, bir yetişkin zebra balığı, hareketsiz entübe ve kayıtları ve bozulmamış bir hayvanda nöral faaliyet işleme izin vermek için in vivo elektrofizyolojik deneyler için nasıl kullanılabileceğini açıklar. 

Video: Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Electrophysiological Characterization of GFP-Expressing Cell Populations in the Intact Retina

Studying the physiological properties and synaptic connections of specific neurons in the intact tissue is a challenge for those cells that lack conspicuous morphological features or show a low population density. This applies particularly to retinal amacrine cells, an exceptionally multiform class of interneurons that comprise roughly 30 subtypes in mammals1. Though being a crucial part of the visual processing by shaping the retinal output2, most of these subtypes have not been studied up to now in a functional context because encountering these cells with a recording electrode is a rare event.
Recently, a multitude of transgenic mouse lines is available that express fluorescent markers like green fluorescent protein (GFP) under the control of promoters for membrane receptors or enzymes that are specific to only a subset of neurons in a given tissue3,4. These pre-labeled cells are therefore accessible to directed microelectrode targeting under microscopic control, permitting the systematic study of their physiological properties in situ. However, excitation of fluorescent markers is accompanied by the risk of phototoxicity for the living tissue. In the retina, this approach is additionally hampered by the problem that excitation light causes appropriate stimulation of the photoreceptors, thus inflicting photopigment bleaching and transferring the retinal circuits into a light-adapted condition. These drawbacks are overcome by using infrared excitation delivered by a mode-locked laser in short pulses of the femtosecond range. Two-photon excitation provides energy sufficient for fluorophore excitation and at the same time restricts the excitation to a small tissue volume minimizing the hazards of photodamage5. Also, it leaves the retina responsive to visual stimuli since infrared light (&gt;850 nm) is only poorly absorbed by photopigments6.
In this article we demonstrate the use of a transgenic mouse retina to attain electrophysiological in situ recordings from GFP-expressing cells that are visually targeted by two-photon excitation. The retina is prepared and maintained in darkness and can be subjected to optical stimuli which are projected through the condenser of the microscope (Figure 1). Patch-clamp recording of light responses can be combined with dye filling to reveal the morphology and to check for gap junction-mediated dye coupling to neighboring cells, so that the target cell can by studied on different experimental levels.

This article depicts the recording of individual cells from fluorescently tagged neuronal populations in the intact mouse retina. By using two-photon infrared excitation transgenetically labeled cells were targeted for patch-clamp recording to study their light responses, receptive field properties, and morphology.

Bozulmamış Retina Elektrofizyolojik Karakterizasyonu GFP-ifade eden hücre popülasyonlarının

Studying the physiological properties and synaptic connections of specific neurons in the intact tissue is a challenge for those cells that lack ...

Nörobilim

Forebrain Electrophysiological Recording in Larval Zebrafish

Epilepsy affects nearly 3 million people in the United States and up to 50 million people worldwide. Defined as the occurrence of spontaneous unprovoked seizures, epilepsy can be acquired as a result of an insult to the brain or a genetic mutation. Efforts to model seizures in animals have primarily utilized acquired insults (convulsant drugs, stimulation or brain injury) and genetic manipulations (antisense knockdown, homologous recombination or transgenesis) in rodents. Zebrafish are a vertebrate model system1-3 that could provide a valuable alternative to rodent-based epilepsy research. Zebrafish are used extensively in the study of vertebrate genetics or development, exhibit a high degree of genetic similarity to mammals and express homologs for ~85% of known human single-gene epilepsy mutations. Because of their small size (4-6 mm in length), zebrafish larvae can be maintained in fluid volumes as low as 100 &mu;l during early development and arrayed in multi-well plates. Reagents can be added directly to the solution in which embryos develop, simplifying drug administration and enabling rapid in vivo screening of test compounds4. Synthetic oligonucleotides (morpholinos), mutagenesis, zinc finger nuclease and transgenic approaches can be used to rapidly generate gene knockdown or mutation in zebrafish5-7. These properties afford zebrafish studies an unprecedented statistical power analysis advantage over rodents in the study of neurological disorders such as epilepsy. Because the "gold standard" for epilepsy research is to monitor and analyze the abnormal electrical discharges that originate in a central brain structure (i.e., seizures), a method to efficiently record brain activity in larval zebrafish is described here. This method is an adaptation of conventional extracellular recording techniques and allows for stable long-term monitoring of brain activity in intact zebrafish larvae. Sample recordings are shown for acute seizures induced by bath application of convulsant drugs and spontaneous seizures recorded in a genetically modified fish.

A simple method to record extracellular field potentials in the larval zebrafish forebrain is described. The method provides a robust in vivo read-out of seizure-like activity. This technique can be used with genetically modified zebrafish larvae carrying epilepsy-related genes or seizures evoked by administration of convulsant drugs.

Larva Zebra balığı olarak önbeyin Elektrofizyolojik Kaydı

Epilepsy affects nearly 3 million people in the United States and up to 50 million people worldwide. Defined as the occurrence of spontaneous unprovoked ...

Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be performed in an intact brain preparation where the neural circuitry of the CNS remains intact. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with green fluorescent protein for identification in the intact brain. Fish have multiple populations of GnRH neurons, and their functions are dependent on their location in the brain and the GnRH gene that they express1 . We have focused our demonstration on GnRH3 neurons located in the terminal nerves (TN) associated with the olfactory bulbs using the intact brain of transgenic medaka fish (Figure 1B and C). Studies suggest that medaka TN-GnRH3 neurons are neuromodulatory, acting as a transmitter of information from the external environment to the central nervous system; they do not play a direct role in regulating pituitary-gonadal functions, as do the well-known hypothalamic GnRH1 neurons2, 3 .The tonic pattern of spontaneous action potential firing of TN-GnRH3 neurons is an intrinsic property4-6, the frequency of which is modulated by visual cues from conspecifics2 and the neuropeptide kisspeptin 15. In this video, we use a stable line of transgenic medaka in which TN-GnRH3 neurons express a transgene containing the promoter region of Gnrh3 linked to enhanced green fluorescent protein7 to show you how to identify neurons and monitor their electrical activity in the whole brain preparation6.

In this video, we will demonstrate how to record electrical activity from identified single neurons in a whole brain preparation, which preserves complex neural circuits. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with a fluorescent protein for identification in the intact brain preparation.

Transgenik Balık Sağlam Beyin Tespit Edilen nöronlar Elektrik Aktivitesi Kayıt

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be ...

Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides

Manipulation of gene expression in tissues is required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the cerebroventricular microinjection (CVMI) technique as a means to modulate gene expression in the adult zebrafish brain. By using CVMI, substances can be administered into the cerebroventricular fluid and be thoroughly distributed along the rostrocaudal axis of the brain. We particularly focus on the use of antisense morpholino oligonucleotides, which are potent tools for knocking down gene expression in vivo. In our method, when applied, morpholino molecules are taken up by the cells lining the ventricular surface. These cells include the radial glial cells, which act as neurogenic progenitors. Therefore, knocking down gene expression in the radial glial cells is of utmost importance to analyze the widespread neurogenesis response in zebrafish, and also would provide insight into how vertebrates could sustain adult neurogenesis response. Such an understanding would also help the efforts for clinical applications in human neurodegenerative disorders and central nervous system regeneration. Thus, we present the cerebroventricular microinjection method as a quick and efficient way to alter gene expression and neurogenesis response in the adult zebrafish forebrain. We also provide troubleshooting tips and other useful information on how to carry out the CVMI procedure.

In this article, we demonstrate a method for manipulation of gene expression in the ventricular cells of the adult zebrafish telencephalon using antisense morpholino oligonucleotides. We present this method as an efficient and quick protocol that can be used for functional studies in the adult vertebrate brain.

Morfolino Oligonükleotidler bir Cerebroventricular Mikroenjeksiyon kullanarak Yetişkin Zebra balığı Beyin Gen İfade Mikromanipülasyon

Manipulation of gene expression in tissues is  required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the  cerebroventricular ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Micro-injections of Inhibitory Agents in the Rodent Brain

Here we describe a method for the construction of a single-use &#8220;injectrode&#8221; using commercially accessible and affordable parts. A probing system was developed that allows for the injection of a drug while recording electrophysiological signals from the affected neuronal population. This method provides a simple and economical alternative to commercial solutions. A glass pipette was modified by combining it with a hypodermic needle and a silver filament. The injectrode is attached to commercial microsyringe pump for drug delivery. This results in a technique that provides real-time pharmacodynamics feedback through multi-unit extracellular signals originating from the site of drug delivery. As a proof of concept, we recorded neuronal activity from the superior colliculus elicited by flashes of light in rats, concomitantly with delivery of drugs through the injectrode. The injectrode recording capacity permits the functional characterization of the injection site favoring precise control over the localization of drug delivery. Application of this method also extends far beyond what is demonstrated here, as the choice of chemical substance loaded into the injectrode is vast, including tracing markers for anatomic experiments.

Here, we craft a glass pipette with dual functions: inhibition of deep brain structures by microinjections of drugs and real-time monitoring of their effects through simultaneous electrophysiological recordings.

Eşzamanlı Elektrofizyolojik Kayıt ve kemirgen Beyindeki inhibitör Ajanların Mikro-enjeksiyon

Here we describe a method for the construction of a single-use &#8220;injectrode&#8221; using commercially accessible and affordable parts. A probing ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful analysis of synaptic transmission modulation when performing field potential or intracellular recordings. This manuscript describes methodological aspects that might be helpful in improving experimental conditions for the maintenance of acute brain slices and for recording field excitatory postsynaptic potentials in a commercially available submersion chamber with an outflow-carbogenation unit. The outflow-carbogenation helps to stabilize the oxygen level in experiments that rely on the recycling of a small buffer reservoir to enhance the cost-efficiency of drug experiments. In addition, the manuscript presents representative experiments that examine the effects of different carbogenation modes and stimulation paradigms on the activity-dependent synaptic plasticity of synaptic transmission.

This protocol describes the stabilization of the oxygen level in a small volume of recycled buffer and methodological aspects of recording activity-dependent synaptic plasticity in submerged acute hippocampal slices.

Sinaptik plastisite akut Hipokampal dilimleri bir küçük hacimli geri dönüşüm-, perfüzyon- ve batma-tipi oda sistemi içinde tutulan kayıt

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Modeling Amyloid-&#946;42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to synaptic degeneration, inflammation, neuronal death, and learning deficits. Humans cannot regenerate lost neurons in the case of AD in part due to impaired proliferative capacity of the neural stem/progenitor cells (NSPCs) and reduced neurogenesis. Therefore, efficient regenerative therapies should also enhance the proliferation and neurogenic capacity of NSPCs. Zebrafish (Danio rerio) is a regenerative organism, and we can learn the basic molecular programs with which we could design therapeutic approaches to tackle AD. For this reason, the generation of an AD-like model in zebrafish was necessary. Using our methodology, we can introduce synthetic derivatives of A&#946;42 peptide with tissue penetrating capability into the adult zebrafish brain, and analyze the disease pathology and the regenerative response. The advantage over the existing methods or animal models is that zebrafish can teach us how a vertebrate brain can naturally regenerate, and thus help us to treat human neurodegenerative diseases better by targeting endogenous NSPCs. Therefore, the amyloid-toxicity model established in the adult zebrafish brain may open new avenues for research in the field of neuroscience and clinical medicine. Additionally, the simple execution of this method allows for cost-effective and efficient experimental assessment. This manuscript describes the synthesis and injection of A&#946;42 peptides into zebrafish brain.

Modeling Amyloid-&amp;#946;42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

This protocol describes the synthesis, characterization, and injection of monomeric amyloid-&#946;42 peptides for generating amyloid toxicity in adult zebrafish to establish an Alzheimer&#39;s disease model, followed by histological analyses and detection of aggregations.

Amiloid β42 toksisite ve ateş yetişkin Zebra balığı beyinde modelleme

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to ...

Wireless Electrophysiological Recording of Neurons by Movable Tetrodes in Freely Swimming Fish

The neural mechanisms governing fish behavior remain mostly unknown, although fish constitute the majority of all vertebrates. The ability to record brain activity from freely moving fish would advance research on the neural basis of fish behavior considerably. Moreover, precise control of the recording location in the brain is critical to studying coordinated neural activity across regions in fish brain. Here, we present a technique that records wirelessly from the brain of freely swimming fish while controlling for the depth of the recording location. The system is based on a neural logger associated with a novel water-compatible implant that can adjust the recording location by microdrive-controlled tetrodes. The capabilities of the system are illustrated through recordings from the telencephalon of goldfish.

A novel wireless technique for recording extracellular neural signals from the brain of freely swimming goldfish is presented. The recording device is composed of two tetrodes, a microdrive, a neural data logger, and a waterproof case. All parts are custom-made except for the data logger and its connector.

Serbest Yüzme Balık hareketli Tetrodes tarafından Nöronların Kablosuz Elektrofizyolojik Kayıt

The neural mechanisms governing fish behavior remain mostly unknown, although fish constitute the majority of all vertebrates. The ability to record brain ...

A Scalable Model to Study the Effects of Blunt-Force Injury in Adult Zebrafish

Blunt-force traumatic brain injuries (TBI) are the most common form of head trauma, which spans a range of severities and results in complex and heterogenous secondary effects. While there is no mechanism to replace or regenerate the lost neurons following a TBI in humans, zebrafish possess the ability to regenerate neurons throughout their body, including the brain. To examine the breadth of pathologies exhibited in zebrafish following a blunt-force TBI and to study the mechanisms underlying the subsequent neuronal regenerative response, we modified the commonly used rodent Marmarou weight drop for the use in adult zebrafish. Our simple blunt-force TBI model is scalable, inducing a mild, moderate, or severe TBI, and recapitulates many of the phenotypes observed following human TBI, such as contact- and post-traumatic seizures, edema, subdural and intracerebral hematomas, and cognitive impairments, each displayed in an injury severity-dependent manner. TBI sequelae, which begin to appear within minutes of the injury, subside and return to near undamaged control levels within 7 days post-injury. The regenerative process begins as early as 48 hours post-injury (hpi), with the peak cell proliferation observed by 60 hpi. Thus, our zebrafish blunt-force TBI model produces characteristic primary and secondary injury TBI pathologies similar to human TBI, which allows for investigating disease onset and progression, along with the mechanisms of neuronal regeneration that is unique to zebrafish.

We modified the Marmarou weight drop model for adult zebrafish to examine a breadth of pathologies following blunt-force traumatic brain injury (TBI) and the mechanisms underlying subsequent neuronal regeneration. This blunt-force TBI model is scalable, induces a mild, moderate, or severe TBI, and recapitulates injury heterogeneity observed in human TBI.

Yetişkin Zebra Balıklarında Künt Kuvvet Yaralanmasının Etkilerini Incelemek İçin Ölçeklenebilir Bir Model

Blunt-force traumatic brain injuries (TBI) are the most common form of head trauma, which spans a range of severities and results in complex and ...

Deep-Tissue Three-Photon Fluorescence Microscopy in Intact Mouse and Zebrafish Brain

Multiphoton microscopy techniques, such as two-photon microscopy (2PM) and three-photon microscopy (3PM), are powerful tools for deep-tissue in vivo imaging with subcellular resolution. 3PM has two major advantages for deep-tissue imaging over 2PM that has been widely used in biology laboratories: (i) longer attenuation length in scattering tissues by employing ~1,300 nm or ~1,700 nm excitation laser; (ii) less background fluorescence generation due to higher-order nonlinear excitation. As a result, 3PM allows high-contrast structural and functional imaging deep within scattering tissues such as intact mouse brain from the cortical layers to the hippocampus and the entire forebrain of adult zebrafish.
Today, laser sources suitable for 3PM are commercially available, enabling the conversion of an existing two-photon (2P) imaging system to a three-photon (3P) system. Additionally, multiple commercial 3P microscopes are available, which makes this technique readily available to biology research laboratories. This paper shows the optimization of a typical 3PM setup, particularly targeting biology groups that already have a 2P setup, and demonstrates intravital 3D imaging in intact mouse and adult zebrafish brains. This protocol covers the full experimental procedure of 3P imaging, including microscope alignment, prechirping of ~1,300 and ~1,700 nm laser pulses, animal preparation, and intravital 3P fluorescence imaging deep in adult zebrafish and mouse brains.

Three-photon microscopy enables high-contrast fluorescence imaging deep in living biological tissues, such as mouse and zebrafish brains, with high spatiotemporal resolution.

Sağlam Fare ve Zebra Balığı Beyinde Derin Doku Üç Fotonlu Floresan Mikroskopisi

Multiphoton microscopy techniques, such as two-photon microscopy (2PM) and three-photon microscopy (3PM), are powerful tools for deep-tissue in vivo ...