Çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81960226, 81760223), Yunnan Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (202001AS070045, 202301AY070001-011) ve Yunnan Eyaleti Eğitim Bakanlığı Bilimsel Araştırma Vakfı (2023Y0784) tarafından desteklenmiştir.

Bu araştırma, Kunming Tıp Üniversitesi Hayvan Deneyleri Etik Kurulu'ndan onay almıştır (kmmu20220945). Tüm deneyler belirlenmiş hayvan bakımı kurallarına bağlı kalmıştır. Leptomeningeal lenfatik endotel hücreleri (LLEC'ler), 6-8 haftalık ve 20-25 g ağırlığındaki erkek C57Bl / 6J farelerinden toplandı. Bu fareler, Çin'in Kunming kentindeki Kunming Tıp Üniversitesi'nden temin edildi. Tüm deneysel prosedür sıkı steril koşullar altında gerçekleştirildi. Tüm santrifüj adımları, aksi belirtilmedikçe oda sıcaklığında gerçekleştirilir.
1. Reaktiflerin ve aletlerin hazırlanması
NOT: Çözümleri içeren tüm adımlar, sınıf II biyolojik tehlike kabini içinde gerçekleştirilmelidir.
<ol><li>Fosfat tamponlu salini (PBS) kalsiyum ve magnezyum, %10 fetal sığır serumu (FBS) ve %1 penisilin-streptomisin (P/S) ile karıştırarak yıkama tamponunu hazırlayın (bkz. Bu tamponu 4 °C'de soğuk tutun. Kullanım gününde taze olarak hazırlanması ve tamponun gazının alınması esastır.</li>
	<li>10 mL PBS'yi (kalsiyum ve magnezyum olmadan) 2 mL% 0.25 tripsin, 1 mL 20 mg / mL papain ve 200 μL 1 mg / mL kollajenaz I ile birleştirerek sindirim enzimlerini hazırlayın (bkz. NOT: Tekrarlanan donma-çözülme döngülerini önlemek için uygun hacimlerde alikotların kullanıldığından emin olun. Bu alikotları -20 °C'de saklayın.</li>
	<li>VEGF-C (100 ng/mL) ve %1 P/S içeren, ticari olarak temin edilebilen endotel hücre büyüme ortamı kitini kullanarak kültür ortamını hazırlayın (bkz.</li>
	<li>Sindirim sürecini durdurmak için Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle's besiyerini (DMEM) %10 FBS ile destekleyerek durdurma tamponunu hazırlayın.</li>
	<li>Steril cerrahi aletler hazırlayın: Bu aletler makas, tırtıklı uçlu cımbız ve ince uçlu cımbız içermelidir.</li>
</ol>2. Şişe kaplaması
<ol><li>T25 şişesini 100 μg/mL fibronektin çözeltisi ile kaplayın ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve gece boyunca 37 °C'de inkübe edin. Kullanmadan önce, bir pipet kullanarak kaplama solüsyonunu çıkarın.</li>
	<li>Şişeyi PBS ile üç kez yıkayın, ardından PBS'yi aspire edin ve T25 şişesinin kurumasını bekleyin.</li>
</ol>3. Leptomeninges ayrışması
NOT: Daima 4 °C'de önceden soğutulmuş tamponlar ve çözeltiler kullanın.
<ol><li>Fareleri% 4 izofluran soluyarak uyuşturun ve daha sonra% 70 etanol ile temizlenmiş makas kullanarak hızlı dekapitasyon ile kurban edin.</li>
	<li>Kafatasının arkasındaki açıklıktan başlayarak ve ön bölgeye doğru uzanan cildi orta hat boyunca dikkatlice kesin.</li>
	<li>Kafatasını nazikçe çıkarın, leptomeninglere zarar vermemek için makasla hafifçe kaldırın ve leptomeningler de dahil olmak üzere tüm beynin elde edilmesini sağlayın.</li>
	<li>Tüm beyni bir yıkama tamponuna batırın ve yüzeydeki kanı çıkarmak için hafifçe yıkayın.</li>
	<li>Beyni doğramadan steril bir Petri kabına aktarın ve mikroskop altında ince uçlu cımbız kullanarak leptomeningleri beyin yüzeyinden çıkarın.</li>
	<li>Leptomeninges dokusunu steril mikro makas kullanarak parçalara ayırın.</li>
</ol>4. Leptomeninges enzimatik sindirim
<ol><li>Parçalara 10 mL enzim karışımı (adım 1.2) ekleyin ve 37 ° C'de 15 dakika inkübe edin. Parçaların tüpün altından ayrıldığından emin olmak için hafifçe çalkalayın. Daha sonra, sindirimi durdurmak için 10 mL durdurma tamponu (adım 1.4) ekleyin.</li>
	<li>4 °C'de 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin ve bir pipet kullanarak süpernatanı dikkatlice çıkarın.</li>
	<li>10 mL soğuk PBS ekleyin ve herhangi bir topaklanmayı filtrelemek için karışımı 70 μm'lik bir süzgeçten 50 mL'lik steril bir tüpe geçirin.</li>
</ol>5. Hücre genişlemesi
<ol><li>Plaka 1 x 10 cmbaşına 5 hücre2 5 mL kültür ortamı ile fibronektin kaplı bir T25 şişesine (adım 2).</li>
	<li>Hücreleri 37 °C'de %5 CO2 ile 24 saat inkübe edin. Daha sonra, bağlı olmayan hücreleri ortadan kaldırmak için ortamı çıkarın.</li>
	<li>Her iki günde bir ortamın %50'sini değiştirerek kültürü sürdürün. Bu işlemi iki veya üç kez tekrarlayın.</li>
</ol>6. Manyetik hücre seçimi
NOT: Hızlı çalışın, hücre soğukluğunu koruyun ve spesifik olmayan hücre etiketlemesini önlemek için önceden soğutulmuş solüsyonlar kullanın.
<ol><li>Aletlerin ve reaktiflerin hazırlanması: manyetik bir ayırıcı standına manyetik bir ayırıcı takın (bkz. Malzeme Tablosu). Manyetik ayırıcıya bir seçim sütunu bağlayın ve seçim sütununun üzerine 70 μm'lik bir hücre süzgeci yerleştirin. Akışı toplamak için seçim sütununun altına 50 mL'lik bir tüp yerleştirin.</li>
	<li>Enzimatik sindirim: Hücreler %80 birleşmeye ulaştığında, ortamı aspire edin ve hücreleri PBS ile durulayın. Yapışan hücreleri ayırmak için% 0.25 tripsin ekleyin ve 37 ° C'de 5 dakika inkübe edin. Durdurma tamponunu ekleyerek sindirimi durdurun. Hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın.</li>
	<li>Antikor inkübasyonu: 100 μL PBS'de 1 x10 7 toplam hücreyi yeniden süspanse edin ve 10 μL LYVE-1 antikoru ekleyin (bkz. İyice karıştırın ve karanlıkta 4 °C'de 30 dakika inkübe edin.<ol><li>Hücreleri 5 dakika boyunca 300 x g'da döndürün ve süpernatanı atın. 1 mL PBS ekleyerek ve 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyerek hücreleri durulayın. Süpernatanı tamamen çıkarın.</li>
	</ol></li>
	<li>Mikro boncuk etiketleme: hücreleri 100 μL PBS'de yeniden süspanse edin ve 20 μL Mikro boncuk ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız). İyice karıştırın ve karanlıkta 4 °C'de 30 dakika inkübe edin.<ol><li>Hücreleri 5 dakika boyunca 300 x g'da döndürün ve süpernatanı boşaltın. Daha sonra, hücreleri 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleme yoluyla 1 mL PBS ile temizleyin. Son olarak, süpernatanı tamamen çıkarın.</li>
	</ol></li>
	<li>Manyetik negatif dışlama: hücreleri 4 mL PBS'de yeniden süspanse edin. Kümeleri ortadan kaldırmak için hücreleri 70 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirin. Seçim sütununu (Malzeme Tablosuna bakın) 3 mL PBS ile durulayarak hazırlayın, ardından hücre süspansiyonunu seçim sütununa uygulayın.<ol><li>3 mL PBS ile yıkama adımlarını gerçekleştirin ve LYVE-1-negatif hücreleri, geçmelerine izin vermek için seçim sütununun altına yerleştirilmiş 50 mL'lik bir tüpe toplayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Manyetik pozitif seçim: Seçim sütununa 6 mL PBS pipetleyin. LYVE-1 pozitif LLEC'ler elde etmek için pistonu seçim sütununa sıkıca iterek manyetik olarak etiketlenmiş hücreleri anında temizleyin. NOT: Bir sonraki adıma geçmeden önce her zaman seçim sütunu haznesinin boşalmasını bekleyin.</li>
</ol>7. LLEC kültürü
<ol><li>LYVE-1-pozitif LLEC'leri 300 x g'de 5 dakika santrifüjleyin ve ardından süpernatanı dikkatlice çıkarın.</li>
	<li>Plaka 1 x 10cm başına 5 hücre2 5 mL kültür ortamı ile fibronektin kaplı bir T25 şişesine.</li>
	<li>Ortamın %50'sini her gün değiştirerek kültürü koruyun. Hücreler% 80 birleşmeye ulaştığında,% 0.25 tripsin ile hücreleri ayırın ve hücre geçişini gerçekleştirin. Hücreleri 2-3 geçişten sonra sonraki deneyler için kullanın.</li>
</ol>8. Akış sitometrik analizi
NOT: Flow sitometrik analizi, daha önce açıklanan prosedür15 izlenerek gerçekleştirilmiştir.
<ol><li>Yapışan hücreleri ayırmak için% 0.25 tripsin ekleyin ve 37 ° C'de 5 dakika inkübe edin. Ardından, sindirimi durdurmak için durdurma tamponunu ekleyin.</li>
	<li>Hücreleri 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı tamamen aspire edin. 100 μL PBS'de 1 x10 6 hücreyi yeniden süspanse edin.</li>
	<li>1 μL LYVE-1 antikoru ekleyin. İyice karıştırın ve oda sıcaklığında karanlıkta 10 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Akış sitometrisi ve FlowJo yazılımı kullanılarak analiz için hücreleri uygun miktarda PBS tamponunda yeniden süspanse edin (bkz. Malzeme Tablosu).</li>
</ol>9. İmmünofloresan boyama
NOT: İmmünofloresan boyama, daha önce açıklanan prosedür izlenerek gerçekleştirilmiştir16.
<ol><li>Hücreleri PBS ile üç kez yıkayın. Hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca %4 paraformaldehit (PFA) ile sabitleyin. PFA'yı atın ve hücreleri PBS ile üç kez yıkayın.</li>
	<li>Blok tamponunu oda sıcaklığında 1 saat uygulayın. Blok tamponunu lamellerden çıkarın.</li>
	<li>Boyama tamponundaki LYVE-1 antikorunu hücrelere ekleyin ve karanlıkta inkübe edin. Hücreleri PBS ile üç kez yıkayın.</li>
	<li>Boyama tamponuna uygun bir ikincil antikor ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız) hücrelere ve karanlıkta inkübe edin. Hücreleri PBS ile üç kez yıkayın.</li>
	<li>4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ile karşı boyama. Hücreler artık immünofloresan mikroskobu için hazırdır.</li>
</ol>

Manyetik Hücre Seçimi Kullanılarak İn Vitro LLEC Kültürlerinin Oluşturulması

<ol>
	<li>Shibata-Germanos, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+conservation+of+non-lumenized+lymphatic+endothelial+cells+in+the+mammalian+leptomeninges.">Structural and functional conservation of non-lumenized lymphatic endothelial cells in the mammalian leptomeninges.</a> Acta Neuropathologica. 139 (2), 383-401 (2020).</li><li>Su&#225;rez, I., Schulte-Merker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+with+many+talents:+lymphatic+endothelial+cells+in+the+brain+meninges.">Cells with many talents: lymphatic endothelial cells in the brain meninges.</a> Cells. 10 (4), 799 (2021).</li><li>Jordan-Williams, K. L., Ruddell, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+purifies+murine+lymph+node+lymphatic+endothelium.">Culturing purifies murine lymph node lymphatic endothelium.</a> Lymphatic Research and Biology. 12 (3), 144-149 (2014).</li><li>Jones, B. E., Yong, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+characterization+of+bovine+mesenteric+lymphatic+endothelium.">Culture and characterization of bovine mesenteric lymphatic endothelium.</a> In vitro Cellular &amp; Developmental Biology. 23 (10), 698-706 (1987).</li><li>Podgrabinska, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+lymphatic+endothelial+cells.">Molecular characterization of lymphatic endothelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (25), 16069-16074 (2002).</li><li>Jablon, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+short-term+culturing+of+primary+lymphatic+endothelial+cells+from+collecting+lymphatics:+A+techniques+study.">Isolation and short-term culturing of primary lymphatic endothelial cells from collecting lymphatics: A techniques study.</a> Microcirculation. 30 (2-3), e12778 (2023).</li><li>Lapinski, P. E., King, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+mouse+lymphatic+endothelial+cells+from+lung+tissue.">Isolation and culture of mouse lymphatic endothelial cells from lung tissue.</a> Methods in Molecular Biology. 2319, 69-75 (2021).</li><li>Lokmic, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+Identification,+and+culture+of+human+lymphatic+endothelial+cells.">Isolation, Identification, and culture of human lymphatic endothelial cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1430, 77-90 (2016).</li><li>Thiele, W., Rothley, M., Schmaus, A., Plaumann, D., Sleeman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry-based+isolation+of+dermal+lymphatic+endothelial+cells+from+newborn+rats.">Flow cytometry-based isolation of dermal lymphatic endothelial cells from newborn rats.</a> Lymphology. 47 (4), 177-186 (2014).</li><li>Lokmic, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+human+lymphatic+endothelial+cells+by+multi-parameter+fluorescence-activated+cell+sorting.">Isolation of human lymphatic endothelial cells by multi-parameter fluorescence-activated cell sorting.</a> Journal of Visualized Experiments. 99, e52691 (2015).</li><li>Janson, C., Romanova, L., Hansen, E., Hubel, A., Lam, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalization+and+functional+characterization+of+rat+arachnoid+cell+lines.">Immortalization and functional characterization of rat arachnoid cell lines.</a> Neuroscience. 177, 23-34 (2011).</li><li>Romanova, L. G., Hansen, E. A., Lam, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+preliminary+characterization+of+immortalized+cell+line+derived+from+rat+lymphatic+capillaries.">Generation and preliminary characterization of immortalized cell line derived from rat lymphatic capillaries.</a> Microcirculation. 21 (6), 551-561 (2014).</li><li>Park, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Routine+culture+and+study+of+adult+human+brain+cells+from+neurosurgical+specimens.">Routine culture and study of adult human brain cells from neurosurgical specimens.</a> Nature Protocols. 17 (2), 190-221 (2022).</li><li>Okuda, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=lyve1+expression+reveals+novel+lymphatic+vessels+and+new+mechanisms+for+lymphatic+vessel+development+in+zebrafish.">lyve1 expression reveals novel lymphatic vessels and new mechanisms for lymphatic vessel development in zebrafish.</a> Development. 139 (13), 2381-2391 (2012).</li><li>Bokobza, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+Isolation+of+microglial+cells+from+neonate+mouse+for+primary+cell+cultures.">Magnetic Isolation of microglial cells from neonate mouse for primary cell cultures.</a> Journal of Visualized Experiments. 185, e62964 (2022).</li><li>Wang, J. M., Chen, A. F., Zhang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+primary+culture+of+mouse+aortic+endothelial+cells.">Isolation and primary culture of mouse aortic endothelial cells.</a> Journal of Visualized Experiments. 118, e52965 (2016).</li><li>Breiteneder-Geleff, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiosarcomas+express+mixed+endothelial+phenotypes+of+blood+and+lymphatic+capillaries:+podoplanin+as+a+specific+marker+for+lymphatic+endothelium.">Angiosarcomas express mixed endothelial phenotypes of blood and lymphatic capillaries: podoplanin as a specific marker for lymphatic endothelium.</a> The American Journal of Pathology. 154 (2), 385-394 (1999).</li><li>Petrova, T. V., Koh, G. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-specific+lymphatic+vasculature:+From+development+to+pathophysiology.">Organ-specific lymphatic vasculature: From development to pathophysiology.</a> The Journal of Experimental Medicine. 215 (1), 35-49 (2018).</li><li>Wilting, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+Prox1+is+a+marker+for+lymphatic+endothelial+cells+in+normal+and+diseased+human+tissues.">The transcription factor Prox1 is a marker for lymphatic endothelial cells in normal and diseased human tissues.</a> The FASEB Journal. 16 (10), 1271-1273 (2002).</li><li>Yin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatic+endothelial+heparan+sulfate+deficiency+results+in+altered+growth+responses+to+vascular+endothelial+growth+factor-C+(VEGF-C).">Lymphatic endothelial heparan sulfate deficiency results in altered growth responses to vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C).</a> The Journal of Biological Chemistry. 286 (17), 14952-14962 (2011).</li><li>DeSisto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomic+analyses+of+the+developing+meninges+reveal+meningeal+fibroblast+diversity+and+function.">Single-cell transcriptomic analyses of the developing meninges reveal meningeal fibroblast diversity and function.</a> Developmental Cell. 54 (1), 43-59 (2020).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+eliminating+fibroblast+contamination+in+mouse+and+human+primary+corneal+epithelial+cell+cultures.">A method for eliminating fibroblast contamination in mouse and human primary corneal epithelial cell cultures.</a> Current Eye Research. , 1-11 (2023).</li><li>Starzonek, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+of+human+dermal+stem+cells+from+primary+cell+cultures+through+the+elimination+of+fibroblasts.">Enrichment of human dermal stem cells from primary cell cultures through the elimination of fibroblasts.</a> Cells. 12 (6), 949 (2023).</li><li>Lam, C. H., Romanova, L., Hubel, A., Janson, C., Hansen, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+fibroblast+on+the+arachnoid+leptomeningeal+cells+in+vitro.">The influence of fibroblast on the arachnoid leptomeningeal cells in vitro.</a> Brain Research. 1657, 109-119 (2017).</li></ol>

Yazarlar, ifşa edecek herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

LLEC'lerin in vitro olarak toplanması ve kültürlenmesi için mevcut protokol daha önce rapor edilmemiştir. Bu çalışma, fare leptomeninglerinden LLEC'lerin toplanması ve kültürlenmesi için tekrarlanabilir, çok prosedürlü bir protokol sunmaktadır.
Bu çok prosedürlü protokol tekrarlanabilir olsa da, birkaç önemli husus vardır. Örneğin, fibronektin kaplı T25 şişeleri, LLEC'lerin yapışmasını teşvik eder ve yapışmayan hücreleri ortadan kaldırarak işlev g...

Yeni keşfedilen leptomeningeal lenfatik endotel hücreleri (LLEC'ler), periferik lenfatik endotel hücrelerine kıyasla farklı bir dağılım modeli sergileyerek, leptomeningler içindeki tek tek hücrelerin bir ağını oluşturur 1,2. LLEC'lerle ilişkili hücresel fonksiyonlar ve klinik çıkarımlar büyük ölçüde keşfedilmemiş bir alan olarak kalmaktadır. LLEC'ler üzerinde fonksiyonel araştırmaların önünü açmak için, çalışmaları için bir in vitro model oluşturmak zorunludur. Bu nedenle, bu çalışma LLEC'lerin izolasyonu ve birincil kültürü için kapsamlı bir protokol geliştirmiştir.
Fareler, hastalık araştırmalarında genetik manipülasyona uygunlukları nedeniyle tercih edilen hayvan modelidir. Önceki çalışmalar, lenf düğümleri3, mezenterik doku4, dermal doku5, toplayıcı lenfatikler6 ve akciğer dokusu7 dahil olmak üzere çeşitli fare dokularından lenfatik endotel hücrelerini başarıyla izole etmiştir. Bu izolasyon prosedürleri öncelikle manyetik ile aktive edilen hücre sınıflandırması (MACS) ve akış sitometrisi sınıflandırması 8,9,10 gibi tekniklere dayanmaktadır. Ek olarak, araştırma çabaları, sıçan araknoid hücre hatlarının ve sıçan lenfatik kılcal hücre hatlarının kurulmasına yol açmıştır11,12. Leptomeninges13 için eksplant kültür tekniklerinin varlığına rağmen, LLEC'lerin izolasyonu ve kültürü için standart bir protokole acil ihtiyaç vardır. Sonuç olarak, bu çalışma, bir mikroskop rehberliğinde leptomeningleri titizlikle ayrıştırarak ve vasküler endotelyal büyüme faktörü-C (VEGF-C) kullanarak LLEC'lerin genişlemesini teşvik ederek LLEC'leri başarıyla hasat etmiş ve kültürlemiştir. Lenfatik endotel hücreleri için ayırt edici belirteç lenfatik damar hyaluronik reseptörü-1'dir (LYVE-1)14. Bu çok adımlı protokol, MACS kullanarak LYVE-1 pozitif LLEC'leri seçici olarak izole eder ve ardından akış sitometrik analizi ve immünofloresan boyama yoluyla saflıklarını doğrular.
Bu çok adımlı protokolün birincil adımları şu şekilde özetlenebilir: şişe kaplama, leptomeninglerin ayrışması, leptomeninglerin enzimatik sindirimi, hücre genişlemesi, manyetik hücre seçimi ve müteakip LLEC kültürü. Son olarak, izole edilen LLEC'lerin saflığı, akış sitometrik analizi ve immünofloresan boyama ile doğrulanır. Bu çalışmanın genel amacı, LLEC'lerin fare leptomeninglerinden izolasyonu ve sonraki in vitro kültürleri için tekrarlanabilir, çok adımlı bir protokol sunmaktır. Bu protokol, LLEC'lerin hücresel fonksiyonları ve klinik etkileri ile ilgili araştırmaları büyük ölçüde kolaylaştırmaya hazırdır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Block buffer</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0102</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase I</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>C8140</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0131</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>11995</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>D1041</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-2 MV Bullet Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>C-3202</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>S9010</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>F8180&#160;</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo Software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>V10.8.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LYVE-1 antibody</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-0443-82</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic separator</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td>Sterile before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic separator stand</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td>Sterile before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbeads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-048-801</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P/S</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1400</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G8430-25g</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>D1040</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDPN antibody</td>
			<td>Santa</td>
			<td>sc-53533</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1110</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PROX1 antibody</td>
			<td>Santa</td>
			<td>sc-81983</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selection column&#160;</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>Sterile before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200072</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGF-C&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab51947</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGFR-3 antibody</td>
			<td>Santa</td>
			<td>sc-514825</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;4 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

harvest and primary culture of leptomeningeal lymphatic endothelial cells

Leptomeningeal lenfatik endotel hücreleri (LLEC'ler), periferik lenfatik endotel hücrelerinden açıkça farklı bir dağılıma sahip, yakın zamanda keşfedilen bir intrakraniyal hücresel popülasyondur. Hücresel fonksiyonları ve klinik etkileri büyük ölçüde bilinmemektedir. Sonuç olarak, in vitro fonksiyonel araştırma yapmak için bir LLEC arzının mevcudiyeti esastır. Bununla birlikte, şu anda LLEC'lerin in vitro olarak hasat edilmesi ve kültürlenmesi için mevcut bir protokol bulunmamaktadır.
Bu çalışma, şişenin fibronektin ile kaplanmasını, leptomeninglerin mikroskop yardımıyla diseke edilmesini, tek hücreli bir süspansiyon hazırlamak için leptomeninglerin enzimatik olarak sindirilmesini, LLEC'lerin vasküler endotelyal büyüme faktörü-C (VEGF-C) ile genişlemesini indüklemeyi ve manyetik olarak aktive edilen hücre sıralaması (MACS) yoluyla lenfatik damar hyaluronik reseptör-1 (LYVE-1) pozitif hücrelerin seçilmesini içeren çok aşamalı bir protokol kullanarak LLEC'leri başarıyla topladı. Bu süreç nihayetinde birincil bir kültürün kurulmasına yol açtı. LLEC'lerin saflığı, immünofloresan boyama ve akış sitometrik analizi ile doğrulandı ve saflık seviyesi %95'i aştı. Bu çok adımlı protokol, LLEC'lerin hücresel fonksiyonunun ve klinik etkilerinin araştırılmasını büyük ölçüde kolaylaştıracak tekrarlanabilirlik ve fizibilite göstermiştir.

The newly discovered leptomeningeal lymphatic endothelial cells (LLECs) form a meshwork of individual cells within the leptomeninges, exhibiting a distinct distribution pattern when compared to peripheral lymphatic endothelial cells1,2. The cellular functions and clinical implications associated with LLECs remain largely uncharted territory. In order to pave the way for functional research on LLECs, it is imperative to establish an in vitro model for their study. Therefore, this study has devised a comprehensive protocol for the isolation and primary culture of LLECs.
Mice are the preferred animal model due to their suitability for genetic manipulation in disease research. Previous studies have successfully isolated lymphatic endothelial cells from various mouse tissues, including lymph nodes3, mesenteric tissue4, dermal tissue5, collecting lymphatics6, and lung tissue7. These isolation procedures have primarily relied on techniques such as magnetic-activated cell sorting (MACS) and flow cytometry sorting8,9,10. Additionally, research efforts have led to the establishment of rat arachnoid cell lines and rat lymphatic capillary cell lines11,12. Despite the existence of explant culture techniques for leptomeninges13, there exists an urgent need for a standardized protocol for the isolation and culture of LLECs. Consequently, this study has successfully harvested and cultured LLECs by meticulously dissociating leptomeninges under the guidance of a microscope and promoting LLECs expansion through the use of vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C). The distinctive marker for lymphatic endothelial cells is lymphatic vessel hyaluronic receptor-1 (LYVE-1)14. This multi-step protocol selectively isolates LYVE-1-positive LLECs using MACS and subsequently verifies their purity through flow cytometric analysis and immunofluorescent staining.
The primary steps of this multi-step protocol can be summarized as follows: flask coating, dissociation of leptomeninges, enzymatic digestion of leptomeninges, cell expansion, magnetic cell selection, and subsequent culture of LLECs. Finally, the purity of the isolated LLECs is confirmed through flow cytometric analysis and immunofluorescent staining. The overarching aim of this study is to present a reproducible, multi-step protocol for the isolation of LLECs from mouse leptomeninges and their subsequent in vitro culture. This protocol is poised to greatly facilitate investigations into the cellular functions and clinical implications of LLECs.

Yazar Gündemi: Leptomeningeal Lenfatik Endotel Hücrelerinin Hücresel Fonksiyonlarının ve Potansiyel Klinik Etkilerinin Ortaya Çıkarılması 

Leptomeningeal Lenfatik Endotel Hücrelerinin Hasadı ve Primer Kültürü

This protocol is designed for areas of by other researchers only interested where established the multi procedure to and cultural primary areas Our protocol ultimately led to the establishment of our primary culture of area CS with a purity level exceeding 95%There is currently no existing protocol for harvesting and culturing Our results paved the way for further investigating the similar function of LLECS in virtual. At RUC, our recent discovery intracranial cellular population, the biological significance of RUC We will conduct further research on the cellular function and review its clinical implication.

Bu çalışma, farelerden lenfatik endotel hücrelerinin (LLEC'ler) toplanması ve daha sonra birincil kültürlerinin in vitro olarak oluşturulması için tekrarlanabilir, çok aşamalı bir protokol sunmaktadır. Anahtar adımlar, şişe hazırlama ve fibronektin kaplama, leptomeninglerin ayrışması, enzimatik sindirim yoluyla tek hücreli bir süspansiyon elde edilmesi ve VEGF-C ile LLEC'lerin genişlemesinin indüklenmesini içerir. LYVE-1 pozitif LLEC'ler daha sonra manyetik olarak aktive edilen hücre s...

Watch this Scientific Journal Video about Unveiling Cellular Functions and Potential Clinical Implications of Leptomeningeal Lymphatic Endothelial Cells at JoVE.com

Yakın zamanda tanımlanmış bir intrakraniyal hücre tipi olan leptomeningeal lenfatik endotel hücreleri (LLEC'ler), işlevleri tam olarak anlaşılamamıştır. Bu çalışma, farelerden LLEC'lerin toplanması ve in vitro birincil kültürlerin oluşturulması için tekrarlanabilir bir protokol sunmaktadır. Bu protokol, araştırmacıların LLEC'lerin hücresel fonksiyonlarını ve potansiyel klinik etkilerini araştırmalarını sağlamak için tasarlanmıştır.

Leptomeningeal lymphatic endothelial cells (LLECs) are a recently discovered intracranial cellular population with a unique distribution clearly distinct ...

Bu protokol, yalnızca çoklu prosedür ve kültürel birincil alanların kurulduğu diğer araştırmacılar tarafından alanlar için tasarlanmıştır Protokolümüz nihayetinde %95'i aşan bir saflık seviyesine sahip birincil alan CS kültürümüzün kurulmasına yol açtı Şu anda hasat ve kültür için mevcut bir protokol yok Sonuçlarımız, LLECS'nin sanal olarak benzer işlevinin daha fazla araştırılmasının yolunu açtı. RUC'ta, son keşfimiz intrakraniyal hücresel popülasyon, RUC'nin biyolojik önemi Hücresel fonksiyon hakkında daha fazla araştırma yapacağız ve klinik sonuçlarını gözden geçireceğiz.

harvest-primary-culture-leptomeningeal-lymphatic-endothelial

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Harvest and Primary Culture of Leptomeningeal Lymphatic Endothelial Cells

871 Görüntüleme.  The First Affiliated Hospital of Kunming Medical University. Bu protokol, yalnızca çoklu prosedür ve kültürel birincil alanların kurulduğu diğer araştırmacılar tarafından alanlar için tasarlanmıştır Protokolümüz nihayetinde %95'i aşan bir saflık seviyesine sahip birincil alan CS kültürümüzün kurulmasına yol açtı Şu anda hasat ve kültür için mevcut bir protokol yok Sonuçlarımız, LLECS'nin sanal olarak benzer işlevinin daha fazla araştırılmasının yolunu açtı. RUC'ta, son keşfimiz intrakraniyal hücresel popüla...

Video: Yazar Gündemi: Leptomeningeal Lenfatik Endotel Hücrelerinin Hücresel Fonksiyonlarının ve Potansiyel Klinik Etkilerinin Ortaya Çıkarılması 

Leptomeningeal lymphatic endothelial cells (LLECs) are a recently discovered intracranial cellular population with a unique distribution clearly distinct from peripheral lymphatic endothelial cells. Their cellular function and clinical implications remain largely unknown. Consequently, the availability of a supply of LLECs is essential for conducting functional research in vitro. However, there is currently no existing protocol for harvesting and culturing LLECs in vitro.
This study successfully harvested LLECs using a multi-step protocol, which included coating the flask with fibronectin, dissecting the leptomeninges with the assistance of a microscope, enzymatically digesting the leptomeninges to prepare a single-cell suspension, inducing the expansion of LLECs with vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C), and selecting lymphatic vessel hyaluronic receptor-1 (LYVE-1) positive cells through magnetic-activated cell sorting (MACS). This process ultimately led to the establishment of a primary culture. The purity of the LLECs was confirmed through immunofluorescence staining and flow cytometric analysis, with a purity level exceeding 95%. This multi-step protocol has demonstrated reproducibility and feasibility, which will greatly facilitate the exploration of the cellular function and clinical implications of LLECs.

Leptomeningeal lymphatic endothelial cells (LLECs), a recently identified intracranial cell type, have poorly understood functions. This study presents a reproducible protocol for harvesting LLECs from mice and establishing in vitro primary cultures. This protocol is designed to enable researchers to delve into the cellular functions and potential clinical implications of LLECs.

Nörobilim

Mouse Leptomeninges Dissociation and Enzymatic Digestion for Efficient Culturing of Leptomeningeal Cells

To begin, carefully incise the skin of the sacrificed mouse, starting from the skull's opening and extending towards the frontal area. Using scissors, delicately lift and remove the skull without damaging the leptomeninges, collecting the entire brain. Submerge the whole brain in the washing buffer, and gently flush it to remove surface blood.Transfer the brain into a sterile Petri dish without chopping. Then, under a microscope, use fine-point tweezers to extract the leptomeninges from the brain's surface. Using sterile microscissors, cut the leptomeninges tissue into fragments.Repair the digestive enzyme mix using the given components. Add 10 milliliters of mix to the fragments and incubate at 37 degrees Celsius for 15 minutes. Gently agitate to detach the fragments from the bottom of the tube.Then, add 10 milliliters of stopping buffer. Centrifuge the suspension at 300 g for five minutes at four degrees Celsius. And using a pipette, carefully remove the supernatant.Add 10 milliliters of cold PBS, and filter any clumps through a 70 micron strainer into a sterile 50 milliliter tube. Plate 10 to the fifth cells per square centimeter into a fibronectin-coated T25 flask with five milliliters of culture medium, and incubate at 37 degrees Celsius with 5%carbon dioxide for 24 hours. After incubation, replace the medium with a fresh medium to eliminate non-attached cells.

Leptomeningeal Hücrelerin Verimli Kültürü için Fare Leptomeninges Dissosiyasyonu ve Enzimatik Sindirim

Establishing Primary In Vitro Culture of Leptomeningeal Lymphatic Endothelial Cells (LLECs)

Begin by attaching a magnetic separator to its stand. Connect a selection column to the magnetic separator and place a 70 micron cell strainer on top of the selection column. Place a 50 milliliter tube beneath the selection column to collect the flow.Once the mouse brain cells reach 80%confluency, aspirate the medium and rinse the cells with PBS. Add 0.25%trypsin to detach the adherence cells and incubate at 37 degrees Celsius for five minutes. Then add a stopping buffer.Centrifuge the cell suspension at 300 G for five minutes, and remove the supernatant. For antibody staining, resuspend 10 to the seven cells in 100 microliters of PBS. Then add 10 microliters of LYVE-1 antibody solution and mix thoroughly.Incubate the mixture for 30 minutes in the dark at four degrees Celsius. After incubation, centrifuge the cells and discard the supernatant. Then rinse the cells by adding one milliliter of PBS and centrifuging at 300 G for five minutes.For microbead labeling, resuspend the pellet in 100 microliters of PBS and 20 microliters of microbeads. Make swell and incubate for 30 minutes in the dark at four degrees Celsius. Then centrifuge the suspension and wash the pellet with one milliliter of PBS.Again, centrifuge and resuspend the pellet in four milliliters of PBS for magnetic negative exclusion. Pass the cell suspension through a 70 micron strainer to eliminate clumps. Prepare the selection column by rinsing it with three milliliters of PBS.Then add cell suspension into the selection column. Wash the column with three milliliters of PBS and collect LYVE-1 negative cells into a 50 milliliter tube. For magnetic positive selection, pipette six milliliters of PBS into the selection column.Then flush the magnetically labeled cells by firmly pushing the plunger into the selection column to obtain LYVE-1 positive LLECs. Next, centrifuge the positive cell suspension and remove the supernatant. Plate 10 to the fifth cells per square centimeter into a T25 flask with five milliliters of culture medium.Maintain the culture by replacing 50%of the medium every alternate day. When the cells reach 80%confluency, detach them as demonstrated previously before performing cell passage. Flow cytometry analysis revealed that the percentage of LYVE-1 positive cells in passage two was not significantly different from passage three after MACS, indicating a purity greater than 95%Immunofluorescent staining confirmed co-staining of LYVE-1 with PDPN, VEGFR-3 and PROX1, establishing the identity of LLECs.LYVE-1 positive cells did not express F48 and platelet derived growth factor beta, effectively distinguishing LLECs from macrophages and fibroblasts. Leptomeningeal cells before MACS displayed heterogeneous morphology ranging from round spheres to fused fiber shapes. However, post MACS, LLECs exhibited typical endothelial-like features such as spindle and cobblestone shapes.