이 연구는 분자생물학 연구소(Institute of Molecular Biology), 아카데미아 시니카(Academia Sinica), 대만 국가과학기술위원회(National Science and Technology Council)의 지원을 받았습니다. Institute of Physics, Academia Sinica의 Machine Shop은 맞춤형 설계 부품을 제작하는 데 도움을 주었습니다. 또한 헤드 스테이지의 퀵 락 메커니즘을 설계해 준 P. Argast (Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research, Basel, Switzerland)에게도 감사의 뜻을 전합니다.

모든 동물 시술은 Academia Sinica의 Institutional Animal Care and Use Committee의 지침에 따라 승인되고 수행되었습니다. 연구 도구에 대한 자세한 내용은 재료 표에서 확인할 수 있습니다.
1. 기록실의 준비
<ol><li>반 육각형 탱크, 베이스 플레이트 및 헤드 스테이지를 준비합니다(그림 1A; 보충 파일 1-3). 헤드 스테이지는 원형 플레이트에 부착된 두 개의 금속 기둥으로 구성됩니다. 원형 플레이트에는 베이스 플레이트에 잠글 수 있는 홈이 있습니다. 함께 잠긴 후 헤드 스테이지와 베이스 플레이트는 반 육각형 탱크의 바닥에 놓입니다.</li>
	<li>반육각형 탱크를 현미경의 실험 플랫폼에 놓습니다. 플랫폼은 변환 단계의 한계에 도달하지 않고 X 및 Y 방향으로 이동할 수 있어야 합니다.</li>
	<li>810nm 적외선(IR)과 카메라를 헤드 스테이지로 향하게 하여 동작을 기록합니다. 카메라의 시야가 성인 제브라피쉬가 들어갈 수 있을 만큼 충분히 큰지 확인하십시오.<ol><li>이광자 레이저와 시각 자극이 행동 기록을 방해하지 않도록 카메라 앞에 각각 875nm 단거리 통과 필터와 700nm 장역 통과 필터를 설정합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>시각적 자극을 표현하려면 반 육각형 탱크의 세 벽 안쪽에 백 프로젝션 필름을 부착합니다(그림 1A).</li>
	<li>세 개의 프로젝터를 탱크의 세 표면에 조준합니다. 세 개의 이미지는 연속적인 시각적 장면을 형성하도록 정렬되어야 합니다. 프로젝터 조명이 칼슘 형광 신호를 오염시키는 것을 방지하려면 각 프로젝터 앞에 중성 밀도 필터와 적색 컬러 필터(600nm, 롱패스)를 배치하고 광전자 증배관(PMT) 앞에 대역 통과 필터(510/80nm)를 배치합니다.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65526/65526fig1v8.jpg"> 그림 1: 머리 지지대 수술에 필요한 기구. (A) 헤드 스테이지의 원형 플레이트와 반 육각형 탱크 내부의 베이스 플레이트 사이의 빠른 잠금 메커니즘. 맞춤형 부품의 CAD(Computer-Aided Design) 파일은 보충 파일 1-4에서 찾을 수 있습니다. (B) 헤드레스트를 위한 Ω형 헤드 바. (C) 헤드 바를 부착 부위에 배치하는 데 사용되는 3축 미세 조작기. 삽입 사진: 점토에서 헤드 바의 방향. (D) 수술 중 물고기를 잡기 위한 대포. 삽입 사진: 대포 안에 있는 물고기의 방향. (E) 물고기 로딩 모듈 및 물고기를 헤드 스테이지에 로드하는 데 사용되는 마이크로 매니퓰레이터. 삽입 사진: 모듈 내 물고기의 방향입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65526/65526fig1v8large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
2. 머리구속 수술
<ol><li>Ω자형 헤드 바를 준비합니다(그림 1B; 보충 파일 4) 제브라피시 헤드레스트용. 이렇게 하려면 유성 모델링 점토 조각을 3축 마이크로 매니퓰레이터에 부착합니다. 점토가 헤드 바를 고정할 수 있을 만큼 단단하지만 헤드레스트 후 헤드 바에서 분리될 수 있을 만큼 부드러운지 확인하십시오.</li>
	<li>헤드 바의 암을 점토에 삽입하고 헤드 바를 수평으로 향하게 합니다(그림 1C). 이렇게 하면 나중에 제브라피쉬에 헤드 바를 부착할 때 수평이 됩니다. 참고: 헤드 바는 티타늄(24mg) 또는 스테인리스강(43mg)으로 만들 수 있으며 여러 실험에 재사용할 수 있습니다. 헤드 바 재질은 헤드레스트 하에서 성인 제브라피시(체중 범위 300-1,000mg)의 행동에 영향을 미치지 않습니다.</li>
	<li>수술 중에 물고기 몸체를 제자리에 고정하기 위한 속이 빈 튜브인 대포를 준비합니다(그림 1D).</li>
	<li>어항 물에 0.03% 및 0.01% 트리카인 메탄설포네이트(TMS, 재료 표 참조)를 준비합니다. 이것은 수술 중 물고기를 마취하고 진정 상태로 유지하는 데 사용됩니다.</li>
	<li>두개골의 부착 부위에서 과도한 피부와 물을 제거하기 위해 4개의 조직 면봉을 준비합니다. 각 면봉을 준비하려면 종이 타월을 3cm 정사각형으로 자르고 대각선을 따라 접어 튜브 모양의 구조를 만듭니다. 튜브의 끝을 미세한 지점으로 비틀십시오. 부착 부위가 매우 작기 때문에 미세한 포인트로 면봉을 더 세밀하게 제어할 수 있습니다.</li>
	<li>마이크로 매니퓰레이터를 위한 물고기 로딩 모듈을 준비합니다(그림 1E). 알림: 모듈은 직각 포스트 cl로 함께 고정된 두 개의 강철 기둥으로 구성됩니다.amp. 하나의 포스트는 마이크로 매니퓰레이터에 부착되고 다른 포스트는 물고기를 운반하는 회전 포스트 클램프를 고정합니다. 모듈은 물고기를 헤드 스테이지에 배치하는 데 사용됩니다.tage 미세 제어로. 회전 포스트 클램프는 물고기의 피치 각도를 변경하는 피치 조절기 역할을 합니다.</li>
	<li>어항 물에서 0.03% TMS로 물고기를 마취합니다. 다음 단계에서 주사기를 사용하여 어항 물에 있는 0.01% TMS를 90초마다 짧은 펄스로 입으로 전달합니다. 관류에서 나오는 물의 흐름은 아가미 움직임을 유도해야 합니다. 이렇게 하면 수술 중 물고기가 40분 이상 생존할 수 있습니다. 참고: Tg[neuroD:GCaMP6f]는 유충 단계와 성충 단계 모두에서 전뇌의 칼슘 지표가 광범위하게 발현되기 때문에 사용됩니다(10). 알림: 선택적으로 중력 관류를 사용하여 양손을 사용하는 수술 기간 동안 입으로 일정한 물 흐름을 제공합니다.</li>
	<li>대포 안에 물고기를 담는 캡슐(그림 2A)에 물고기를 감쌉니다.<ol><li>마취된 물고기를 꼬리 끝에서 꼬리부터 아가미까지 약 1mm의 축축한 종이 티슈로 감쌉니다. 생선이 조직 밖으로 미끄러지지 않도록 포장이 단단히 되어 있는지 확인하십시오.</li>
		<li>세로 슬릿이 있는 부드러운 플라스틱 튜브(예: 중간 크기의 열수축 튜브를 잘라 열림)를 종이 티슈 주위에 감아 꼬리 끝에서 꼬리에서 아가미까지 약 2mm까지 물고기를 덮습니다. 튜브는 수술 내내 물고기의 몸이 똑바로 유지되도록 합니다.</li>
		<li>종이 타월로 튜브를 대포의 직경과 거의 비슷한 직경으로 감습니다.</li>
		<li>플라스틱 전사 피펫의 전구에서 잘라낸 부드러운 플라스틱 튜브를 종이 타월 주위에 감습니다. 이렇게 하면 캡슐을 대포에 원활하게 장전할 수 있습니다.</li>
		<li>대포에 물고기를 장전하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>메스를 사용하여 부착 부위를 덮고 있는 피부, 즉 소뇌와 아가미 위쪽에 있는 두개골의 두 삼각형 부위를 덮고 있는 피부를 제거한 다음(그림 2B) 부착 부위 사이의 영역을 덮고 있는 피부를 제거합니다. 티슈 면봉을 사용하여 부착 부위를 건조시키고 남아 있는 피부를 제거합니다.<ol><li>피부를 제거하는 동안 조절 가능한 플랫폼을 사용하여 머리를 지지하되 수술 중 눈 부상을 방지하기 위해 플랫폼이 눈에 닿지 않아야 합니다. 참고: 부착 부위의 피부를 철저히 제거하는 것은 이미징 중 모션 아티팩트를 줄이는 데 매우 중요합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>10μL 피펫 팁을 사용하여 각 부착 부위의 중앙에 티슈 접착제 한 방울( 재료 표 참조)을 바릅니다. 알림: 티슈 접착제는 부착 부위를 덮고 빠르게 건조됩니다. 조직 접착제는 두개골과 헤드 바를 접착하는 데 사용되는 치과용 시멘트 사이의 결합 인터페이스를 제공하고 아가미의 물이 부착 부위에 도달하는 것을 방지합니다.</li>
	<li>물고기 몸체를 똑바로 세우고 헤드 바를 접착할 준비를 위해 헤드 바를 약간 위로 배치하고 부착 부위에 꼬리를 놓습니다.</li>
	<li>치과용 시멘트( 재료 표 참조)를 준비하고 즉시 사용하여 헤드 바를 두개골에 붙입니다(그림 2C). 절차는 시간에 민감하며 45초 이내에 완료해야 합니다.<ol><li>폴리머 1 작은 스푼과 퀵 모노머 4 방울 및 촉매 V 1 방울을 혼합하여 혼합물을 15 초 동안 고르게 저어줍니다.</li>
		<li>마이크로피펫과 10μL 피펫 팁을 사용하여 혼합물을 부착 부위와 부위 사이 부위에 도포합니다. 아가미와 눈을 가리지 마십시오.</li>
		<li>마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 헤드 바를 시멘트에 부드럽게 누릅니다. 남은 시멘트로 헤드 바를 덮습니다.</li>
		<li>치과용 시멘트가 경화될 때까지 12분 동안 기다리십시오. 시멘트에 물이 닿지 않도록 하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>칼슘 이미징을 위해 전뇌에 대한 광학적 접근을 개선하려면 텔레팔론 위의 피부를 제거합니다. 피부 제거는 메스를 사용하여 5번의 절단으로 3분 안에 완료할 수 있습니다(그림 2D). 두개골 표면에 부착된 지질 방울이 제거되었는지 확인하십시오.</li>
	<li>경화 후 헤드 바에서 점토를 제거합니다.</li>
	<li>전체 캡슐을 대포에서 마이크로 매니퓰레이터의 물고기 로딩 모듈에 있는 피치 조절기로 옮깁니다.</li>
	<li>마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 물고기의 위치를 지정합니다. 헤드 바는 헤드 스테이지의 금속 기둥 위에 위치해야 합니다. 물고기의 피치 각도를 약간 높여 이광자 이미징 중에 전뇌의 표면이 광학 평면에 더 잘 정렬될 수 있도록 합니다.</li>
	<li>자외선(UV) 경화 접착제로 헤드 바를 금속 기둥에 붙입니다. 15초의 UV 노출은 경화에 충분합니다.</li>
	<li>캡슐에서 물고기를 꺼내고 헤드 스테이지를 반 육각형 수조 내의 베이스 플레이트에 고정합니다.</li>
	<li>어항 물에 동물을 담그십시오. 물고기는 호흡을 시작하고 1-2분 이내에 마취에서 회복해야 합니다. 알림: 선택적으로 주사기 관류를 사용하여 입에 신선한 물을 전달합니다.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65526/65526fig02.jpg"> 그림 2: 머리 지지대 수술 중 주요 단계 . (A) 대포 내부의 캡슐 구성. (B) 두개골의 부착 부위(빨간색). 빨간색 화살표는 혈관 부위를 나타냅니다. (C) 상단: 물고기 두개골에 부착된 헤드 바. 아래: 헤드 스테이지에 적재된 물고기. (D) 전뇌 위의 피부를 제거하는 데 필요한 절개. 숫자는 절단 순서를 나타냅니다. 동물의 출혈을 방지하기 위해 표시된 부위(화살촉)에서 피부를 제거하지 마십시오. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65526/65526fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
3. 이광자 이미징
<ol><li>레이저를 켜고 전원이 안정화될 때까지 30분 동안 기다립니다. 샘플에서 파장을 920nm로 설정하고 전력을 약 50mW로 설정합니다. 알림: 공진 스캐너에 의해 제어되는 레이저 빔은 스캔 경로의 턴어라운드 지점에서 천천히 움직입니다. 조직 손상을 방지하기 위해 Pockels 셀을 사용하여 턴어라운드 지점에서 레이저 출력을 줄입니다.</li>
	<li>머리에 고정된 제브라피시가 들어 있는 기록 챔버를 실험 플랫폼에 놓습니다(그림 3A). 플랫폼은 변환 단계의 한계에 도달하지 않고 X 및 Y 방향으로 이동할 수 있어야 합니다.</li>
	<li>대물 렌즈를 전뇌 표면에 최대한 가깝게 배치하십시오. 대물 렌즈는 동공의 앞쪽 가장자리를 향해야 합니다(그림 3B).</li>
	<li>레이저 셔터를 열고 PMT를 활성화합니다. 형광 이미지에서 등쪽 전뇌가 드러날 때까지 대물 렌즈(~1mm)를 점차적으로 올립니다(그림 3C).</li>
	<li>기록되는 뉴런의 수를 늘리려면 피에조 액추에이터를 사용하여 여러 깊이(15μm 간격의 6개 이미지 평면)에서 이미지를 획득합니다. 이렇게 하면 프레임 속도를 희생하는 대신 데이터 수율이 증가합니다. 빠른 Z축 스캐닝을 통해 피에조 액추에이터를 제어할 수 있습니다(균일 모드, 슬라이스 수 = 6, 스텝 크기 = 15μm, 파형 = 톱니, 플라이백 시간 = 4ms, 액추에이터 지연 = 8ms).</li>
	<li>행동 기록을 위해 탱크 양쪽에 있는 810nm 적외선(IR) 조명을 켭니다. 카메라에서 명확하게 보여야 하는 몸 전체를 비추도록 각도를 조정합니다.</li>
	<li>프로젝터를 켭니다.</li>
	<li>데이터 기록을 시작합니다.</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65526/65526fig3v2.jpg"> 그림 3: 칼슘 이미징, 행동 기록 및 시각적 자극 표시를 수행하기 위한 설정. (A) 3개의 프로젝터가 반육각형 탱크의 벽에 시각적 자극을 제공합니다. 측면의 IR 조명은 제브라피쉬의 몸을 비추는 데 사용됩니다. (B) 대물 렌즈의 위치. 왼쪽: 앞 모습. 오른쪽: 측면도. 16x 대물렌즈와 표적 뇌 영역 사이의 거리는 약 2.5mm입니다. (C) 이광자 이미지의 예. 왼쪽: Tg[neuroD:GCaMP6f]에서 전체 등쪽 전뇌의 최대 투영. 오른쪽: 여러 뇌 영역에 걸쳐 있는 뉴런을 보여주는 확대 이미지. 삽입: 다른 뇌 영역에서 더 높은 배율. 이미지는 5Hz에서 기록된 10초 데이터의 평균입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65526/65526fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

제브라피시 전뇌의 행동 추적 및 신경 활동 패턴

<ol>
	<li>Grienberger, C., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+calcium+in+neurons.">Imaging calcium in neurons.</a> Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).</li><li>Chow, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+three-photon+imaging+of+the+brain+in+intact+adult+zebrafish.">Deep three-photon imaging of the brain in intact adult zebrafish.</a> Nature Methods. 17 (6), 605-608 (2020).</li><li>Mittmann, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+calcium+imaging+of+evoked+activity+from+L5+somatosensory+neurons+in+vivo.">Two-photon calcium imaging of evoked activity from L5 somatosensory neurons in vivo.</a> Nature Neuroscience. 14 (8), 1089-1093 (2011).</li><li>Friedrich, R. W., Jacobson, G. A., Zhu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circuit+neuroscience+in+zebrafish.">Circuit neuroscience in zebrafish.</a> Current Biology. 20 (8), R371-R381 (2010).</li><li>Kappel, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+recognition+of+social+signals+by+a+tectothalamic+neural+circuit.">Visual recognition of social signals by a tectothalamic neural circuit.</a> Nature. 608 (7921), 146-152 (2022).</li><li>Bartoszek, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ongoing+habenular+activity+is+driven+by+forebrain+networks+and+modulated+by+olfactory+stimuli.">Ongoing habenular activity is driven by forebrain networks and modulated by olfactory stimuli.</a> Current Biology. 31 (17), 3861-3874 (2021).</li><li>Valente, A., Huang, K. H., Portugues, R., Engert, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ontogeny+of+classical+and+operant+learning+behaviors+in+zebrafish.">Ontogeny of classical and operant learning behaviors in zebrafish.</a> Learning &amp; Memory. 19 (4), 170-177 (2012).</li><li>Buske, C., Gerlai, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+shoaling+behavior+is+accompanied+by+changes+in+the+dopaminergic+and+serotoninergic+systems+in+zebrafish.">Maturation of shoaling behavior is accompanied by changes in the dopaminergic and serotoninergic systems in zebrafish.</a> Developmental Psychobiology. 54 (1), 28-35 (2012).</li><li>Huang, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+virtual+reality+system+to+analyze+neural+activity+and+behavior+in+adult+zebrafish.">A virtual reality system to analyze neural activity and behavior in adult zebrafish.</a> Nature Methods. 17 (3), 343-351 (2020).</li><li>Rupprecht, P., Prendergast, A., Wyart, C., Friedrich, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+z-scanning+with+a+macroscopic+voice+coil+motor+for+fast+3D+multiphoton+laser+scanning+microscopy.">Remote z-scanning with a macroscopic voice coil motor for fast 3D multiphoton laser scanning microscopy.</a> Biomedical Optics Express. 7 (5), 1656-1671 (2016).</li><li>Papadopoulos, I. N., Jouhanneau, J. -. S., Poulet, J. F. A., Judkewitz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scattering+compensation+by+focus+scanning+holographic+aberration+probing+(F-SHARP).">Scattering compensation by focus scanning holographic aberration probing (F-SHARP).</a> Nature Photonics. 11 (2), 116-123 (2017).</li><li>Torigoe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+capable+of+generating+future+state+prediction+error+show+improved+active+avoidance+behavior+in+virtual+reality.">Zebrafish capable of generating future state prediction error show improved active avoidance behavior in virtual reality.</a> Nature Communications. 12 (1), 5712 (2021).</li></ol>

저자는 경쟁하는 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

여기에서는 이광자 칼슘 이미징을 위해 성인 제브라피쉬의 머리를 억제하는 자세한 프로토콜을 설명합니다. 레이저 스캐닝 이미징에 충분히 안정적인 머리 지지대를 얻기 위한 두 가지 중요한 단계가 있습니다. 먼저, 헤드 바를 두개골의 특정 부착 부위에 붙여야 합니다. 두개골의 다른 부분은 종종 너무 얇아서 기계적 안정성을 제공하지 못하며 격렬한 신체 움직임 중에 골절될 수도 있습니다. ?...

유전적으로 인코딩된 지표 또는 합성 염료를 사용한 칼슘 형광 이미징은 인간이 아닌 영장류, 설치류, 조류 및 곤충을 포함한 행동하는 동물의 신경 활동을 측정하는 강력한 방법이었습니다1. 뇌 표면 아래 최대 약 800μm까지 수백 개의 세포 활동을 다광자 이미징 2,3을 사용하여 동시에 측정할 수 있습니다. 특정 세포 유형의 활성은 유전적으로 정의된 신경 세포 집단에서 칼슘 지표를 발현하여 측정할 수도 있습니다. 작은 척추동물 모델에 이미징 방법을 적용하면 뇌 영역 전반에 걸쳐 신경 계산 분야에서 새로운 가능성이 열립니다.
제브라피시는 신경 과학 연구에서 널리 사용되는 모델 시스템입니다. 수정 후 약 6일이 지난 제브라피시 유충은 작은 뇌와 투명한 몸체로 인해 칼슘 이미징에 사용되어 왔다4. 어린 제브라피시(생후 3-4주)는 감각 운동 경로 5,6의 기저에 있는 신경 메커니즘을 연구하는 데에도 사용됩니다. 그러나 연상 학습 및 사회적 행동을 포함한 복잡한 행동에 대한 최대 수행 수준은 7,8세의 나이에 도달합니다. 따라서 이미징 방법을 사용하여 성인 제브라피쉬의 뇌에서 여러 인지 기능을 연구하려면 신뢰할 수 있는 프로토콜이 필요합니다. 제브라피시 유충과 어린 제브라피쉬는 생체 내 이미징을 위해 아가로스에 삽입될 수 있지만, 생후 2개월 이상의 성체 제브라피쉬는 이러한 조건에서 저산소증을 앓고 있으며 신체적으로 너무 강해서 아가로스로 억제할 수 없습니다. 따라서 뇌를 안정시키고 아가미를 통해 동물이 자유롭게 숨을 쉴 수 있도록 하는 수술이 필요합니다.
여기에서는 단일 헤드 바의 새로운 설계와 관련된 머리 지지대 프로토콜에 대해 설명합니다. 25분의 단축된 수술 시간은 이전 방법9보다 두 배 빠릅니다. 또한 기록 챔버(반 육각형 탱크), 헤드 스테이지 및 두 부분을 결합하는 빠른 잠금 메커니즘9의 설계에 대해서도 설명합니다. 마지막으로, 시각적으로 촉발된 뇌 활동과 행동을 연구하기 위해 몰입형 시각적 자극을 제시하는 설정도 설명합니다. 전반적으로, 여기에 설명된 절차는 머리를 고정한 성인 제브라피쉬의 유전적으로 정의된 세포 집단에서 이광자 칼슘 이미징을 수행하는 데 사용할 수 있으며, 이를 통해 다양한 행동 패러다임 동안 뇌 활동을 조사할 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acquisition card</td>
			<td>MBF Bioscience</td>
			<td>Vidrio vDAQ</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Back-projection film</td>
			<td>Kimoto</td>
			<td>Diland screen - GSK</td>
			<td>present visual stimulus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band-pass filter (510/80 nm)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET510/80m</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Base plate for the semi-hexagonal tank</td>
			<td>custom made</td>
			<td>see supplemental files</td>
			<td>recording chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera filter (&#60;875 nm)</td>
			<td>Edmund optics</td>
			<td>#86-106</td>
			<td>Behavior recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera filter (&#62;700 nm)</td>
			<td>Edmund optics</td>
			<td>#43-949</td>
			<td>Behavior recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MVL50M23</td>
			<td>Behavior recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chameleon Vision-S</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Vision-S</td>
			<td>Laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circular plate for the head stage</td>
			<td>custom made</td>
			<td>see supplemental files</td>
			<td>recording chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Controller for piezo actuator</td>
			<td>Physik Instrumente&#160;</td>
			<td>E-665. CR</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Current amplifier</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TIA60</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elitedent Q-6</td>
			<td>Rolence Enterprise</td>
			<td>Q-6</td>
			<td>Surgery: UV lamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission Filter 510/80 nm</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET510/80m</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head bar</td>
			<td>custom made</td>
			<td>see supplemental files</td>
			<td>recording chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infrared light</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>M810L3</td>
			<td>Behavior recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED projector</td>
			<td>AAXA</td>
			<td>P2B LED Pico Projector</td>
			<td>present visual stimulus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moist paper tissue (Kimwipe)</td>
			<td>Kimtech Science</td>
			<td>34155</td>
			<td>Surgery: moist paper tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized XY sample stage</td>
			<td>Zaber</td>
			<td>X-LRM050</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral Density Filters (50% Transmission)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>NE203B</td>
			<td>present visual stimulus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#216;1/2&#34; Post Holder</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>PH1.5V</td>
			<td>Surgery: hollow tube for cannon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#216;1/2&#34; Stainless Steel Optical Post</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>TR150/M</td>
			<td>Surgery: fish loading module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens 16x, 0.8NA</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>CF175</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil-based modeling clay</td>
			<td>Ly Hsin Clay</td>
			<td>C4086</td>
			<td>Surgery: head bar holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical adhesive</td>
			<td>Norland Products</td>
			<td>NOA68</td>
			<td>Surgery: UV curable glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photomultiplier tube</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>H11706P-40</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piezo actuator</td>
			<td>Physik Instrumente&#160;</td>
			<td>P-725.4CA PIFOC</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pockels Cell</td>
			<td>Conoptics</td>
			<td>M350-80-LA-BK-02</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Wratten filter (&#62; 600 nm)</td>
			<td>Edmund optics</td>
			<td>#53-699</td>
			<td>present visual stimulus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resonant-Galvo Scan System</td>
			<td>INSS</td>
			<td>RGE-02</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Right-Angle Clamp for &#216;1/2&#34; Post</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>RA90/M</td>
			<td>Surgery: fish loading module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotating Clamp for &#216;1/2&#34; Post</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>SWC/M</td>
			<td>Surgery: fish loading module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ScanImage</td>
			<td>MBF Bioscience</td>
			<td>Basic version</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semi-hexagonal tank</td>
			<td>custom made</td>
			<td>see supplemental files</td>
			<td>recording chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super-Bond C&#38;B Kit</td>
			<td>Sun Medical Co.</td>
			<td>Super-Bond C&#38;B</td>
			<td>Surgery: dental cement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine methanesulfonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td>Surgery: anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB Camera</td>
			<td>FLIR</td>
			<td>BFS-U3-13Y3M-C</td>
			<td>Behavior recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond</td>
			<td>3M</td>
			<td>1469SB</td>
			<td>Surgery: tissue glue</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

two-photon calcium imaging of forebrain activity in behaving adult zebrafish

성인 제브라피시(Danio rerio)는 인지 기능을 연구하기 위한 다양한 행동 레퍼토리를 보여줍니다. 그들은 또한 광학 이미징 방법을 통해 뇌 영역 전체의 활동을 측정하는 데 사용할 수 있는 소형 뇌를 가지고 있습니다. 그러나 성인 제브라피쉬의 뇌 활동 기록에 대한 보고는 드물었다. 본 연구는 성인 제브라피쉬의 등쪽 전뇌에서 이광자 칼슘 이미징을 수행하는 절차를 설명합니다. 우리는 성인 제브라피시가 머리를 움직이지 못하도록 억제하는 단계에 중점을 두며, 이는 뇌 활동의 레이저 스캐닝 이미징을 가능하게 하는 안정성을 제공합니다. 머리에 묶인 동물은 보조 기구 없이 신체 부위를 자유롭게 움직이고 숨을 쉴 수 있습니다. 이 시술은 머리 구속 수술 시간을 단축하고 뇌 운동을 최소화하며 기록되는 뉴런 수를 최대화하는 것을 목표로 합니다. 칼슘 이미징 중에 몰입형 시각적 환경을 제공하기 위한 설정도 여기에 설명되어 있으며, 이는 시각적으로 트리거된 행동의 기본 신경 상관 관계를 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

Calcium fluorescence imaging with genetically encoded indicators or synthetic dyes has been a powerful method of measuring neuronal activity in behaving animals, including non-human primates, rodents, birds, and insects1. The activity of hundreds of cells, up to approximately 800 &#181;m below the brain surface, can be measured simultaneously using multi-photon imaging2,3. The activity of specific cell types can also be measured by expressing calcium indicators in genetically defined neuronal populations. Application of the imaging method for small vertebrate models opens up new possibilities in the field of neuronal computation across brain regions.
Zebrafish are a widely used model system in neuroscience research. Larval zebrafish at around 6 days post-fertilization have been used for calcium imaging due to their miniature brain and transparent body4. Juvenile zebrafish (3-4 weeks old) are also used for studying the neural mechanisms underlying sensorimotor pathways5,6. However, the maximal performance level for complex behaviors, including associative learning and social behaviors, is reached at an older age7,8. Thus, a reliable protocol is required to study multiple cognitive functions in the brains of adult zebrafish using imaging methods. While zebrafish larva and juvenile zebrafish can be embedded in agarose for in vivo imaging, adult zebrafish at 2 months or older suffer from hypoxia in such conditions and are physically too strong to be restrained by agarose. Therefore, a surgical procedure is required to stabilize the brain and enable the animal to breathe freely through the gills. 
Here, we describe a head restraint protocol that involves a novel design of a single head bar. The reduced surgery time of 25 min is twice as fast as the previous method9. We also describe the design of the recording chamber (semi-hexagonal tank), the head stage and a quick-lock mechanism to combine the two parts9. Finally, the setup to present an immersive visual stimulus to study visually triggered brain activity and behaviors is also described. Overall, the procedures described here can be used to perform two-photon calcium imaging in genetically defined cell populations in a head-restrained adult zebrafish, enabling the investigation of brain activities during various behavioral paradigms.

저자 스포트라이트: 성체 제브라피시 뇌 연구의 발전 

행동하는 성인 제브라피쉬의 전뇌 활동에 대한 Two-Photon Calcium Imaging

The fish fore-brain hosts areas suspected to be homologous to mammalian brain regions involved in complex behavior. These include the hippocampus, the cortex, and the amygdala. We are currently trying to understand the effect of sensory information on the activity of these brain regions.Current research in zebra fish neuroscience uses two photon calcium imaging of immobilized larvae. Combined with virtual reality based behavior essays, to study sensory motor processing in the brain. Most research on the zebra fish brain is done on larvae, however some complex behaviors in fish do not fully develop until adulthood.Our protocol allows the study of brain activity in the adult during behavior. This protocol reduced surgery times by fifty percent compared to the previous method. It's a more efficient approach for restraining the head of adult zebra fish for a better image.This head restraint protocol opened an opportunity to perform an in vivo experiment on the adult zebra fish brain. In addition to the two-photon calcium image, head restraint potentially allows the opto-genetic manipulation, electro-physiology, and even ultra-sound imaging of live fish.

프로토콜은 머리 구속 수술과 전뇌의 신경 활동에 대한 이광자 칼슘 영상의 두 부분으로 구성됩니다. 수술의 성공은 동물의 생존과 머리 지지대의 안정성에 의해 결정됩니다. 수술 중 0.01% TMS 용액을 경구로 자주 관류하면 생존율을 크게 향상시킬 수 있습니다. 물고기는 어항 물에 잠긴 후 1-2분 이내에 마취에서 회복되고 활발하게 숨을 쉬어야 합니다. 2광자 칼슘 이미징을 통해 뇌 표면에서 온전?...

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여기에서는 성인 제브라피쉬의 등쪽 전뇌에서 이광자 칼슘 이미징을 수행하는 프로토콜을 제시합니다.

Adult zebrafish (Danio rerio) exhibit a rich repertoire of behaviors for studying cognitive functions. They also have a miniature brain that can be used ...

물고기의 전뇌는 복잡한 행동에 관여하는 포유류의 뇌 영역과 상동성으로 의심되는 영역을 숙주합니다. 여기에는 해마, 피질, 편도체가 포함됩니다. 우리는 현재 감각 정보가 이러한 뇌 영역의 활동에 미치는 영향을 이해하려고 노력하고 있습니다.제브라 피쉬 신경 과학의 현재 연구는 고정된 유충의 두 광자 칼슘 이미징을 사용합니다. 가상 현실 기반 행동 에세이와 결합하여 뇌의 감각 운동 처리를 연구합니다. 얼룩말 물고기의 뇌에 대한 대부분의 연구는 유충에 대해 수행되지만 물고기의 일부 복잡한 행동은 성충이 될 때까지 완전히 발달하지 않습니다.우리의 프로토콜은 행동 중 성인의 뇌 활동을 연구할 수 있도록 합니다. 이 프로토콜은 이전 방법에 비해 수술 시간을 50% 단축했습니다. 더 나은 이미지를 위해 성인 얼룩말 물고기의 머리를 구속하는 보다 효율적인 접근 방식입니다.이 머리 구속 프로토콜은 성인 얼룩말 물고기 뇌에 대한 생체 내 실험을 수행할 수 있는 기회를 열었습니다. 이광자 칼슘 이미지 외에도 머리 지지대는 잠재적으로 광유전학적 조작, 전기 생리학 및 살아있는 물고기의 초음파 이미징을 가능하게 합니다.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Two-Photon Calcium Imaging of Forebrain Activity in Behaving Adult Zebrafish

1.5K 조회수.  Academia Sinica. 물고기의 전뇌는 복잡한 행동에 관여하는 포유류의 뇌 영역과 상동성으로 의심되는 영역을 숙주합니다. 여기에는 해마, 피질, 편도체가 포함됩니다. 우리는 현재 감각 정보가 이러한 뇌 영역의 활동에 미치는 영향을 이해하려고 노력하고 있습니다.제브라 피쉬 신경 과학의 현재 연구는 고정된 유충의 두 광자 칼슘 이미징을 사용합니다. 가상 현실 기반 행동 에세이와 ?...

비디오: 저자 스포트라이트: 성체 제브라피시 뇌 연구의 발전 

Adult zebrafish (Danio rerio) exhibit a rich repertoire of behaviors for studying cognitive functions. They also have a miniature brain that can be used for measuring activities across brain regions through optical imaging methods. However, reports on the recording of brain activity in behaving adult zebrafish have been scarce. The present study describes procedures to perform two-photon calcium imaging in the dorsal forebrain of adult zebrafish. We focus on steps to restrain adult zebrafish from moving their heads, which provides stability that enables laser scanning imaging of the brain activity. The head-restrained animals can freely move their body parts and breathe without aids. The procedure aims to shorten the time of head restraint surgery, minimize brain motion, and maximize the number of neurons recorded. A setup for presenting an immersive visual environment during calcium imaging is also described here, which can be used to study neural correlates underlying visually triggered behaviors.

Here, we present a protocol to perform two-photon calcium imaging in the dorsal forebrain of adult zebrafish.

연구

신경과학

Preparation of Recording Chamber for Zebrafish Imaging

To begin, prepare a semi-hexagonal tank, a base plate, and a head stage. Place the semi-hexagonal tank on the experimental platform of the microscope. Aim the 810 nanometer infrared light and the camera to the head stage for behavioral recording.Then, set up an 875 nanometer short-pass filter, and a 700 nanometer long-pass filter in front of the camera to prevent the two-photon laser and the visual stimulus from interfering with behavioral recording. To present the visual stimulus, attach back projection films to the inner side of the three walls of the semi-hexagonal tank. Aim the three projectors at the three surfaces of the tank.

제브라피시 이미징을 위한 기록 챔버 준비

Head-Fixation Surgery in Zebrafish

To prepare an omega-shaped head bar for the zebrafish head restraint, attach a piece of oil-based modeling clay to a three-axis micro manipulator. Then insert an arm of the head bar into the clay and orient the head bar horizontally. Prepare the cannon for holding the fish's body in place during surgery.To remove excess skin and water from the skull's attachment sites, prepare four tissue swabs by cutting a paper towel into a three centimeter square. Then fold the paper squares along their diagonal to produce a tube-like structure and twist the ends of the tube into a fine point. After anesthetizing the fish with 0.03%TMS, perform syringe perfusion with 0.01%TMS to maintain sedation throughout the procedure.Wrap the fish in moist paper tissue starting from the tip of the tail to around one millimeter caudal to the gill. Then wrap a soft plastic tubing with a longitudinal slit around the paper tissue covering the fish from the end of the tail to around two millimeter caudal to the gill. Wrap the paper towel around the tubing.Then wrap a soft plastic tube cut from the bulb of a plastic transfer pipette around the paper towel. Load the wrapped fish into the cannon. Next, using a scalpel, remove the skin covering the attachment sites, two triangular areas of the skull rostrolateral to the cerebellum and above the gills.Then use tissue swabs to dry the attachment sites and clear any remaining skin. Using a 10 microliter pipette tip, apply a drop of tissue glue at the center of each attachment site. Place the fish body in an upright position and position the head bar slightly above and caudal to the attachment sites.Next, prepare dental cement by mixing one small spoon of polymer with four drops of quick monomer and one drop of catalyst five. Stir the mixture evenly for 15 seconds. Immediately after mixing, use a micropipette and a 10 microliter pipette tip to apply the cement onto the attachment sites and the region between the sites.Then using a micro manipulator, gently press the head bar onto the cement. Cover the head bar with the remaining cement and wait for 12 minutes to allow the curing of the cement. Next, to improve optical access to the forebrain for calcium imaging, use a scalpel to remove the skin above the telencephalon.After curing, remove the clay from the head bar. Next, prepare a fish loading module for the micro manipulator. Then transfer the entire capsule from the cannon to the pitch adjuster in the fish loading module.Using the micro manipulator, position the fish with the head bar placed on top of the metal posts of the head stage. Slightly increase the pitch angle of the fish. Apply ultraviolet curable glue to secure the head bar to the metal posts.Then pull out the fish from the capsule and lock the head stage onto the base plate within the semi hexagonal tank. After surgery, immerse the animal in fish tank water to recover from anesthesia.

제브라피쉬의 머리 고정 수술

Two-Photon Imaging of Zebrafish Forebrain 

Turn on the laser and wait for 30 minutes for the power to stabilize. Set the wavelength to 920 nanometers and power to approximately 50 milliwatts at the sample. Place the recording chamber with the head-restrained zebrafish on the experimental platform.Position the objective lens close to the forebrain surface. For behavior recording, turn on the 810 nanometer infrared lights on both sides of the tank. Select the input source for VR display and start recording data.Then, open the laser shutter and enable the photo multiplier tube. Gradually elevate the objective lens until the dorsal forebrain is revealed. Use a piezo actuator to acquire images at multiple depths to increase the number of neurons recorded.Two photon calcium imaging records individual neuron activity in the dorsal forebrain up to 200 microns deep through intact skulls. The imaging range includes the paleo areas, Dm, cDc, rDc, and part of the Dl covering 30%of the adult zebrafish forebrain. Simultaneous behavioral recording performed during brain imaging enables the identification of neuronal correlates of motor outputs.During imaging, tail movements should not cause visible motion artifacts.